Name: generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells
Uploaded: 2023-01-20T13:35:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

We danken alle leden van onze laboratoria voor hun kritische inbreng en discussies. JMP ontving financiering van de T. von Zastrow Foundation, de FWF Wittgenstein-prijs (Z 271-B19), de Oostenrijkse Academie van Wetenschappen, de Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking (JU) onder subsidieovereenkomst nr. 101005026, Leducq Transatlantic Networks of Excellence in Cardiovascular Research, Allen Institute Distinguished Investigator Program en het Canada 150 Research Chairs Program F18-01336, evenals de Canadian Institutes of Health Research COVID-19-subsidies F20-02343 en F20-02015.

<ol>
	<li>Okwuosa, I. S., Lewsey, S. C., Adesiyun, T., Blumenthal, R. S., Yancy, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+disparities+in+cardiovascular+disease:+Challenges+and+solutions.">Worldwide disparities in cardiovascular disease: Challenges and solutions.</a> International Journal of Cardiology. 202, 433-440 (2016).</li><li>Page, R. L., Ghushchyan, V., Nair, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+to+action:+Responding+to+the+future+forecasting+of+cardiovascular+disease+in+America.">A call to action: Responding to the future forecasting of cardiovascular disease in America.</a> American Health &amp; Drug Benefits. 4 (5), 280-288 (2011).</li><li>Ferrara, N., Davis-Smyth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+vascular+endothelial+growth+factor.">The biology of vascular endothelial growth factor.</a> Endocrine Reviews. 18 (1), 4-25 (1997).</li><li>Ishitobi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flk1-GFP+BAC+Tg+mice:+An+animal+model+for+the+study+of+blood+vessel+development.">Flk1-GFP BAC Tg mice: An animal model for the study of blood vessel development.</a> Experimental Animals. 59 (5), 615-622 (2010).</li><li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells,+pericytes+and+astrocytes.">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+creating+tissue-engineered+biomimetic+blood+vessels+using+3D+bioprinting+technology.">A novel strategy for creating tissue-engineered biomimetic blood vessels using 3D bioprinting technology.</a> Materials. 11 (9), 1581 (2018).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Wimmer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+blood+vessel+organoids+as+a+model+of+diabetic+vasculopathy.">Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy.</a> Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).</li><li>Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+arteries+to+capillaries:+Approaches+to+engineering+human+vasculature.">From arteries to capillaries: Approaches to engineering human vasculature.</a> Advanced Functional Materials. 30 (37), 1910811 (2020).</li><li>Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+blood+vessel+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (11), 3082-3100 (2019).</li><li>Monteil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SARS-CoV-2+infections+in+engineered+human+tissues+using+clinical-grade+soluble+human+ACE2.">Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2.</a> Cell. 181 (4), 905-913 (2020).</li><li>Patsch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=generation+of+vascular+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).</li><li>Bruveris, F. F., Ng, E. S., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF,+FGF2,+and+BMP4+regulate+transitions+of+mesoderm+to+endothelium+and+blood+cells+in+a+human+model+of+yolk+sac+hematopoiesis.">VEGF, FGF2, and BMP4 regulate transitions of mesoderm to endothelium and blood cells in a human model of yolk sac hematopoiesis.</a> Experimental Hematology. 103, 30-39 (2021).</li><li>Julian, L., Olson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+coiled-coil+containing+kinases+(ROCK):+Structure,+regulation,+and+functions.">Rho-associated coiled-coil containing kinases (ROCK): Structure, regulation, and functions.</a> Small GTPases. 5, 29846 (2014).</li><li>Anitua, E., Prado, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+reproducibility+in+stem+cell+and+PRP+therapies.">Addressing reproducibility in stem cell and PRP therapies.</a> Trends in Biotechnology. 37 (4), 340-344 (2019).</li><li>McMurtrey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytic+models+of+oxygen+and+nutrient+diffusion,+metabolism+dynamics,+and+architecture+optimization+in+three-dimensional+tissue+constructs+with+applications+and+insights+in+cerebral+organoids.">Analytic models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).</li><li>McKeown, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+normoxia,+physoxia+and+hypoxia+in+tumours-Implications+for+treatment+response.">Defining normoxia, physoxia and hypoxia in tumours-Implications for treatment response.</a> The British Journal of Radiology. 87 (1035), 20130676 (2014).</li><li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy.">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> British Journal of Cancer. 9 (4), 539-549 (1955).</li><li>Olive, P. L., Vikse, C., Trotter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxygen+diffusion+distance+in+tumor+cubes+using+a+fluorescent+hypoxia+probe.">Measurement of oxygen diffusion distance in tumor cubes using a fluorescent hypoxia probe.</a> International Journal of Radiation Oncology. 22 (3), 397-402 (1992).</li><li>Torres Filho, I. P., Leunig, M., Yuan, F., Intaglietta, M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+microvascular+and+interstitial+oxygen+profiles+in+a+human+tumor+in+SCID+mice.">Noninvasive measurement of microvascular and interstitial oxygen profiles in a human tumor in SCID mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2081-2085 (1994).</li><li>Lanzen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+demonstration+of+instabilities+in+oxygen+concentrations+within+the+extravascular+compartment+of+an+experimental+tumor.">Direct demonstration of instabilities in oxygen concentrations within the extravascular compartment of an experimental tumor.</a> Cancer Research. 66 (4), 2219-2223 (2006).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible,+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS One. 3 (2), 1565 (2008).</li><li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=generation+of+vascularized+brain+organoids+to+study+neurovascular+interactions.">generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions.</a> eLife. 11, 76707 (2022).</li></ol>

