Name: generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells
Uploaded: 2023-01-20T13:35:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

نشكر جميع أعضاء مختبراتنا على المدخلات والمناقشات الهامة. تلقت JMP تمويلا من مؤسسة T. von Zastrow ، وجائزة FWF Wittgenstein (Z 271-B19) ، والأكاديمية النمساوية للعلوم ، والتعهد المشترك لمبادرة الأدوية المبتكرة 2 (JU) بموجب اتفاقية المنحة رقم 101005026 ، وشبكات Leducq عبر المحيط الأطلسي للتميز في أبحاث القلب والأوعية الدموية ، وبرنامج الباحث المتميز لمعهد ألين ، وبرنامج كراسي البحث الكندية 150 F18-01336 بالإضافة إلى منح المعاهد الكندية للبحوث الصحية COVID-19 F20-02343 و F20-02015.

<ol>
	<li>Okwuosa, I. S., Lewsey, S. C., Adesiyun, T., Blumenthal, R. S., Yancy, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+disparities+in+cardiovascular+disease:+Challenges+and+solutions.">Worldwide disparities in cardiovascular disease: Challenges and solutions.</a> International Journal of Cardiology. 202, 433-440 (2016).</li><li>Page, R. L., Ghushchyan, V., Nair, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+to+action:+Responding+to+the+future+forecasting+of+cardiovascular+disease+in+America.">A call to action: Responding to the future forecasting of cardiovascular disease in America.</a> American Health &amp; Drug Benefits. 4 (5), 280-288 (2011).</li><li>Ferrara, N., Davis-Smyth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+vascular+endothelial+growth+factor.">The biology of vascular endothelial growth factor.</a> Endocrine Reviews. 18 (1), 4-25 (1997).</li><li>Ishitobi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flk1-GFP+BAC+Tg+mice:+An+animal+model+for+the+study+of+blood+vessel+development.">Flk1-GFP BAC Tg mice: An animal model for the study of blood vessel development.</a> Experimental Animals. 59 (5), 615-622 (2010).</li><li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells,+pericytes+and+astrocytes.">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+creating+tissue-engineered+biomimetic+blood+vessels+using+3D+bioprinting+technology.">A novel strategy for creating tissue-engineered biomimetic blood vessels using 3D bioprinting technology.</a> Materials. 11 (9), 1581 (2018).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Wimmer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+blood+vessel+organoids+as+a+model+of+diabetic+vasculopathy.">Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy.</a> Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).</li><li>Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+arteries+to+capillaries:+Approaches+to+engineering+human+vasculature.">From arteries to capillaries: Approaches to engineering human vasculature.</a> Advanced Functional Materials. 30 (37), 1910811 (2020).</li><li>Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+blood+vessel+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (11), 3082-3100 (2019).</li><li>Monteil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SARS-CoV-2+infections+in+engineered+human+tissues+using+clinical-grade+soluble+human+ACE2.">Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2.</a> Cell. 181 (4), 905-913 (2020).</li><li>Patsch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=generation+of+vascular+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).</li><li>Bruveris, F. F., Ng, E. S., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF,+FGF2,+and+BMP4+regulate+transitions+of+mesoderm+to+endothelium+and+blood+cells+in+a+human+model+of+yolk+sac+hematopoiesis.">VEGF, FGF2, and BMP4 regulate transitions of mesoderm to endothelium and blood cells in a human model of yolk sac hematopoiesis.</a> Experimental Hematology. 103, 30-39 (2021).</li><li>Julian, L., Olson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+coiled-coil+containing+kinases+(ROCK):+Structure,+regulation,+and+functions.">Rho-associated coiled-coil containing kinases (ROCK): Structure, regulation, and functions.</a> Small GTPases. 5, 29846 (2014).</li><li>Anitua, E., Prado, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+reproducibility+in+stem+cell+and+PRP+therapies.">Addressing reproducibility in stem cell and PRP therapies.</a> Trends in Biotechnology. 37 (4), 340-344 (2019).</li><li>McMurtrey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytic+models+of+oxygen+and+nutrient+diffusion,+metabolism+dynamics,+and+architecture+optimization+in+three-dimensional+tissue+constructs+with+applications+and+insights+in+cerebral+organoids.">Analytic models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).</li><li>McKeown, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+normoxia,+physoxia+and+hypoxia+in+tumours-Implications+for+treatment+response.">Defining normoxia, physoxia and hypoxia in tumours-Implications for treatment response.</a> The British Journal of Radiology. 87 (1035), 20130676 (2014).</li><li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy.">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> British Journal of Cancer. 9 (4), 539-549 (1955).</li><li>Olive, P. L., Vikse, C., Trotter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxygen+diffusion+distance+in+tumor+cubes+using+a+fluorescent+hypoxia+probe.">Measurement of oxygen diffusion distance in tumor cubes using a fluorescent hypoxia probe.</a> International Journal of Radiation Oncology. 22 (3), 397-402 (1992).</li><li>Torres Filho, I. P., Leunig, M., Yuan, F., Intaglietta, M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+microvascular+and+interstitial+oxygen+profiles+in+a+human+tumor+in+SCID+mice.">Noninvasive measurement of microvascular and interstitial oxygen profiles in a human tumor in SCID mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2081-2085 (1994).</li><li>Lanzen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+demonstration+of+instabilities+in+oxygen+concentrations+within+the+extravascular+compartment+of+an+experimental+tumor.">Direct demonstration of instabilities in oxygen concentrations within the extravascular compartment of an experimental tumor.</a> Cancer Research. 66 (4), 2219-2223 (2006).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible,+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS One. 3 (2), 1565 (2008).</li><li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=generation+of+vascularized+brain+organoids+to+study+neurovascular+interactions.">generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions.</a> eLife. 11, 76707 (2022).</li></ol>

