Name: evaluation of antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces in vitro
Uploaded: 2023-04-21T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro at JoVE.com

Die Autoren bedanken sich für die finanzielle Unterstützung durch die U.S. National Science Foundation (NSF CBET Award 1512764 und NSF PIRE 1545852), die National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), das Regents Faculty Development Fellowship der University of California (UC), das Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) und das UC-Riverside Graduate Research Mentorship Program Grant, das Patricia Holt-Torres verliehen wurde. Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung durch die Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) an der UC-Riverside für den Einsatz von REM/EDS und Dr. Perry Cheung für den Einsatz von XRD. Die Autoren bedanken sich auch bei Morgan Elizabeth Nator und Samhitha Tumkur für ihre Unterstützung bei den Experimenten und Datenanalysen. Alle Meinungen, Erkenntnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Artikel geäußert werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation oder der National Institutes of Health wider.

Um die direkten Kokultur- und Direktexpositionsmethoden vorzustellen, verwenden wir Magnesiumoxid-Nanopartikel (nMgO) als Modellmaterial, um bakterielle Interaktionen zu demonstrieren. Um die Methoden der direkten Kultur und des fokussierten Kontakts zu präsentieren, verwenden wir eine Mg-Legierung mit nanostrukturierten Oberflächen als Beispiele.
1. Sterilisation von Nanomaterialien
HINWEIS: Alle Nanomaterialien müssen vor der mikrobiellen Kultur ...

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Wir haben vier in vitro Methoden (A-D) vorgestellt, um die antibakteriellen Aktivitäten von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen zu charakterisieren. Während jede dieser Methoden das Wachstum und die Lebensfähigkeit von Bakterien im Laufe der Zeit als Reaktion auf Nanomaterialien quantifiziert, gibt es einige Unterschiede bei den Methoden, die zur Messung der anfänglichen bakteriellen Aussaatdichte, des Wachstums und der Lebensfähigkeit im Laufe der Zeit verwendet werden. Drei dieser Methoden, ...