Er is geen relatie tussen de financiële belangen van de auteurs en het gepresenteerde onderzoek. De bloedvatorganoïde technologie is in licentie gegeven aan Stemcell Technologies. J.M.P. is oprichter en aandeelhouder van Angios Biotech dat bloedvatorganoïden ontwikkelt als vaattransplantatietherapie. Een octrooiaanvraag met betrekking tot dit werk is ingediend onder Pat. No. US20200199541A1, met Reiner A. Wimmer, Josef M. Penninger en Dontscho Kerjaschki als uitvinders.

Recente doorbraken in van stamcellen afgeleide organoïde culturen hebben het kader geboden voor meer geavanceerde en fysiologisch relevante modellen van menselijke vasculatuur. Het hier gepresenteerde humane bloedvatorganoïde (hBVO) model, ontwikkeld in ons laboratorium 8,10, biedt een krachtig middel om niet alleen verdere aspecten van menselijke vasculogenese te verkennen, maar ook nieuwe wegen van ziektemodellering en regeneratieve therapie 8,10,11. Meerdere in vivo modellen zijn gebruikt om de ontwikkeling en rijping van bloedvaten, vaatziekten en endotheeldisfunctie te onderzoeken 3,4. Verschillende benaderingen combineren enkelvoudige en meervoudige afstammingsgedefinieerde cellen, hetzij afgeleid van stamcellen of geïsoleerd uit volwassen weefsels in vivo om replicatieve menselijke vasculaire netwerken te creëren 5,6. Het hier gepresenteerde protocol maakt gebruik van het principe van ontwikkelingsbiologie en zelforganisatie om de allereerste multi-cell lineage menselijke bloedvatnetwerken op te leveren die in wezen kunnen worden gegenereerd uit een enkele hPSC 8,10.
Elke stamcellijn heeft een unieke genetische samenstelling en verschilt van andere in termen van herkomst, functie en reactievermogen15. Daarom is het protocol voor humane bloedvatorganoïden (hBVO's) ontwikkeld en geoptimaliseerd om een robuuste en reproduceerbare protocolcompatibiliteit met meerdere (>12) verschillende hPSC-lijnen 8,10 te garanderen. De hier beschreven methode genereert hPSC-afgeleide bloedvatorganoïden gedurende 2 weken. Veranderingen in de mediasamenstelling en of de technieken in hBVO-generatie kunnen echter leiden tot een ineffectief vaatnetwerk en organoïdegeneratie. De variërende proliferatiesnelheden van individuele stamcellijnen hebben ook een duidelijke invloed op de reproduceerbaarheid van stamcelexperimenten15 en dus organoïde culturen. Bij het genereren van de BVO's zijn bijvoorbeeld meer proliferatieve cellen of hogere aantallen grote dag 1-aggregaten inherent onderhevig aan verschillende metabolische omgevingen en gas- en nutriëntendiffusieparameters. Dit verandert op zijn beurt de blootstellingstijden en efficiëntie van de groeifactor, de mate van differentiatie en vasculaire priming, en, belangrijker nog, het vermogen om vaatnetwerken te vormen bij het inbedden van de aggregaten in de collageen 1 en opgeloste keldermembraanmatrix.
De passieve diffusie van zuurstof en de toediening van essentiële voedingsstoffen uit een externe omgeving is niet ideaal voor de langdurige celgroei van 3D-organoïden en weefselmorfogenese in vitro16. Hoewel afhankelijk van verschillende factoren (d.w.z. de weefselstofwisseling, de biologische beschikbaarheid van voedingsstoffen en gassen, een statische of dynamische omgeving), is een algemene limiet van 150 μm O2 en diffusie van voedingsstoffen vastgesteld voor weefsels die in vitro zijn gekweekt, aangezien menselijke weefsels fysiologisch gezien koorden van levende cellen binnen 150 μm van doordrenkte bloedvaten vertonen17. Hoewel effectieve gas- en nutriëntendiffusieafstanden van 70-200 μm ook zijn voorgesteld18,19,20,21, hebben de constructdichtheid, temperatuur, pH en mediasamenstelling een aanzienlijke invloed op de diffusie-efficiëntie. Door de optimalisatie van het oppervlak en de integrine-bètareceptorcommunicatie na de inbedding van dag 6, presteren aggregaten met een diameter van 250-300 μm beter dan die met een diameter van >500-600 μm, wat resulteert in een compleet kiemproces en een minimaal gecondenseerde organoïde kern. De aggregaatgrootte is dus cruciaal en kan worden beïnvloed door zowel het aantal cellen dat tijdens het eerste zaaien wordt gebruikt als de tijd die is toegewezen voor aggregaatvorming. Microwell-platen die controle mogelijk maken over de aggregaatgrootte en nummer22 zijn een levensvatbaar alternatief voor de anders stochastische aggregaatvormingstechniek die voortvloeit uit het gebruik van ultralage bevestiging 6-putplaten in dit protocol. Consistentie in timing en het beheren van de geaggregeerde groottes tijdens de eerste 6 dagen van het hVVO-protocol is een van de, zo niet de meest cruciale indicatoren voor het succesvol ontwikkelen van bonafide bloedvatorganoïden.
Mediumveranderingen op dag 1 (mesoderminductie) en dag 4 (vasculaire inductie) moeten worden voltooid in combinatie met de sedimentatie van de aggregaten. Hoewel centrifugatie een verleidelijk alternatief is, kunnen de extra krachten die worden uitgeoefend op de zwak geassembleerde aggeraten ongewenste klonteringen, assemblage en afschuiving veroorzaken, wat een negatieve invloed heeft op differentiatie, rijping en kiemefficiëntie in de latere stadia van het protocol. Werken op ijs tijdens het inbeddingsproces van dag 6 is van cruciaal belang voor het behoud van een goede ECM-polymerisatie en laagvorming. Tijdens de inbedding en kieminductie van het aggregaat zal het blootstellen van de ECM aan temperaturen boven 4 °C en/of een andere ECM pH dan 7,4 niet alleen de polymerisatiesnelheden en de integriteit van de ECM-laag beïnvloeden, maar ook de kiemefficiëntie van de ingebedde aggregaten. De elastische aard van de ECM-kiemmatrix maakt het gemakkelijk om los te maken en te transporteren van de 12-well kweekschaal naar het steriele snijoppervlak. Individuele organoïden die uit de matrix worden verwijderd en worden overgebracht naar ultralage hechtingsplaten met 96 putten, verbruiken de resterende omringende ECM en behouden zelfgeorganiseerde muurschilderingscelgecoate endotheliale microvelannetwerken met een continu keldermembraan.
Hoewel niet behandeld in dit voorstel, kunnen wijzigingen in de mediasamenstellingen ziekten repliceren die op hun beurt pathologische reacties veroorzaken in hBVOs 8,11. De grenzen van ziektemodellering met behulp van het hBVO-systeem zijn verre van bekend, en dit is zeker een gebied dat moet worden onderzocht. De toepassing van onze bloedvatorganoïde technologie in de vascularisatie van voorheen avasculaire organoïde constructen23 is ook van aanzienlijke impact en belang.

