Name: evaluation of antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces in vitro
Uploaded: 2023-04-21T14:40:00
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Gli autori apprezzano il sostegno finanziario della National Science Foundation degli Stati Uniti (NSF CBET award 1512764 e NSF PIRE 1545852), del National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), della University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship, del Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) e dell'UC-Riverside Graduate Research Mentorship Program Grant assegnato a Patricia Holt-Torres. Gli autori apprezzano l'assistenza fornita dalla Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) della UC-Riverside per l'uso di SEM / EDS e dal Dr. Perry Cheung per l'uso di XRD. Gli autori desiderano anche ringraziare Morgan Elizabeth Nator e Samhitha Tumkur per la loro assistenza con gli esperimenti e le analisi dei dati. Tutte le opinioni, i risultati, le conclusioni o le raccomandazioni espresse in questo articolo sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della National Science Foundation o del National Institutes of Health.

Per presentare i metodi di co-coltura diretta e di esposizione diretta, utilizziamo nanoparticelle di ossido di magnesio (nMgO) come materiale modello per dimostrare le interazioni batteriche. Per presentare la coltura diretta e i metodi di esposizione a contatto focalizzato, utilizziamo una lega Mg con superfici nanostrutturate come esempi.
1. Sterilizzazione dei nanomateriali
NOTA: Tutti i nanomateriali devono essere sterilizzati o disinfettati prim...

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Abbiamo presentato quattro metodi in vitro (A-D) per caratterizzare le attività antibatteriche di nanoparticelle e superfici nanostrutturate. Mentre ciascuno di questi metodi quantifica la crescita batterica e la vitalità nel tempo in risposta ai nanomateriali, esistono alcune variazioni nei metodi utilizzati per misurare la densità iniziale di semina batterica, la crescita e la vitalità nel tempo. Tre di questi metodi, il metodo della cocoltura diretta (A)17, il metodo della coltura ...