Allein in den USA entwickeln jährlich 1,7 Millionen Menschen eine im Krankenhaus erworbene Infektion (HAI), wobei eine von 17 dieser Infektionen zum Tod führt1. Darüber hinaus werden die Behandlungskosten für therapieassoziierte Infektionen auf 28 bis 45 Milliarden US-Dollar pro Jahr geschätzt 1,2. Bei diesen therapieassoziierten Infektionen dominieren Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)3,4 und Pseudomonas aeruginosa4, die häufig aus chronischen Wundinfektionen isoliert werden und in der Regel eine umfangreiche Behandlung und Zeit erfordern, um ein günstiges Patientenergebnis zu erzielen.
In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Antibiotikaklassen entwickelt, um Infektionen im Zusammenhang mit diesen und anderen pathogenen Bakterien zu behandeln. Zum Beispiel wurden Rifamycin-Analoga zur Behandlung von MRSA, anderen grampositiven und gramnegativen Infektionen und Mycobacterium spp.-Infektionen eingesetzt5. In den 1990er Jahren wurden zusätzliche Medikamente mit Rifamycin-Analoga kombiniert, um eine zunehmende Zahl von M. tuberculosis-Infektionen wirksam zu behandeln, um deren Wirksamkeit zu erhöhen. Etwa 5 % der Fälle von M. tuberculosis sind jedoch nach wie vor resistent gegenRifampicin5,6, und es gibt zunehmende Besorgnis über multiresistente Bakterien7. Derzeit ist der Einsatz von Antibiotika allein bei der Behandlung von therapieassoziierten Infektionen möglicherweise nicht ausreichend, was zu einer anhaltenden Suche nach alternativen antimikrobiellen Therapien geführt hat1.
Schwermetalle wie Silber (Ag)8,9,10 und Gold (Au)11 sowie Keramiken wie Titandioxid (TiO 2)12 und Zinkoxid (ZnO)13 in Form von Nanopartikeln (NP) (AgNP, AuNP, TiO2 NP bzw. ZnONP) wurden aufihre antimikrobielle Aktivität untersucht und als potenzielle antibiotische Alternativen identifiziert. Darüber hinaus sind bioresorbierbare Materialien wie Magnesiumlegierungen (Mg-Legierungen)14,15,16, Magnesiumoxid-Nanopartikel 17,18,19,20,21 und Magnesiumhydroxid-Nanopartikel [nMgO bzw. nMg(OH)2]22,23,24, wurden ebenfalls untersucht. In den bisherigen antimikrobiellen Studien zu Nanopartikeln wurden jedoch uneinheitliche Materialien und Forschungsmethoden verwendet, was zu Daten führte, die schwer oder gar nicht vergleichbar sind und manchmal widersprüchlicher Natur sind18,19. So variierten beispielsweise die minimale Hemmkonzentration (MHK) und die minimale bakterizide Konzentration (MBC) von Silbernanopartikeln in verschiedenen Studien signifikant. Ipe et al.25 untersuchten die antibakterielle Aktivität von AgNPs mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von ~26 nm, um die MICs gegen grampositive und gramnegative Bakterien zu bestimmen. Die identifizierten MICs für P. aeruginosa, E. coli, S. aureus und MRSA betrugen 2 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml bzw. 10 μg/ml. Im Gegensatz dazu untersuchten Parvekar et al.26 AgNPs mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von 5 nm. In diesem Fall erwiesen sich die AgNP MHK und ein MBC von 0,625 mg/ml als wirksam gegen S. aureus. Darüber hinaus untersuchten Loo et al.27 AgNPs mit einer Größe von 4,06 nm. Wenn E. coli diesen Nanopartikeln ausgesetzt wurde, wurden MHK und MBC mit 7,8 μg/ml angegeben. Schließlich untersuchten Ali et al.28 die antibakteriellen Eigenschaften von sphärischen AgNPs mit einer durchschnittlichen Größe von 18 nm. Wenn P. aeruginosa, E. coli und MRSA diesen Nanopartikeln ausgesetzt wurden, wurde die MHK bei 27 μg/ml, 36 μg/ml, 27 μg/ml bzw. 36 μg/ml und die MBC bei 36 μg/ml, 42 μg/ml bzw. 30 μg/ml identifiziert.
Obwohl die antibakterielle Aktivität von Nanopartikeln in den letzten Jahrzehnten ausgiebig untersucht und berichtet wurde, gibt es keinen Standard für die verwendeten Materialien und Forschungsmethoden, um direkte Vergleiche zwischen Studien zu ermöglichen. Aus diesem Grund stellen wir zwei Methoden vor, die direkte Co-Kultur-Methode (Methode A) und die direkte Expositionsmethode (Methode B), um die antimikrobiellen Aktivitäten von Nanopartikeln zu charakterisieren und zu vergleichen und gleichzeitig die Materialien und Methoden konsistent zu halten.
Neben Nanopartikeln wurden auch nanostrukturierte Oberflächen auf antibakterielle Aktivitäten untersucht. Dazu gehören kohlenstoffbasierte Materialien wie Graphen-Nanoblätter, Kohlenstoff-Nanoröhren und Graphit29 sowie reines Mg und Mg-Legierungen. Jedes dieser Materialien hat mindestens einen antibakteriellen Mechanismus gezeigt, einschließlich physikalischer Schäden, die Zellmembranen durch kohlenstoffbasierte Materialien auferlegt werden, und Schäden an Stoffwechselprozessen oder DNA durch die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) beim Abbau von Mg. Wenn Zink (Zn) und Calcium (Ca) bei der Bildung von Mg-Legierungen kombiniert werden, wird außerdem die Verfeinerung der Korngröße der Mg-Matrix verbessert, was zu einer Verringerung der bakteriellen Adhäsion an Substratoberflächen im Vergleich zu reinen Mg-Proben führt14. Um die antibakterielle Aktivität zu demonstrieren, stellen wir die Direktkulturmethode (Methode C) vor, die die bakterielle Adhäsion auf und um nanostrukturierte Materialien über die Zeit durch die Quantifizierung von bakteriellen koloniebildenden Einheiten (KBE) mit direktem und indirektem Oberflächenkontakt bestimmt.
Die Geometrie von Nanostrukturen auf Oberflächen, einschließlich der Größe, Form und Ausrichtung, könnte die bakterizide Aktivität von Materialien beeinflussen. Zum Beispiel stellten Lin et al.16 verschiedene nanostrukturierte MgO-Schichten auf den Oberflächen von Mg-Substraten durch Anodisierung und elektrophoretische Abscheidung (EPD) her. Nach einer gewissen Exposition gegenüber der nanostrukturierten Oberfläche in vitro war das Wachstum von S. aureus im Vergleich zu unbehandeltem Mg deutlich reduziert. Dies deutete auf eine größere Wirksamkeit der nanostrukturierten Oberfläche gegen bakterielle Adhäsion gegenüber der unbehandelten metallischen Mg-Oberfläche hin. Um die unterschiedlichen Mechanismen der antibakteriellen Eigenschaften verschiedener nanostrukturierter Oberflächen aufzudecken, wird in diesem Artikel eine fokussierte Kontakt-Expositionsmethode (Methode D) diskutiert, die die Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen innerhalb des interessierenden Bereichs bestimmt.
Das Ziel dieses Artikels ist es, vier In-vitro-Methoden vorzustellen, die auf verschiedene Nanopartikel, nanostrukturierte Oberflächen und mikrobielle Spezies anwendbar sind. Wir diskutieren die wichtigsten Überlegungen für jede Methode, um konsistente, reproduzierbare Daten für die Vergleichbarkeit zu erzeugen. Insbesondere werden die direkte Co-Kultur-Methode17 und die direkte Expositionsmethode verwendet, um die antimikrobiellen Eigenschaften von Nanopartikeln zu untersuchen. Durch die direkte Kokulturmethode können die minimalen inhibitorischen und minimalen bakteriziden Konzentrationen (MHK bzw. MBC90-99,99) für einzelne Spezies und die stärkste Konzentration (MPC) für mehrere Spezies bestimmt werden. Durch die Direktbelichtungsmethode können die bakteriostatischen oder bakteriziden Wirkungen von Nanopartikeln bei minimalen Hemmkonzentrationen durch optische Dichtemessungen in Echtzeit über die Zeit charakterisiert werden. Die Direktkulturmethode14 eignet sich zur direkten und indirekten Untersuchung von Bakterien, die mit nanostrukturierten Oberflächen in Kontakt kommen. Schließlich wird die Methode der fokussierten Kontaktexposition16 vorgestellt, um die antibakterielle Aktivität eines bestimmten Bereichs auf einer nanostrukturierten Oberfläche durch die direkte Anwendung von Bakterien und die Charakterisierung des Bakterienwachstums an der Zell-Nanostruktur-Grenzfläche zu untersuchen. Diese Methode basiert auf der japanischen Industrienorm JIS Z 2801:200016 und soll sich auf die Wechselwirkungen zwischen Mikroben und Oberfläche konzentrieren und die Auswirkungen des Abbaus von Massenproben in mikrobieller Kultur auf antimikrobielle Aktivitäten ausschließen.