لا توجد علاقة بين المصالح المالية للمؤلفين والبحث الذي يتم تقديمه. تم ترخيص تقنية الأوعية الدموية العضوية لشركة Stemcell Technologies. JMP هو مؤسس ومساهم في Angios Biotech التي تطور عضويات الأوعية الدموية كعلاج لزراعة الأوعية الدموية. تم تقديم طلب براءة اختراع يتعلق بهذا العمل تحت رقم Pat. US20200199541A1 ، إدراج راينر أ. ويمر وجوزيف إم بينينجر ودونتشو كيرجاشكي كمخترعين.

قدمت الاختراقات الحديثة في مزارع الخلايا الجذعية العضوية المشتقة من إطار لنماذج أكثر تقدما وذات صلة من الناحية الفسيولوجية للأوعية الدموية البشرية. يوفر نموذج الأوعية الدموية البشرية (hBVO) المقدم هنا ، والذي تم تطويره في مختبرنا 8،10 ، وسيلة قوية لاستكشاف ليس فقط الجوانب الإضافية لتكوين الأوعية الدموية البشرية ولكن أيضا طرق جديدة لنمذجة الأمراض والعلاج التجديدي8،10،11. تم استخدام نماذج متعددة في الجسم الحي لاستكشاف تطور ونضج الأوعية الدموية وأمراض الأوعية الدموية والخلل البطاني 3,4. تجمع الأساليب المختلفة بين الخلايا المفردة والمتعددة المحددة بالنسب إما المشتقة من الخلايا الجذعية أو المعزولة من الأنسجة البالغة في الجسم الحي لإنشاء شبكات الأوعية الدموية البشرية المتماثلة 5,6. يستفيد البروتوكول المقدم هنا من مبدأ علم الأحياء التنموي والتنظيم الذاتي لإنتاج أول شبكات أوعية دموية بشرية متعددة الخلايا يمكن إنشاؤها ، في جوهرها ، من hPSCواحد 8,10.
كل خط من الخلايا الجذعية له تركيبة جينية فريدة ويختلف عن الآخرين من حيث مصادره ووظيفته واستجابته15. لذلك ، تم تطوير بروتوكول عضويات الأوعية الدموية البشرية (hBVOs) وتحسينه لضمان توافق بروتوكول قوي وقابل للتكرار مع خطوط hPSC مختلفة (>12) 8,10. الطريقة الموصوفة هنا تولد عضويات الأوعية الدموية المشتقة من hPSC على مدى 2 أسابيع. ومع ذلك ، قد تؤدي التغييرات في تكوين الوسائط و / أو التقنيات في توليد hBVO إلى شبكة أوعية غير فعالة وتوليد عضوي. كما تؤثر معدلات الانتشار المتفاوتة لخطوط الخلايا الجذعية الفردية بشكل ملحوظ على قابلية استنساخ تجارب الخلايا الجذعية15 ، وبالتالي ، الثقافات العضوية. على سبيل المثال ، عند توليد BVOs ، تخضع الخلايا الأكثر تكاثرا أو أعدادا أكبر من مجاميع اليوم 1 الكبيرة بطبيعتها لبيئات التمثيل الغذائي المختلفة ومعلمات انتشار الغاز والمغذيات. وهذا بدوره يغير أوقات التعرض لعامل النمو وكفاءته ، ودرجة التمايز والتحضير الوعائي ، والأهم من ذلك ، القدرة على تكوين شبكات الأوعية الدموية عند تضمين الركام في الكولاجين 1 ومصفوفة الغشاء القاعدي القابل للذوبان.