Solo negli Stati Uniti, 1,7 milioni di individui sviluppano un'infezione acquisita in ospedale (HAI) ogni anno, con una su 17 di queste infezioni con conseguente morte1. Inoltre, si stima che i costi di trattamento per le IAA vadano da $ 28 miliardi a $ 45 miliardi all'anno 1,2. Queste ICA sono predominate da Staphylococcus aureus meticillino-resistente (MRSA)3,4 e Pseudomonas aeruginosa4, che sono comunemente isolati dalle infezioni croniche della ferita e di solito richiedono un trattamento esteso e tempo per produrre un esito favorevole al paziente.
Negli ultimi decenni, sono state sviluppate più classi di antibiotici per trattare le infezioni legate a questi e ad altri batteri patogeni. Ad esempio, analoghi della rifamicina sono stati usati per trattare MRSA, altre infezioni gram-positive e gram-negative e infezioni da Mycobacterium spp.5. Nel 1990, per trattare efficacemente un numero crescente di infezioni da M. tuberculosis, ulteriori farmaci sono stati combinati con analoghi della rifamicina per aumentare la loro efficacia. Tuttavia, circa il 5% dei casi di M. tuberculosis rimane resistente allarifampicina 5,6 e vi è una crescente preoccupazione per quanto riguarda i batteri multi-farmaco resistenti7. Attualmente, l'uso di antibiotici da solo potrebbe non essere sufficiente nel trattamento delle IAA e ciò ha provocato una continua ricerca di terapie antimicrobiche alternative1.
I metalli pesanti, come l'argento (Ag)8,9,10 e l'oro (Au)11, e la ceramica, come il biossido di titanio (TiO 2)12 e l'ossido di zinco (ZnO)13, in forma di nanoparticelle (NP) (AgNP, AuNP, TiO 2 NPe ZnONP, rispettivamente) sono stati esaminati per le loro attività antimicrobiche e sono stati identificati come potenziali alternative antibiotiche. Inoltre, materiali bioriassorbibili, come leghe di magnesio (leghe di Mg)14,15,16, nanoparticelle di ossido di magnesio 17,18,19,20,21 e nanoparticelle di idrossido di magnesio [nMgO e nMg(OH)2, rispettivamente]22,23,24, sono stati esaminati anche. Tuttavia, i precedenti studi antimicrobici sulle nanoparticelle hanno utilizzato materiali e metodi di ricerca incoerenti, ottenendo dati difficili o impossibili da confrontare e talvolta contraddittori in natura18,19. Ad esempio, la concentrazione minima inibitoria (MIC) e la concentrazione battericida minima (MBC) di nanoparticelle d'argento variavano significativamente in diversi studi. Ipe et al.25 hanno valutato le attività antibatteriche degli AgNP con una dimensione media delle particelle di ~ 26 nm per determinare le MIC contro batteri gram-positivi e gram-negativi. Le MIC identificate per P. aeruginosa, E. coli, S. aureus e MRSA erano rispettivamente 2 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL e 10 μg/mL. Al contrario, Parvekar et al.26 hanno valutato AgNP con una dimensione media delle particelle di 5 nm. In questo caso, l'AgNP MIC e un MBC di 0,625 mg/ml sono risultati efficaci contro S. aureus. Inoltre, Loo et al.27 hanno valutato AgNP con una dimensione di 4,06 nm. Quando E. coli è stato esposto a queste nanoparticelle, il MIC e l'MBC sono stati riportati a 7,8 μg / ml. Infine, Ali et al.28 hanno studiato le proprietà antibatteriche degli AgNP sferici con una dimensione media di 18 nm. Quando P. aeruginosa, E. coli e MRSA sono stati esposti a queste nanoparticelle, il MIC è stato identificato a 27 μg / mL, 36 μg / mL, 27 μg / mL e 36 μg / mL, rispettivamente, e l'MBC è stato identificato a 36 μg / mL, 42 μg / mL e 30 μg / mL, rispettivamente.
Sebbene l'attività antibatterica delle nanoparticelle sia stata ampiamente studiata e riportata negli ultimi decenni, non esiste uno standard per i materiali e i metodi di ricerca utilizzati per consentire confronti diretti tra gli studi. Per questo motivo, presentiamo due metodi, il metodo di co-coltura diretta (metodo A) e il metodo di esposizione diretta (metodo B), per caratterizzare e confrontare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle mantenendo i materiali e i metodi coerenti.
Oltre alle nanoparticelle, sono state esaminate anche superfici nanostrutturate per attività antibatteriche. Questi includono materiali a base di carbonio, come nanofogli di grafene, nanotubi di carbonio e grafite29, nonché leghe pure di Mg e Mg. Ognuno di questi materiali ha mostrato almeno un meccanismo antibatterico, tra cui danni fisici imposti alle membrane cellulari da materiali a base di carbonio e danni ai processi metabolici o al DNA attraverso il rilascio di specie reattive dell'ossigeno (ROS) quando il Mg si degrada. Inoltre, quando lo zinco (Zn) e il calcio (Ca) sono combinati nella formazione di leghe di Mg, viene migliorata la raffinatezza della granulometria della matrice di Mg, il che porta ad una riduzione dell'adesione batterica alle superfici del substrato rispetto ai campioni di solo Mg14. Per dimostrare l'attività antibatterica, presentiamo il metodo della coltura diretta (metodo C), che determina l'adesione batterica su e intorno a materiali nanostrutturati nel tempo attraverso la quantificazione di unità formanti colonie batteriche (CFU) con contatto superficiale diretto e indiretto.
La geometria delle nanostrutture sulle superfici, comprese le dimensioni, la forma e l'orientamento, potrebbe influenzare le attività battericide dei materiali. Ad esempio, Lin et al.16 hanno fabbricato diversi strati nanostrutturati di MgO sulle superfici dei substrati di Mg attraverso l'anodizzazione e la deposizione elettroforetica (EPD). Dopo un periodo di esposizione alla superficie nanostrutturata in vitro, la crescita di S. aureus è risultata sostanzialmente ridotta rispetto al Mg non trattato. Ciò ha indicato una maggiore potenza della superficie nanostrutturata contro l'adesione batterica rispetto alla superficie metallica Mg non trattata. Per rivelare i diversi meccanismi delle proprietà antibatteriche di varie superfici nanostrutturate, in questo articolo viene discusso un metodo di esposizione a contatto focalizzato (metodo D) che determina le interazioni cellula-superficie all'interno dell'area di interesse.
L'obiettivo di questo articolo è presentare quattro metodi in vitro applicabili a diverse nanoparticelle, superfici nanostrutturate e specie microbiche. Discutiamo le considerazioni chiave per ciascun metodo per produrre dati coerenti e riproducibili per la comparabilità. In particolare, il metodo di cocoltura diretta17 e il metodo dell'esposizione diretta sono utilizzati per esaminare le proprietà antimicrobiche delle nanoparticelle. Attraverso il metodo della co-coltura diretta, le concentrazioni minime inibitorie e battericide minime (MIC e MBC90-99,99, rispettivamente) possono essere determinate per le singole specie e la concentrazione più potente (MPC) può essere determinata per più specie. Attraverso il metodo dell'esposizione diretta, gli effetti batteriostatici o battericidi delle nanoparticelle a concentrazioni minime inibitorie possono essere caratterizzati da letture della densità ottica in tempo reale nel tempo. Il metodo della coltura diretta14 è adatto per esaminare i batteri direttamente e indirettamente a contatto con superfici nanostrutturate. Infine, viene presentato il metodo dell'esposizione a contatto focalizzato16 per esaminare l'attività antibatterica di un'area specifica su una superficie nanostrutturata attraverso l'applicazione diretta di batteri e la caratterizzazione della crescita batterica all'interfaccia cellula-nanostruttura. Questo metodo è modificato dallo standard industriale giapponese JIS Z 2801:200016 e ha lo scopo di concentrarsi sulle interazioni microbo-superficie ed escludere gli effetti della degradazione del campione di massa in coltura microbica sulle attività antimicrobiche.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>Z336777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 L NTRL Certified Convection Drying Oven&#160;</td>
			<td>MTI Corporation</td>
			<td>BPG-7082</td>
			<td>https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>42457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaSpec&#160;THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-850-291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron-multiplying charge-coupled device digital camera&#160;</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Brightline, Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverse microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth</td>
			<td>Sigma Life Science&#160;</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth + agar</td>
			<td>Sigma Life Science&#160;</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacroTube 5.0&#160;&#160;</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1005-T5-ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium oxide nanoparticles</td>
			<td>US Research Nanomaterials, Inc</td>
			<td>Stock #:&#160;US3310&#160;&#160;&#160;M</td>
			<td>MgO, 99+%, 20 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Semi-Micro Balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MS105D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>09-801A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-tissue treated 12-well polystyrene plate</td>
			<td>Falcon Corning Brand&#160;</td>
			<td>351143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-tissue treated 48-well polystyrene plate</td>
			<td>Falcon Corning Brand&#160;</td>
			<td>351178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-tissue treated 96-well polystyrene plate</td>
			<td>Falcon Corning Brand&#160;</td>
			<td>351172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470210-568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 15 mm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SP70P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscopy (SEM)</td>
			<td>TESCAN&#160;</td>
			<td>Vega3 SBH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>accuSpin Micro 17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar</td>
			<td>MP</td>
			<td>1010617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite 200 PRO</td>
			<td>https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Benchmark Incu-shaker 10L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray power defraction</td>
			<td>&#160;Panalytical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PANalytical Empyrean Series 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces in vitro