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		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>Z336777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 L NTRL Certified Convection Drying Oven&#160;</td>
			<td>MTI Corporation</td>
			<td>BPG-7082</td>
			<td>https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>42457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaSpec&#160;THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-850-291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron-multiplying charge-coupled device digital camera&#160;</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Brightline, Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverse microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth</td>
			<td>Sigma Life Science&#160;</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth + agar</td>
			<td>Sigma Life Science&#160;</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacroTube 5.0&#160;&#160;</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1005-T5-ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium oxide nanoparticles</td>
			<td>US Research Nanomaterials, Inc</td>
			<td>Stock #:&#160;US3310&#160;&#160;&#160;M</td>
			<td>MgO, 99+%, 20 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Semi-Micro Balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MS105D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>09-801A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-tissue treated 12-well polystyrene plate</td>
			<td>Falcon Corning Brand&#160;</td>
			<td>351143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-tissue treated 48-well polystyrene plate</td>
			<td>Falcon Corning Brand&#160;</td>
			<td>351178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-tissue treated 96-well polystyrene plate</td>
			<td>Falcon Corning Brand&#160;</td>
			<td>351172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470210-568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 15 mm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SP70P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscopy (SEM)</td>
			<td>TESCAN&#160;</td>
			<td>Vega3 SBH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>accuSpin Micro 17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar</td>
			<td>MP</td>
			<td>1010617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Benchmark Incu-shaker 10L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray power defraction</td>
			<td>&#160;Panalytical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PANalytical Empyrean Series 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces in vitro