إن الانتشار السلبي للأكسجين وإدارة العناصر الغذائية الأساسية من بيئة خارجية ليس مثاليا لنمو الخلايا على المدى الطويل من المواد العضوية ثلاثية الأبعاد وتشكل الأنسجة في المختبر16. على الرغم من اعتمادها على عدة عوامل (أي معدل التمثيل الغذائي للأنسجة ، والتوافر البيولوجي للمغذيات والغاز ، والبيئة الثابتة أو الديناميكية) ، فقد تم تحديد حد عام 150 ميكرومتر O2 وحد انتشار المغذيات للأنسجة المزروعة في المختبر ، مع الأخذ في الاعتبار أنه ، من الناحية الفسيولوجية ، تقدم الأنسجة البشرية حبالا من الخلايا الحية في غضون 150 ميكرومتر من الأوعية الدموية المثقوبة17. على الرغم من أن مسافات انتشار الغاز والمغذيات الفعالة من 70-200 ميكرومتر قد تم اقتراحها أيضا18،19،20،21 ، فإن كثافة البناء ودرجة الحرارة ودرجة الحموضة وتكوين الوسائط تؤثر بشكل كبير على فعالية الانتشار. نظرا لتحسين مساحة السطح واتصال مستقبلات integrin-beta بعد تضمين اليوم 6 ، فإن الركام التي يبلغ قطرها 250-300 ميكرومتر تعمل بشكل أفضل من تلك التي يبلغ قطرها >500-600 ميكرومتر ، مما يؤدي إلى عملية تنبت كاملة للأوعية ونواة عضوية مكثفة إلى الحد الأدنى. وبالتالي ، فإن حجم الركام أمر بالغ الأهمية ويمكن أن يتأثر بكل من عدد الخلايا المستخدمة أثناء البذر الأولي والوقت المخصص لتشكيل الركام. تعد ألواح Microwell التي تسمح بالتحكم في حجم الركام والرقم22 بديلا قابلا للتطبيق لتقنية تكوين الركام العشوائي الناتجة عن استخدام ألواح 6 آبار ذات التعلق المنخفض للغاية في هذا البروتوكول. يعد الاتساق في التوقيت وإدارة الأحجام الإجمالية خلال أول 6 أيام من بروتوكول hBVO أحد المؤشرات الحاسمة ، إن لم يكن أكثرها أهمية ، لتطوير عضويات الأوعية الدموية الحسنة النية بنجاح.
يجب إكمال التغييرات المتوسطة في اليوم 1 (تحريض الأديم المتوسط) واليوم 4 (تحريض الأوعية الدموية) بالاقتران مع ترسيب الركام. على الرغم من أن الطرد المركزي هو بديل مغري ، إلا أن القوى الإضافية المطبقة على التجمعات ضعيفة التجميع يمكن أن تسبب تكتلا وتجميعا وقصا غير مرغوب فيه ، مما يؤثر سلبا على التمايز والنضج وفعالية النبتة في المراحل اللاحقة من البروتوكول. يعد العمل على الجليد خلال عملية تضمين اليوم 6 أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على بلمرة ECM المناسبة وتشكيل الطبقة. أثناء تضمين الركام وتحريض النبتة ، فإن تعريض ECM لدرجات حرارة أعلى من 4 درجات مئوية و / أو درجة حموضة ECM بخلاف 7.4 لن يؤثر فقط على معدلات البلمرة وسلامة طبقة ECM ولكن أيضا على كفاءة تنبت الركام المدمج. تسمح الطبيعة المرنة لمصفوفة تنبت ECM بالانفصال والنقل بسهولة من طبق الاستزراع المكون من 12 بئرا إلى سطح القطع المعقم. ستستهلك المواد العضوية الفردية التي تمت إزالتها من المصفوفة ونقلها إلى ألواح 96 بئرا منخفضة للغاية ما تبقى من ECM المحيط وتحتفظ بشبكات الأوعية الدقيقة البطانية المغلفة بالخلايا الجدارية ذاتية التنظيم مع غشاء قاعدي مستمر.
على الرغم من عدم تغطيتها في هذا الاقتراح ، إلا أن التعديلات على تركيبات الوسائط يمكن أن تكرر الأمراض التي بدورها تثير استجابات مرضية في hBVOs 8,11. حدود نمذجة الأمراض باستخدام نظام hBVO بعيدة كل البعد عن أن تكون معروفة جيدا ، وهذا بالتأكيد مجال يحتاج إلى استكشاف. إن تطبيق تقنية الأوعية الدموية العضوية الخاصة بنا في الأوعية الدموية للتركيبات العضوية اللاوعائية سابقا23 له أيضا تأثير واهتمام كبيران.