Le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate, come argento, ossido di zinco, biossido di titanio e ossido di magnesio, sono state esplorate in precedenza in contesti clinici e ambientali e in prodotti alimentari di consumo. Tuttavia, la mancanza di coerenza nei metodi sperimentali e nei materiali utilizzati è culminata in risultati contrastanti, anche tra studi sugli stessi tipi di nanostrutture e specie batteriche. Per i ricercatori che desiderano impiegare nanostrutture come additivo o rivestimento nella progettazione di un prodotto, questi dati contrastanti limitano il loro utilizzo in contesti clinici. 
Per affrontare questo dilemma, in questo articolo, presentiamo quattro diversi metodi per determinare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate e discutiamo la loro applicabilità in diversi scenari. L'adattamento di metodi coerenti dovrebbe portare a dati riproducibili che possono essere confrontati tra gli studi e implementati per diversi tipi di nanostrutture e specie microbiche. Introduciamo due metodi per determinare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e due metodi per le attività antimicrobiche delle superfici nanostrutturate. 
Per le nanoparticelle, il metodo della cocoltura diretta può essere utilizzato per determinare le concentrazioni minime inibitorie e battericide minime di nanoparticelle e il metodo di coltura a esposizione diretta può essere utilizzato per valutare in tempo reale l'attività batteriostatica rispetto all'attività battericida derivante dall'esposizione alle nanoparticelle. Per le superfici nanostrutturate, il metodo della coltura diretta viene utilizzato per determinare la vitalità dei batteri indirettamente e direttamente a contatto con superfici nanostrutturate e il metodo di esposizione a contatto focalizzato viene utilizzato per esaminare l'attività antimicrobica su un'area specifica di una superficie nanostrutturata. Discutiamo le principali variabili sperimentali da considerare per la progettazione di studi in vitro quando si determinano le proprietà antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate. Tutti questi metodi sono relativamente a basso costo, impiegano tecniche relativamente facili da padroneggiare e ripetibili per coerenza e sono applicabili a una vasta gamma di tipi di nanostrutture e specie microbiche.