Die antimikrobiellen Aktivitäten von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen wie Silber, Zinkoxid, Titandioxid und Magnesiumoxid wurden bereits in klinischen und umweltbedingten Umgebungen sowie in konsumierbaren Lebensmitteln untersucht. Mangelnde Konsistenz in den verwendeten experimentellen Methoden und Materialien hat jedoch zu widersprüchlichen Ergebnissen geführt, selbst bei Studien mit denselben Nanostrukturtypen und Bakterienarten. Für Forscher, die Nanostrukturen als Additiv oder Beschichtung in einem Produktdesign einsetzen möchten, schränken diese widersprüchlichen Daten ihre Verwendung im klinischen Umfeld ein. 
Um diesem Dilemma zu begegnen, stellen wir in diesem Artikel vier verschiedene Methoden vor, um die antimikrobiellen Aktivitäten von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen zu bestimmen, und diskutieren ihre Anwendbarkeit in verschiedenen Szenarien. Es wird erwartet, dass die Anpassung konsistenter Methoden zu reproduzierbaren Daten führt, die studienübergreifend verglichen und für verschiedene Nanostrukturtypen und mikrobielle Spezies implementiert werden können. Wir stellen zwei Methoden zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität von Nanopartikeln und zwei Methoden zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität von nanostrukturierten Oberflächen vor. 
Für Nanopartikel kann die direkte Co-Kultur-Methode verwendet werden, um die minimalen inhibitorischen und minimalen bakteriziden Konzentrationen von Nanopartikeln zu bestimmen, und die direkte Expositionskulturmethode kann verwendet werden, um die bakteriostatische und bakterizide Aktivität in Echtzeit zu bewerten, die sich aus der Exposition gegenüber Nanopartikeln ergibt. Bei nanostrukturierten Oberflächen wird die Direktkulturmethode verwendet, um die Lebensfähigkeit von Bakterien indirekt und direkt in Kontakt mit nanostrukturierten Oberflächen zu bestimmen, und die Methode der fokussierten Kontaktexposition wird verwendet, um die antimikrobielle Aktivität auf einem bestimmten Bereich einer nanostrukturierten Oberfläche zu untersuchen. Wir diskutieren die wichtigsten experimentellen Variablen, die für das in vitro Studiendesign bei der Bestimmung der antimikrobiellen Eigenschaften von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen zu berücksichtigen sind. Alle diese Methoden sind relativ kostengünstig, verwenden Techniken, die relativ einfach zu beherrschen und aus Gründen der Konsistenz wiederholbar sind, und sind auf ein breites Spektrum von Nanostrukturtypen und mikrobiellen Spezies anwendbar.

Die Identifizierung der antibakteriellen Aktivität von Magnesiumoxid-Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen wurde anhand von vier In-vitro-Methoden vorgestellt, die auf verschiedene Materialtypen und mikrobielle Spezies anwendbar sind.
Methode A und Methode B untersuchen bakterielle Aktivitäten, wenn sie Nanopartikeln in einer Verzögerungsphase (Methode A) und einer logarithmischen Phase (Methode B) für einen Zeitraum von 24 Stunden oder länger ausgesetzt werden. Metho...

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Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro

Wir stellen vier Methoden vor, um die antimikrobielle Aktivität von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen mit Hilfe von in vitro Techniken zu bewerten. Diese Methoden können angepasst werden, um die Wechselwirkungen verschiedener Nanopartikel und nanostrukturierter Oberflächen mit einem breiten Spektrum mikrobieller Spezies zu untersuchen.

Evaluierung der antimikrobiellen Aktivitäten von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen in vitro

The antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, such as silver, zinc oxide, titanium dioxide, and magnesium oxide, have been ...