ضعف الأوعية الدموية وأمراض الأوعية الدموية الحالية مع مضاعفات ملحوظة في وظائف الجهاز. أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) هي السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم1 وهي أيضا العامل الرئيسي المساهم في زيادة تكاليف الرعاية الصحية في الولايات المتحدة. تتزايد أعداد حالات الأمراض القلبية الوعائية سنويا، وتحدث أعداد متزايدة من هذه الحالات في الفئات العمرية الأصغر (20-45 سنة)2. تم تطوير نماذج متعددة في الجسم الحي لاستكشاف تطور ونضج الأوعية الدموية وأمراض الأوعية الدموية والخلل البطاني 3,4. في الوقت الحالي ، يمكن للطرق التي تجمع بين الخلايا المفردة والمتعددة المحددة بالنسب إما المشتقة من الخلايا الجذعية أو المعزولة من الأنسجة البالغة في الجسم الحي إنشاء شبكات الأوعية الدموية التي تكرر جوانب وظيفة الأوعية الدموية البشرية والتشريح 5,6. ظهرت الأوعية الدموية كواحدة من الأنظمة الوظيفية الأولى أثناء التطور من الأديم المتوسط ، وهي تنظم إما من خلال عملية تجميع تسمى "تكوين الأوعية الدموية" أو عن طريق التوسع والتفرع من الأوعية الموجودة مسبقا ، والتي تسمى "تولد الأوعية"7.
الاستفادة من قوة علم الأحياء التنموي والتجميع الموجه ذاتيا ، Wimmer et al. ذكرت أول عضويات الأوعية الدموية البشرية 3D ذاتية التنظيم من hPSCs التي تظهر الخصائص الوظيفية والمورفولوجية والجزيئية للأوعية الدموية الدقيقةالبشرية 8. على غرار الأوعية الدمويةالبشرية 9 ، يتم إنشاء هذه hBVOs وموجودة مع البطانة ، والغشاء القاعدي المستمر ، والخلايا الجدارية المحيطة 8,10. يمكن زرع hBVOs في الجسم الحي ومفاغرة مع الدورة الدموية الذاتية. يمكن أن تخضع أيضا للنضج في المختبر وتكون بمثابة نماذج لأمراض القلب والأوعية الدموية (أي مرض السكري)8 أو انتحاء الأنسجة في عدوى الفيروسات مثل SARS-CoV-211. بينما نشرنا سابقا بروتوكولا مكتوبا10 ، لا يوجد بروتوكول فيديو متاح لهذه التقنية المعقدة.
من خلال تقدم تدريجي موجز ، يتم تحقيق تكوين hBVO من خلال التكوين الكلي ، وتحريض الأديم المتوسط باستخدام ناهض WNT ، و Chiron (CHIR99021) ، والبروتين المورفجيني للعظام - 4 (BMP4) 12,13 ، وتحريض الأوعية الدموية عبر عامل نمو بطانة الأوعية الدموية A (VEGFA) و Forskolin (Fors) 12 ، والتضمين في مصفوفة تنبت مخصصة 8,10. يتبع نضوج الأوعية الدموية وتشكيل الشبكة تضمين الركام في مصفوفة التنبت. تتشكل شبكات الأوعية البشرية هذه في غضون 2-3 أسابيع ويمكن إزالتها من مصفوفة البراعم وتنميتها في أنظمة استزراع قابلة للتطوير لمدة تصل إلى 6 أشهر. هنا ، يتم توفير إجراءات موجهة بصريا لتشكيل وتطبيق الأوعية الدموية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% sodium bicarbonate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell dissociation reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1391, 0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-rabbit IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-546-152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-sheep IgG</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647&#8211;anti-goat IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-606-147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Faster</td>
			<td></td>
			<td>SafeFAST Premium 212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-111-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF806</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td>Multifuge 4 KR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td></td>
			<td>Galaxy 170S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Basement membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (22 x 50 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3&#8211;anti-mouse IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-166-150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modefied Eagle&#39;s Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648-10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovien Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-093-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Heraguard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted contrasting tissue culture microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Vert.A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer&#160;</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>IS009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-essential amino acids (NEAAs)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (4%) in PBS</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BM-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3169S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips (6.5-10)</td>
			<td>Mquant, Millipore</td>
			<td>109543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (P1000, P200 and P20)</td>
			<td>Gilson, Integra Pipetboy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime Surface-U 96-well plates&#160;</td>
			<td>Sumilon</td>
			<td>MS9096-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PurCol&#160;</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS gel</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS mounting solution</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5, 10 and 25 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357529, 357530, 357515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>vSMC/Pericyte</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2547</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel micro spatula (rounded end)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel spoon (double-ended)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BelArt H367290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemflex medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>stem cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10639011</td>
			<td>flexible serum-free medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 &#956;L)</td>
			<td>Biozym, Surphob</td>
			<td>VT0270, VT0250, VT0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 12-well plates TC&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 6-well plates&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30720113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>mammalian cell dissociating enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low-attachment 6-well plates</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Isotemp 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>688000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells

يتم تعريف العضو العضوي على أنه نسيج متعدد الخلايا في المختبر يحاكي العضو المقابل له في الجسم الحي بحيث يمكن استخدامه لدراسة جوانب محددة من هذا العضو في طبق زراعة الأنسجة. تقدم اتساع وتطبيق أبحاث الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hPSC) بشكل كبير لتشمل الدماغ والشبكية والقناة الدمعية والقلب والرئة والأمعاء والبنكرياس والكلى والأوعية الدموية ، من بين العديد من الأنسجة الأخرى. وقد فتح تطوير طرق لتوليد الأوعية الدقيقة البشرية، على وجه التحديد، الطريق لنمذجة تطور الأوعية الدموية البشرية والمرض في المختبر ولاختبار وتحليل الأدوية الجديدة أو انتحاء الأنسجة في عدوى الفيروسات، بما في ذلك SARS-CoV-2. البروتوكولات المعقدة والطويلة التي تفتقر إلى التوجيه البصري تعيق استنساخ العديد من الكائنات العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العشوائية المتأصلة في عمليات تكوين الأعضاء والتنظيم الذاتي تستلزم إنشاء بروتوكولات بصرية لتعزيز فهم اكتساب مصير الخلية وبرمجتها. هنا ، يتم تقديم بروتوكول موجه بصريا لتوليد عضويات الأوعية الدموية البشرية 3D (BVOs) المهندسة من hPSCs. من خلال تقديم غشاء قاعدي مستمر ، وخلايا بطانة الأوعية الدموية ، والتعبير المنظم مع الخلايا الجدارية ، تظهر BVOs السمات الوظيفية والمورفولوجية والجزيئية للأوعية الدموية الدقيقة البشرية. يبدأ تكوين BVO من خلال تكوين الركام ، يليه الأديم المتوسط والحث الوعائي. يتم بدء نضوج الأوعية الدموية وتشكيل الشبكة ودعمها من خلال تضمين المجاميع في الكولاجين 3D ومصفوفة الغشاء القاعدي القابلة للذوبان. تتشكل شبكات الأوعية البشرية في غضون 2-3 أسابيع ويمكن زراعتها في أنظمة استزراع قابلة للتطوير. الأهم من ذلك ، أن BVOs المزروعة في مفاغرة الفئران التي تعاني من نقص المناعة مع دوران الفئران الداخلية وتحديدها في الشرايين الوظيفية والأوردة والشرايين. سيعمل البروتوكول الحالي الموجه بصريا على تطوير أبحاث الكائنات العضوية البشرية ، لا سيما فيما يتعلق بالأوعية الدموية في التطور الطبيعي ، والأوعية الدموية للأنسجة ، والمرض.