L'identificazione dell'attività antibatterica delle nanoparticelle di ossido di magnesio e delle superfici nanostrutturate è stata presentata utilizzando quattro metodi in vitro applicabili a diversi tipi di materiali e specie microbiche.
Il metodo A e il metodo B esaminano le attività batteriche quando esposte a nanoparticelle in una fase di ritardo (metodo A) e in una fase logaritmica (metodo B) per una durata pari o superiore a 24 ore. Il metodo A fornisce risultati per quanto r...

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Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro

Introduciamo quattro metodi per valutare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate utilizzando tecniche in vitro . Questi metodi possono essere adattati per studiare le interazioni di diverse nanoparticelle e superfici nanostrutturate con una vasta gamma di specie microbiche.

Valutazione delle attività antimicrobiche di nanoparticelle e superfici nanostrutturate in vitro

The antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, such as silver, zinc oxide, titanium dioxide, and magnesium oxide, have been ...

I protocolli forniscono un metodo per esaminare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate dalle indagini preliminari agli esami di superficie più complessi. A differenza dei metodi descritti in precedenza che hanno portato a dati incomparabili tra gli studi, questi metodi producono risultati coerenti e comparabili tra diversi materiali di nanoparticelle, materiali nanostrutturati e specie microbiche. Mantenere una distribuzione omogenea delle nanoparticelle nei metodi A e B può essere difficile.I campioni di vortice accuratamente garantiranno la sospensione di nanoparticelle e il pipettaggio tre o quattro volte tra le aliquote manterrà le sospensioni Inizia a raccogliere batteri coltivati aliquotando un millilitro della coltura batterica cresciuta durante la notte in tubi di microcentrifuga da 1,5 millilitri. Dopo aver creato un numero sufficiente di aliquote, centrifugarle per raggiungere la densità di seduta desiderata. Raccogliere il surnatante in un recipiente di raccolta.E risospendere il pellet cellulare in 0,5 millilitri di terreno di crescita fresco. Unire la sospensione da due tubi e ripetere la centrifugalizzazione. Dopo la centrifugazione, dare un secondo lavaggio con terreno di coltura fresco e ripetere la combinazione del contenuto da due tubi in uno prima di centrifugare i tubi.Somministrare il terzo lavaggio con 0,33 millilitri di tampone tris o tampone idrossietilamminometano. Combinare le tre sospensioni, ciascuna di 0,33 millilitri di volume, in una micro centrifuga da 1,5 millilitri. Dopo la centrifugalizzazione, rimuovere il surnatante dalle cellule pellettate e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di tampone tris fresco che sarà noto come sospensione cellulare o coltura di semina batterica in fase di ritardo.Per formare le colture di batteri e nanoparticelle, aliquotare i due millilitri della coltura di semina batterica in ciascun pozzetto di una piastra di polistirene trattata con 12 pozzetti non tissutali. Per ogni micro tubo da centrifuga da cinque millilitri contenente particelle di ossido di magnesio pre-pesate, aggiungere tre millilitri di coltura di semina batterica. E vortice il tubo brevemente per mescolare le nanoparticelle di ossido di magnesio con i batteri.Dopo la miscelazione, aliquote di un millilitro della sospensione di nanoparticelle di ossido di magnesio in tre pozzetti separati per creare i campioni triplicati di ciascun peso premisurato di nanoparticelle di ossido di magnesio. Incubare il campione durante la notte a 37 gradi Celsius e 120 giri / min. E trasferire un campione da tre millilitri in un singolo tubo conico da 15 millilitri usando una pipetta.Quindi eseguire da una a 10 diluizioni seriali in una piastra da 96 pozzetti aggiungendo 180 microlitri di tampone tris a ciascun pozzetto nella riga B alla riga G per il numero appropriato di colonne. Vortice brevemente un tubo conico da 15 millilitri contenente campioni batterici e aggiungere 50 microlitri di campione batterico a un singolo pozzetto nella fila A.Successivamente, dalla riga A, trasferire 20 microlitri di campione batterico nel pozzetto corrispondente della fila B con breve miscelazione. Utilizzando una punta di pipetta sterile, trasferire 20 microlitri dal pozzetto nella fila B al pozzetto corrispondente nella fila C.Continuare così fino alla fila G per completare la diluizione seriale da 10 a quella negativa nella riga B a 10 alle sei negative nella fila G.Una volta fatto, pipettare 100 microlitri di ciascun pozzetto in una piastra di agar di crescita appropriata, e diffondersi attraverso la piastra per disperdere la coltura cellulare.Posizionare le piastre del pozzo in uno shaker incubatore durante la notte a 37 gradi Celsius e incubare le piastre di agar a 37 gradi Celsius per 24 ore. Esamina la piastra e conta le piastre con circa 25-300 colonie. Se possibile, scegliere piastre con lo stesso valore di diluizione.Per ogni materiale da testare, diluire i campioni batterici durante la notte aggiungendo tre aliquote da 200 microlitri al terreno di crescita in tre pozzetti e tre aliquote da 200 microlitri della coltura batterica in pozzetti aggiuntivi. Inserire la piastra a 96 pozzetti nel lettore di piastre e scansionarla. Se necessario, continuare ad aggiungere brodo o coltura batterica durante la notte fino a quando la densità ottica a 600 nanometri, o OD 600, raggiunge