Die Protokolle bieten eine Methode zur Untersuchung der antimikrobiellen Aktivitäten von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen von Voruntersuchungen bis hin zu komplexeren Oberflächenuntersuchungen. Im Gegensatz zu zuvor beschriebenen Methoden, die in verschiedenen Studien zu unvergleichlichen Daten führten, liefern diese Methoden konsistente und vergleichbare Ergebnisse über verschiedene Nanopartikelmaterialien, nanostrukturierte Materialien und mikrobielle Spezies hinweg. Die Aufrechterhaltung einer homogenen Verteilung der Nanopartikel in den Methoden A und B kann schwierig sein.Durch gründliches Vortexen der Proben wird die Suspension von Nanopartikeln sichergestellt, und durch drei- bis viermaliges Pipettieren zwischen den Aliquoten bleiben die Suspensionen erhalten. Beginnen Sie mit dem Sammeln kultivierter Bakterien, indem Sie einen Milliliter der über Nacht gewachsenen Bakterienkultur in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen aliquotieren. Nachdem Sie eine ausreichende Anzahl von Aliquoten hergestellt haben, zentrifugieren Sie diese, um die gewünschte Sitzdichte zu erreichen. Sammeln Sie den Überstand in einem Auffangbehälter.Und suspendieren Sie das Zellpellet in 0,5 Milliliter frischem Nährmedium. Kombinieren Sie die Suspension aus zwei Rohren und wiederholen Sie die Zentrifugalisierung. Nach dem Zentrifugalisieren eine zweite Wäsche mit frischem Nährmedium durchführen und das Kombinieren des Inhalts von zwei Röhrchen zu einem wiederholen, bevor Sie die Röhrchen zentrifugieren.Die dritte Wäsche mit 0,33 Milliliter Tris-Puffer oder Hydroxyethylaminomethan-Puffer geben. Kombinieren Sie die drei Suspensionen mit jeweils 0,33 Milliliter Volumen zu einer 1,5-Milliliter-Mikrozentrifuge. Entfernen Sie nach der Zentrifugalisierung den Überstand aus den pelletierten Zellen und suspendieren Sie das Zellpellet erneut in einem Milliliter frischem Tris-Puffer, der als Zellsuspension oder Verzögerungsphasen-Bakteriensaatkultur bezeichnet wird.Um die Bakterien- und Nanopartikelkulturen zu bilden, aliquotieren Sie die zwei Milliliter der bakteriellen Seeding-Kultur in jeder Vertiefung einer 12-Well-Polystyrolplatte, die nicht mit Gewebe behandelt ist. Für jedes Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das vorgewogene Magnesiumoxidpartikel enthält, fügen Sie drei Milliliter der bakteriellen Keimkultur hinzu. Und wirbeln Sie das Röhrchen kurz, um die Magnesiumoxid-Nanopartikel mit den Bakterien zu vermischen.Aliquotieren Sie nach dem Mischen einen Milliliter der Magnesiumoxid-Nanopartikelsuspension in drei separate Vertiefungen, um die dreifachen Proben jedes vorgemessenen Gewichts von Magnesiumoxid-Nanopartikeln herzustellen. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius und 120 U/min. Und übertragen Sie eine drei Milliliter große Probe mit einer Pipette in ein einzelnes konisches 15-Milliliter-Röhrchen.Führen Sie dann eine bis 10-serielle Verdünnung in einer 96-Well-Platte durch, indem Sie 180 Mikroliter Tris-Puffer zu jeder Vertiefung in Reihe B bis Reihe G für die entsprechende Anzahl von Säulen hinzufügen. Ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit Bakterienproben wird kurz vortexiert und 50 Mikroliter Bakterienprobe in eine einzelne Vertiefung in Reihe A gegeben.Als nächstes werden 20 Mikroliter Bakterienprobe aus Reihe A unter kurzem Mischen in die entsprechende Vertiefung von Reihe B überführt. Übertragen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze 20 Mikroliter aus der Vertiefung in Reihe B in die entsprechende Vertiefung in Reihe C.Fahren Sie damit bis zur Reihe G fort, um die Verdünnungsreihe von 10 auf die negative Verdünnung in Reihe B bis 10 auf die negativen sechs in Reihe G abzuschließen.Wenn Sie fertig sind, pipettieren Sie 100 Mikroliter jeder Vertiefung in eine geeignete Wachstumsagarplatte. und auf der Platte verteilen, um die Zellkultur zu verteilen.Legen Sie die Well-Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator-Shaker und inkubieren Sie die Agarplatten 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Untersuchen Sie die Platte und zählen Sie die Platten mit etwa 25 bis 300 Kolonien. Wählen Sie nach Möglichkeit Platten mit dem gleichen Verdünnungswert.Für jedes zu testende Material verdünnen Sie die Bakterienproben über Nacht, indem Sie dem Nährmedium drei 200-Mikroliter-Aliquots in drei Vertiefungen und drei 200-Mikroliter-Aliquots der Bakterienkultur in weitere Vertiefungen geben. Legen Sie die 96-Well-Platte in den Plattenleser und scannen Sie sie. Falls erforderlich, fügen Sie die Brühe oder die Bakterienkultur über Nacht hinzu, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD 600 etwa 0,01 erreicht ist.Zur Herstellung von bakteriellen Nanopartikelsuspensionen und Nanopartikelsuspensionen für sterile Medien wird ein Milliliter Bakterienkultur oder -medium aus einem dreifachen Satz von konischen 15-Milliliter-Röhrchen entnommen. Und geben Sie es in ein Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit vorgemessenen Nanopartikeln. Wirbeln Sie die Röhrchen, um die Lösung zu mischen.Verteilen Sie die Nanopartikel homogen, indem Sie ein Milliliter-Aliquote aus dem Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen in das konische 