تم تطوير الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول خصيصا للحصول على طريقة مضبوطة ودقيقة لتوليد عضويات الأوعية الدموية البشرية من hPSCs. يمثل توليد مجاميع قطرها 30-100 ميكرومتر من ثقافات hPSC نقطة البداية للبروتوكول (الشكل 1 ، الشكل 2 ب). يتم توجيه الركام من خلال تحريض تدريجي نحو الأديم المتوسط (اليوم 1-اليوم 4) والسلالات الوعائية (اليوم 4-اليوم 6) قبل التضمين (اليوم 6) (الشكل 2A-D) ، وهو أمر ضروري لتشكيل شبكة الأوعية. يجب أن يكون نبت الوعاء شبه المتماثل شعاعيا مرئيا بواسطة d7 أو d8 (الشكل 2E) ويستمر حتى d10 (الشكل 2F ، G). إن نقل hBVOs من ECM إلى لوحات التثبيت منخفضة للغاية ذات 96 بئرا يقلل من هشاشة شبكات الانتشار ويسمح بالصيانة المستمرة في ظروف ثقافة التعليق (الشكل 2H) لمدة تصل إلى 6 أشهر. بحلول d15 ، تظهر hBVOs شبكة بطانية واسعة ومتصلة (CD31 +) محاطة بالخلايا المحيطة (PDGFR-ß +) وأكتين العضلات الملساء (SMA +) (الشكل 3A-D). يغلف الغشاء القاعدي المستمر للكولاجين الوريدي (ColIV +) شبكات الأوعية الدموية (الشكل 3E). تشكل الخلايا البطانية (CD31 + ، VE-Cadherin +) والخلايا المحيطة (PDGFR-ß +) حوالي 30٪ -35٪ و 60٪ -65٪ من مجموعات الخلايا العضوية ، على التوالي8. يحدث النبت النشط للأوعية تحت إشراف مجموعة خلايا طرفية منظمة داخليا (CD31 +) تظهر مع مورفولوجيا خلايا الطرف النموذجية ، مثل filipodiaالمفرط 8,10. يمكن رؤية عرض الخلايا الجدارية PDGFR-ß + و SMA + التي تغلف شبكات الأوعية البطانية بواسطة d15 من عملية النضج العضوي (الشكل 3A ، C). بعد الإزالة من ECM والنضج في ثقافة التعليق (أي d15) ، يمكن الدفاع عن hBVOs للتحليلات أو الزرع تحت كبسولة الكلى الفأر.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig01.jpg"> الشكل 1: رسم تخطيطي لبروتوكول hBVO يسلط الضوء على التوقيت والتقدم التدريجي. من ثقافات hPSC أو hiPSC المتجانسة على ما يبدو ، يحدث التكوين الكلي في وجود مثبط Rho-kinase Y27632. يستخدم الوسط المكمل BMP4 و CHiR لتوجيه الركام نحو مصير الأديم المتوسط. يتم استبدال وسط تحريض الأديم المتوسط ب VEGFA ووسط مكمل بفورسكولين لتحفيز الركام نحو سلالة الأوعية الدموية. الطوابير الميكانيكية والكيميائية التي تحققت من خلال تضمين الركام في الكولاجين I ومصفوفة الغشاء القاعدي القابلة للذوبان والتعرض للوسط المحتوي على VEGFA و FGF2 يؤدي إلى ظهور أوعية دموية شبه متماثلة شعاعيا من الجسم الكلي. يمكن إزالة شبكات الأوعية المتولدة من الكولاجين I والغشاء القاعدي القابل للذوبان ووضعها في ثقافة التعليق لمزيد من النضج أو التحليل أو الزرع في الجسم الحي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig02.jpg"> الشكل 2: التقدم التدريجي لجيل hBVO الذي تم التقاطه تحت برايتفيلد. (أ) التشكل النموذجي لمستعمرات hPSC (H9) في اليوم −1. (ب) توليد مجاميع hPSC (اليوم 0) على ألواح ربط منخفضة للغاية ذات 6 آبار في وجود Y-27632. (ج) تحريض الأديم المتوسط للركام باستخدام BMP4 والوسط المكمل ل ChiR (اليوم 1). يمكن أيضا ملاحظة تغييرات طفيفة في الحجم والشكل الكلي. (د) مجاميع اليوم 4 مهيأة نحو سلالة وعائية باستخدام VEGFA ووسط مكمل بفورسكولين. (ه) تنبت السفينة المبكرة في اليوم 7 ، بعد يوم واحد من تضمين الركام في مصفوفة الإنبات والتعرض لوسط تنبت VEGFA و FGF2 المكمل (اليوم 7). (و) مورفولوجيا عضوية صحية واستمرار تنبت الأوعية في اليوم 9. (ز) سفينة في مرحلة متأخرة تنبت في اليوم 10. من الناحية المثالية ، اختفت هياكل الخلايا الكثيفة في مركز العضو بحلول هذا الوقت. (H) التشكل النموذجي لعضويات الأوعية الدموية البشرية الناضجة (اليوم 15). تعمل إزالة المصفوفة المحيطة عن طريق القطع والنضج في ألواح استزراع 96 بئرا منخفضة للغاية على تشكيل الكائنات العضوية كرويا ، مع وجود شبكات الأوعية داخليا. قضبان المقياس: (أ ، ب ، ه ، و) 250 ميكرومتر ؛ (C,D) 500 ميكرومتر؛ (G ، H) 200 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig03.jpg"> الشكل 3: تلطيخ كامل التركيب لعضويات الأوعية الدموية البشرية الناضجة (اليوم 15). (أ) عرض عضويات الأوعية الدموية البشرية الناضجة (اليوم 15) مع شبكات بطانة ذاتية التنظيم (CD31 + ، أرجواني) وتغطية pericyte المحيطة (PDGFR-β+ ، سماوي) وأكتين العضلات الملساء ألفا (SMA + ، أصفر). (B) تكبير أعلى ل A يوضح بالتفصيل تعبير SMA + (الأصفر) و PDGFR-β+ (السماوي) لشبكات السفينة. (ج) عرض مفصل للتفاعل البطاني (CD31 + ، أرجواني) ، pericyte (PDGFR-β+ ، سماوي) ، وأكتين العضلات الملساء ألفا (SMA + ، أصفر). (د) تلطيخ كامل التركيب للبطانة الوعائية (CD31 + ، أرجواني) - تفاعل العضلات الملساء (SMA + ، أصفر) في مقطع عرضي (يسار) وتكبير أعلى (يمين) لعضويات الأوعية الدموية الناضجة. (ه) التكوين الذاتي الموجه للغشاء القاعدي الوعائي (Col IV+ ، التدرج الرمادي) من خلال الارتباط الوثيق للخلايا الجدارية والأنابيب البطانية. قضبان المقياس: (A,D[يسار]) 100 ميكرومتر; (B,D[right],E) 25 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

يصف هذا البروتوكول توليد الأوعية الدموية ذاتية التنظيم من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات والمستحثة. تظهر شبكات الأوعية الدموية هذه شبكة بطانية واسعة ومتصلة محاطة بالخلايا المحيطة ، وأكتين العضلات الملساء ، وغشاء قاعدي مستمر.

توليد عضويات الأوعية الدموية البشرية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