circa 0,01.Per preparare sospensioni di nanoparticelle batteriche e sospensioni di nanoparticelle sterili, rimuovere un millilitro di coltura batterica o mezzo da un set triplice di tubi conici da 15 millilitri. E aggiungilo in un tubo di centrifuga da cinque millilitri contenente nanoparticelle premisurate. Vortice i tubi per miscelare la soluzione.Distribuire le nanoparticelle in modo omogeneo trasferendo aliquote da un millilitro dal tubo da centrifuga da cinque millilitri al tubo conico da 15 millilitri. Una volta fatto, aliquote 200 microlitri di ciascun campione nei singoli pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Dopo aver determinato la densità di seduta descritta in precedenza, aggiungere i campioni e controllare nei singoli pozzetti di una lastra di polistirene non trattata con 48 pozzetti non tessuto.Quindi, aliquotare gli 0,75 millilitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto contenente i campioni e i controlli. Posizionare la piastra a 48 pozzetti in uno scuotitore incubatore per 24 ore a 37 gradi Celsius, agitando a 120 giri / min. Dopo l'incubazione, raccogliere due campioni da ciascun gruppo e trasferirli singolarmente in provette da microcentrifuga da cinque millilitri etichettate.Aggiungere due millilitri di fluido corporeo simulato rivisto, o RSBF, a ciascun tubo. Preparare carte di cellulosa nitrosa sterilizzate tagliandole in un centimetro di diametro. Disporre la carta nitrocellulosa tagliata su una piastra di agar contenente il mezzo appropriato.Quindi, aggiungere 50 microlitri di coltura batterica diluita sulla carta da filtro prima di aggiungere 50 microlitri di un mezzo appropriato al centro di ciascuna superficie del campione. Usando una pinzetta sterilizzata, raccogliere la carta nitrica cellose dalla superficie della coclea. Capovolgere con attenzione la carta di cellulosa nitrica e posizionarla sulla superficie del campione in modo che i batteri siano in contatto con i 50 microlitri di terreno e la superficie nanostrutturata di interesse.Se il campione è degradabile in coltura, mettere un supporto sotto di esso per sollevarlo per evitare il contatto con il tampone tris. Mantenere l'umidità aggiungendo un millilitro di tampone tris a un campione contenente pozzetto. Dopo l'incubazione durante la notte, raccogliere la carta nitrocellulosa da ciascuna superficie del campione e metterli in cinque millilitri di tampone tris.Vortice le carte da filtro raccolte e i campioni di materiale nanosuperficiale per cinque secondi. Raccogliere le sospensioni tampone tris dal campione e posizionarle in singole provette di raccolta fresche. Gli effetti antimicrobici utilizzando il metodo A hanno identificato la concentrazione minima e inibitoria, o MIC, di un milligrammo per millilitro di nanoparticelle di ossido di magnesio e concentrazioni minime batteriocidi, o MBC 99,9, di 1,0 e 1,6 milligrammi per millilitro di nanoparticelle di ossido di magnesio rispettivamente per Escherichia coli gram-negativo e pseudomonas aeruginosa.Lo stafilococco epidermide gram-positivo, S.Aureus e lo stafilococco aureo resistente alla meticillina, o MRSA, hanno dimostrato i valori del MIC rispettivamente di 0,5, 0,7 e un milligrammo per millilitro di nanoparticelle di ossido di magnesio. NBC 99,99 valori di 1,6 e 1,2 milligrammi per millilitro sono stati identificati rispettivamente per S.epidermis e S.aureus. Mentre MRSA non è stato ridotto oltre NBC 90.Mic di 1,2 e un milligrammo per millilitro sono stati identificati rispettivamente in specie di candida sensibili ai farmaci e resistenti ai farmaci, C albicans e C albicans resistenti al fluconazolo o FR. Al contrario, le nanoparticelle di ossido di magnesio hanno dimostrato valori MIC di uno e 0,7 milligrammi per millilitro, o C.glabrata e C glabrata resistente all'echinocandina o ER, rispettivamente. Ogni specie candidata ha raggiunto un NBC 90 da 0,7 a 1,2 milligrammi per millilitro, ma solo C.glabrata ER è stato ridotto a NBC 99,9 a 1,2 milligrammi per millilitro.Nel metodo B, l'MRSA esposto alle nanoparticelle è cresciuto esponenzialmente fino a un OD di 0,85. L'esposizione a 1,2 milligrammi per millilitro di nanoparticelle di ossido di magnesio e 6,25 milligrammi per millilitro di trimetoprim ha comportato rispettivamente l'80,2% e l'81,6% di riduzione della crescita batterica. Allo stesso modo, 2,9 milligrammi per millilitro di nanoparticelle di idrossido di magnesio hanno ridotto la crescita batterica al 70,3% L'esposizione a un microlitro per millilitro di vancomicina ha comportato una riduzione del 99,99% della crescita di MRSA, suggerendo l'attività batteriostatica delle nanoparticelle di ossido di magnesio e idrossido di magnesio.Il metodo C non ha mostrato inibizione della crescita batterica con contatto indiretto. I risultati hanno indicato che ZC21 ha avuto la più forte attività antibatterica contro l'adesione e la crescita di MRSA, per tutti i campioni testati. Nel metodo D, non è stato identificato stafilococco aureo vitale nei campioni 1.9A, 1.9 AA ed EPD o nelle loro carte da filtro accoppiate.Tuttavia, l'esposizione ai campioni EPD dopo un inginocchiamento ha ridotto la crescita batterica a poche cellule sulla superficie nanostrutturata e sulla carta da filtro ridotta. L'identificazione delle nanoparticelle e delle attività antimicrobiche di superficie nanostrutturate ha portato a ulteriori indagini nelle applicazioni di bioingegneria, comprese quelle relative alle ferite croniche e alle infezioni correlate agli impianti.