15-Milliliter-Röhrchen überführen. Sobald dies erledigt ist, aliquotieren Sie 200 Mikroliter jeder Probe in die einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Nachdem die zuvor beschriebene Sitzdichte bestimmt wurde, werden die Proben und die Kontrolle in die einzelnen Vertiefungen einer 48-Well-Polystyrolplatte gegeben, die nicht mit Gewebe behandelt wurde.Als nächstes werden die 0,75 Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung aliquotiert, die die Proben und Kontrollen enthält. Legen Sie die 48-Well-Platte für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in einen Inkubatorschüttler und schütteln Sie sie mit 120 U/min. Nach der Inkubation werden zwei Proben aus jeder Gruppe entnommen und einzeln in beschriftete Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.Geben Sie zwei Milliliter revidierte simulierte Körperflüssigkeit (RSBF) in jedes Röhrchen. Bereiten Sie sterilisiertes salpetriges Zellulosepapier vor, indem Sie es auf einen Durchmesser von einem Zentimeter zuschneiden. Legen Sie das geschnittene Nitrozellulosepapier auf eine Agarplatte, die das entsprechende Medium enthält.Geben Sie anschließend 50 Mikroliter der verdünnten Bakterienkultur auf das Filterpapier, bevor Sie 50 Mikroliter eines geeigneten Mediums in die Mitte jeder Probenoberfläche geben. Nehmen Sie das Salpetercellosepapier mit einer sterilisierten Pinzette von der Oberfläche der Schnecke auf. Drehen Sie das Salpeterzellulosepapier vorsichtig um und legen Sie es auf die Probenoberfläche, so dass die Bakterien mit den 50 Mikrolitern des Mediums und der gewünschten nanostrukturierten Oberfläche in Kontakt kommen.Wenn die Probe in Kultur abbaubar ist, legen Sie einen Halter darunter, um sie anzuheben, um den Kontakt mit dem Tris-Puffer zu vermeiden. Halten Sie die Luftfeuchtigkeit aufrecht, indem Sie einen Milliliter Tris-Puffer in eine Probenvertiefung geben. Sammeln Sie nach der Inkubation über Nacht das Nitrozellulosepapier von jeder Probenoberfläche und geben Sie es in fünf Milliliter Tris-Puffer.Verschieben Sie die gesammelten Filterpapiere und Nanooberflächenmaterialproben fünf Sekunden lang. Sammeln Sie die Tris-Puffersuspensionen aus der Probe und geben Sie sie in einzelne frische Sammelröhrchen. Die antimikrobiellen Wirkungen unter Verwendung der Methode A identifizierten eine minimale und hemmende Konzentration (MHK) von einem Milligramm pro Milliliter Magnesiumoxid-Nanopartikel und minimale bakteriozide Konzentrationen (MBC 99,9) von 1,0 bzw. 1,6 Milligramm pro Milliliter Magnesiumoxid-Nanopartikel für gramnegative Escherichia coli bzw. Pseudomonas aeruginosa.Der grampositive Staphylococcus epidermis, S. Aureus, und der Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) wiesen die MHK-Werte von 0,5, 0,7 bzw. einem Milligramm pro Milliliter Magnesiumoxid-Nanopartikel auf. NBC 99,99 Werte von 1,6 bzw. 1,2 Milligramm pro Milliliter wurden für S. epidermis bzw. S. aureus identifiziert. Während MRSA nicht über NBC 90 hinaus reduziert wurde.MICs von 1,2 und einem Milligramm pro Milliliter wurden bei arzneimittelempfindlichen und arzneimittelresistenten Candida-Spezies, C-albicanen bzw. C-albicans-Fluconazol-resistenten bzw. FR-resistenten Candida-Spezies identifiziert. Im Gegensatz dazu wiesen Magnesiumoxid-Nanopartikel MHK-Werte von einem und 0,7 Milligramm pro Milliliter auf, was C. glabrata bzw. C glabrata echinocandin resistant (ER) entspricht. Jede Kandidatenspezies erreichte einen NBC 90 von 0,7 bis 1,2 Milligramm pro Milliliter, aber nur C. glabrata ER wurde auf NBC 99,9 mit 1,2 Milligramm pro Milliliter reduziert.In Methode B wuchs MRSA, die Nanopartikeln ausgesetzt waren, exponentiell auf einen OD von 0,85. Die Exposition gegenüber 1,2 Milligramm pro Milliliter Magnesiumoxid-Nanopartikeln und 6,25 Milligramm pro Milliliter Trimethoprim führte zu einem reduzierten Bakterienwachstum von 80,2 % bzw. 81,6 %. In ähnlicher Weise reduzierten 2,9 Milligramm pro Milliliter Magnesiumhydroxid-Nanopartikel das Bakterienwachstum auf 70,3 %Die Exposition gegenüber einem Mikroliter pro Milliliter Vancomycin führte zu einer Verringerung des MRSA-Wachstums um 99,99 %, was auf die bakteriostatische Aktivität von Magnesiumoxid und Magnesiumhydroxid-Nanopartikeln hindeutet.Methode C zeigte keine Hemmung des Bakterienwachstums bei indirektem Kontakt. Die Ergebnisse zeigten, dass ZC21 bei allen untersuchten Proben die stärkste antibakterielle Aktivität gegen die Adhäsion und das Wachstum von MRSA aufwies. In Methode D wurde in den 1.9A-, 1.9 AA- und EPD-Proben oder ihren gepaarten Filterpapieren kein lebensfähiger Staphylokokken-Aureus identifiziert.Die Exposition gegenüber den EPD-Proben nach einem Knien reduzierte jedoch das Bakterienwachstum auf wenige Zellen auf der nanostrukturierten Oberfläche und dem geschliffenen Filterpapier. Die Identifizierung antimikrobieller Aktivitäten von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen hat zu weiteren Untersuchungen in biotechnischen Anwendungen geführt, einschließlich solcher im Zusammenhang mit chronischen Wunden und implantatbedingten Infektionen.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Mikrostrukturierten Oberflächen zum Studium Hyaluronsäure Wechselwirkungen mit Krebszellen