يحدد هذا البروتوكول جيلنا من عضويات الأوعية الدموية البشرية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات. يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة جوانب تكوين الأوعية الدموية ، تولد الأوعية الدموية ، أمراض الأوعية الدموية ، وكذلك أمراض الأوعية الدموية. تعد قابلية التكاثر وطبيعة الإنتاجية العالية ، بالإضافة إلى اتساقها عبر العديد من خطوط الخلايا الجذعية المختلفة ، مزايا قوية لهذه التقنية.من حيث تطبيقها ، تحدد بعض أبحاثنا السابقة استخدام عضويات الأوعية الدموية لدراسة التغيرات المورفولوجية للأوعية الدموية لمرضى السكري وتستكشف طرق العلاج الدوائي لاعتلال الأوعية الدموية السكري. الحفاظ بشكل صحيح على عدد الخلايا الجذعية الأولية ، ومنع الركام من التكتل ، وضمان قطر إجمالي شبه متجانس ، هذه عوامل أساسية لتوليد عضويات الأوعية الدموية الجيدة. ابدأ توليد الركام باستخدام الخلايا الجذعية البشرية المستزرعة متعددة القدرات ، أو hPSCs ، التي لها التقاء بنسبة 70٪.باستخدام ماصة أو نظام تفريغ ، قم بنضح وسط المزرعة واستبدله بمليلتر واحد من كاشف تفكك الخلايا قبل احتضان الخلايا لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد الحجم اللازم لوسط التجميع في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر ، باتباع الصيغة المذكورة في مخطوطة النص. بعد احتضان الخلايا ، قم بنضح كاشف تفكك الخلية قبل تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من وسط التجميع.قم بسحب المحتوى برفق لأعلى ولأسفل لإنشاء تعليق أحادي الخلية. عد الخلايا باستخدام جهاز عد الخلايا الآلي أو تحت المجهر ، واحسب العدد الإجمالي للخلايا المطلوبة لتشكيل الركام. تظهر قراءات صلاحية الخلية تعليق خلية واحدة مع مجموعات منخفضة أو معدومة.قم بنضح المادة الطافية من الأنبوب وأضف الحجم المناسب من تعليق الخلية إلى وسط التجميع في الأنبوب المخروطي عالي الوضوح من مادة البولي بروبيلين سعة 15 ملليلتر وماصة تعليق الخلية المخففة برفق لأعلى ولأسفل لضمان توزيع متجانس للخلايا. ماصة ثلاثة ملليلتر من تعليق الخلية المخففة في كل بئر مرغوب فيه من لوحة ثقافة التعلق المنخفضة للغاية المكونة من ستة آبار. ضع اللوحة في الحاضنة وقلل من أي إزعاج للحفاظ على حجم وشكل الركام.تحضير وسائط الأديم المتوسط كما هو موضح في مخطوطة النص. بعد 24 ساعة من بذر الخلايا ، أخرج صفيحة الثقافة من الحاضنة. قم بتدوير اللوحة بحركة دائرية لتجميع الركام في وسط كل بئر.باستخدام ماصة سعة ملليلتر واحد ، انقل الركام برفق مع الوسيط من كل بئر إلى الأنبوب المخروطي المقابل. اترك الركام يترسب في الأنابيب المخروطية في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بمجرد ترسيبها ، قم بنضح المادة الطافية باستخدام ماصة أو مضخة شفط عالية الحساسية بحذر ، دون الإخلال بالركام المستقر.أعد تعليق الركام في كل أنبوب بإضافة ملليلتر من وسط تحريض الأديم المتوسط. بعد ذلك ، انقل التعليق من كل أنبوب مرة أخرى إلى البئر المعني بلوحة الاستزراع ذات الستة آبار ذات التعلق المنخفض للغاية. ضع الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية واتركه حتى اليوم الرابع.في اليوم الرابع ، أخرج لوحة الاستزراع من الحاضنة ، ثم هز اللوحة بحركة دائرية لجمع الركام في وسط كل بئر. باستخدام ماصة سعة ملليلتر واحد ، انقل الركام برفق مع الوسط المحيط من كل بئر إلى الأنبوب المخروطي المقابل. اضبط مؤقتا لمدة 30 دقيقة للسماح للركام بالترسبات في الأنابيب.بمجرد ترسب الركام ، قم بإعداد ألواح الاستزراع كما هو موضح سابقا ووضعها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية حتى اليوم السادس. لتضمين الركام وتحريض تنبت الوعاء ، قم بإعداد الحجم النهائي المطلوب لمحلول المصفوفة خارج الخلية أثناء العمل على الجليد. ماصة 500 ميكرولتر من ECM في بئر واحد من لوحة 12 بئر لتشكيل الطبقة الأولى من شطيرة ECM.لضمان البلمرة الفعالة لطبقة ECM الأولى ، ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. قرب نهاية الحضانة لمدة ساعتين ، ابدأ العمل مع الركام في لوحة الثقافة. اجمع الركام في وسط كل بئر قبل استخدام ماصة سعة ملليلتر واحد لنقل الركام والوسط برفق من كل بئر إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.اترك الركام يستقر لمدة 10 إلى 15 دقيقة قبل استنشاق المادة الطافية. بعد ذلك ، احتفظ بالأنابيب المخروطية التي تحتوي على الركام على الجليد لمدة خمس دقائق. العمل بسرعة وبعناية ، أعد تعليق الركام في 500 ميكرولتر من ECM دون تكوين فقاعة.