evaluation-antimicrobial-activities-nanoparticles-nanostructured

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Superfici Micropatterned per studiare le interazioni acido ialuronico con le cellule tumorali

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Ricerca

Bioingegneria

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Nanoparticelle virali per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Tumore

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

Realizzazione di un funzionalizzato magnetico batterica Nanocellulose con nanoparticelle di Ossido di Ferro

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

Preparazione di Thermoresponsive Nanostrutturati Superfici Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Produzione di nanoparticelle metalliche mediante ablazione laser pulsata nei liquidi: uno strumento per studiare le proprietà antibatteriche delle nanoparticelle

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modello del disco intervertebrale Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Sintesi di nanotubi di carbonio Multi-parete modificati con nanoparticelle di argento e valutazione dell'attività antibatterica e proprietà citotossiche

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. Thus, many novel biomaterials are being designed to mimic specific environments required for biomedical applications such as tissue engineering and controlled drug delivery. The development of materials with improved properties for the immobilization of cells or enzymes is also a current research topic in bioprocess engineering. However, one of the most desirable properties of a material in these applications is the antimicrobial capacity to avoid any undesirable infections. For this, we present easy-to-follow protocols for the antimicrobial characterization of materials based on (i) the agar disk diffusion test (diffusion method) and (ii) the ISO 22196:2007 norm to measure the antimicrobial activity on material surfaces (contact method). This protocol must be performed using Gram-positive and Gram-negative bacteria and yeast to cover a broad range of microorganisms. As an example, 4 materials with different chemical natures are tested following this protocol against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, and Candida albicans.The results of these tests exhibit non-antimicrobial activity for the first material and increasing antibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria for the other 3 materials. However, none of the 4 materials are able to inhibit the growth of Candida albicans.

We present a protocol for the antimicrobial characterization of advanced materials. Here, the antimicrobial activity on material surfaces is measured by two methods that complement each other: one is based on the agar disk diffusion test, and the other is a standard procedure based on the ISO 22196:2007 norm.

Antimicrobica caratterizzazione di materiali avanzati per applicazioni di Bioingegneria

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. ...