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Forschung

Biotechnik

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

Die Herstellung einer funktionalisierter magnetischer bakterielle Nanocellulose mit Eisenoxid-Nanopartikel

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

Herstellung von Thermoresponsive nanostrukturierte Oberflächen für Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Herstellung von Metallnanopartikeln durch gepulste Laserablation in Flüssigkeiten: Ein Werkzeug zum Studium der antibakteriellen Eigenschaften von Nanopartikeln

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Synthese von Multi-walled Carbonnanotubes mit Silber-Nanopartikeln und Bewertung ihrer antibakteriellen Aktivitäten und zytotoxische Eigenschaften modifiziert

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. Thus, many novel biomaterials are being designed to mimic specific environments required for biomedical applications such as tissue engineering and controlled drug delivery. The development of materials with improved properties for the immobilization of cells or enzymes is also a current research topic in bioprocess engineering. However, one of the most desirable properties of a material in these applications is the antimicrobial capacity to avoid any undesirable infections. For this, we present easy-to-follow protocols for the antimicrobial characterization of materials based on (i) the agar disk diffusion test (diffusion method) and (ii) the ISO 22196:2007 norm to measure the antimicrobial activity on material surfaces (contact method). This protocol must be performed using Gram-positive and Gram-negative bacteria and yeast to cover a broad range of microorganisms. As an example, 4 materials with different chemical natures are tested following this protocol against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, and Candida albicans.The results of these tests exhibit non-antimicrobial activity for the first material and increasing antibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria for the other 3 materials. However, none of the 4 materials are able to inhibit the growth of Candida albicans.

We present a protocol for the antimicrobial characterization of advanced materials. Here, the antimicrobial activity on material surfaces is measured by two methods that complement each other: one is based on the agar disk diffusion test, and the other is a standard procedure based on the ISO 22196:2007 norm.

Antimikrobielle Charakterisierung der Hochleistungswerkstoffe für Bioengineering-Anwendungen

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. ...