باستخدام ماصة ، ضع طبقة من تعليق ECM الكلي فوق طبقة ECM الأولى المبلمرة بالفعل داخل البئر في لوحة 12 بئرا. في غضون ذلك ، قم بإعداد وسيط الإنبات كما هو موضح في مخطوطة النص. بعد ساعتين من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، أضف ملليلترا واحدا من وسط النبتة المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية في البئر للحث على تمايز الأوعية الدموية.العمل في ظل ظروف معقمة ، استخدم الطرف المستدير لملعقة معقمة لتخفيف مصفوفة تنبت ECM التي تحتوي على شبكات الأوعية الدموية. ثم ، باستخدام ملقط معقم ونهاية مستديرة لملعقة معقمة ، انقل قرص الهلام المفكك بعناية إلى غطاء طبق استزراع 10 سم. ضع الجل على الغطاء تحت مجهر ستيريو مضبوط على التكبير والتركيز المطلوبين ، واستخدم الإبر المعقمة لقطع شبكات الأوعية الدموية المفردة ، في محاولة للحد من كمية ECM غير الوعائية التي تم الحصول عليها في هذه العملية.انقل المواد العضوية المعزولة برفق مرة أخرى إلى بئر واحدة من صفيحة ذات ستة آبار منخفضة للغاية تحتوي على ثلاثة ملليلتر من وسط الإنبات. بعد ذلك ، باستخدام ماصة سعة ملليلتر واحد ، قم بنقل المواد العضوية المفردة إلى العدد المناسب من الآبار في لوحة 96 بئر منخفضة للغاية. بمجرد النقل ، أضف 200 ميكرولتر من وسط النبتة المسخن مسبقا في كل بئر من لوحة 96 بئرا.بعد أربعة إلى ستة أيام من العزل في اللوحة المكونة من 96 بئرا ، تأكد من أن المواد العضوية تمتلك مورفولوجيا مستديرة وصحية قبل الشروع في إصلاحها وتلطيخها. تم التقاط صور للتقدم التدريجي للجيل العضوي للأوعية الدموية البشرية ، أو hBVO ، من hPSCs تحت المجال الساطع. في اليوم صفر ، تم إنشاء مجاميع يتراوح قطرها من 30 إلى 100 ميكرون من ثقافة hPSC.لوحظت تغييرات طفيفة في حجم وشكل الركام عند تحريض الأديم المتوسط في اليوم الأول ، والتي تغيرت أكثر في اليوم الرابع حيث خضعت الركام لتحضير الأوعية الدموية. يمكن ملاحظة نبت الأوعية المبكرة شبه المتماثلة شعاعيا في اليوم السابع ، بعد يوم من تضمين الركام في مصفوفة الإنبات. شوهد مورفولوجيا عضوية صحية واستمرار تنبت الأوعية في اليوم التاسع ، والذي تقدم إلى أوعية المرحلة المتأخرة التي تنبت بحلول اليوم 10 عندما اختفت هياكل الخلايا الكثيفة في مركز الأعضاء تقريبا.لوحظ بوضوح مورفولوجيا نموذجية لعضويات الأوعية الدموية البشرية الناضجة بحلول اليوم 15. أظهر تلطيخ كامل لل hBVOs الناضجة في اليوم 15 شبكة بطانية واسعة النطاق ومتصلة كانت إيجابية CD31 ومحاطة بطفيليات إيجابية PDGFR-beta وأكتين عضلي ألفا أملس إيجابي SMA. تمت ملاحظة الخلايا الجدارية الإيجابية PDGFR-beta و SMA الإيجابية التي تغلف شبكات الأوعية البطانية جيدا.كما لوحظ وجود غشاء قاعدي مستمر إيجابي للكولاجين الوريدي يغلف شبكات الأوعية. يعد ضمان البلمرة المناسبة للمصفوفة خارج الخلية أثناء خطوة التضمين أمرا بالغ الأهمية لتنبت الأوعية الدموية بشكل فعال. استخدم الباحثون تقنية الأوعية الدموية العضوية الخاصة بنا لتوليد مقصورات الأوعية الدموية المبكرة في النماذج العضوية القائمة بالفعل ، مثل الدماغ والكلى ، والتي كانت في السابق الأوعية الدموية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

التنمية، والتوسع، و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; رصد خلايا NK الإنسان من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وافرة القوة والتي يسببها الخلايا الجذعية (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

زرع المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية المشتقة من Mesoangioblast مثل السلف الميوجينيك في نماذج الماوس من تجديد العضلات

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

كفاءة توليد وتحرير إيبسكس تغذية خالية من خلايا البنكرياس البشرية باستخدام نظام كريسبر-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

عزل الخلايا الليفية الجلدية البشرية البالغين من جلد البطن وتوليد مستحث المستحثة باستخدام أسلوب غير دمج

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

التوليد القابل للتحجيم من العضيات الدماغية الناضجة من الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات والتوصيف عن طريق المناعة

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

التمايز الموجه لخلايا بودوسيت الكلى الناضجة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان في ظل ظروف محددة كيميائيا

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

الخلايا الليفية المشتقة من النسيج الضام البشري المهندسة لتطبيقات الفحص

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...