Vasculaire disfunctie en bloedvatziekten presenteren zich met duidelijke complicaties in orgaanfuncties. Hart- en vaatziekten (CVD) zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak1 en zijn ook de belangrijkste factor die bijdraagt aan de stijgende kosten van de gezondheidszorg in de Verenigde Staten. Het aantal cvd-gevallen neemt jaarlijks toe en het aantal van deze gevallen komt steeds vaker voor in jongere leeftijdsgroepen (20-45 jaar)2. Er zijn meerdere in vivo modellen ontwikkeld om de ontwikkeling en rijping van bloedvaten, vaatziekten en endotheeldisfunctie te onderzoeken 3,4. Momenteel kunnen methoden die enkelvoudige en meervoudige afstammingsgedefinieerde cellen combineren, hetzij afgeleid van stamcellen of geïsoleerd uit volwassen weefsels in vivo, vasculaire netwerken creëren die aspecten van de menselijke vasculaire functie en anatomie repliceren 5,6. Bloedvaten zijn naar voren gekomen als een van de eerste functionele systemen tijdens de ontwikkeling van het mesoderm, en ze organiseren zich ofwel door een proces van assemblage genaamd "vasculogenese" of door expansie en vertakking van reeds bestaande bloedvaten, die "angiogenese" wordt genoemd7.
Gebruikmakend van de kracht van ontwikkelingsbiologie en zelfgestuurde assemblage, rapporteerden Wimmer et al. de eerste zelforganiserende 3D-organoïden van menselijke bloedvaten van hPSC's die de functionele, morfologische en moleculaire kenmerken van menselijke microvasculatuurvertonen 8. Net als bij menselijke vasculatuur9 worden deze hBVO's gegenereerd en aanwezig met een endotheel, een doorlopend keldermembraan en omliggende muurschilderingscellen 8,10. De hBVO's kunnen in vivo worden getransplanteerd en worden geanastomoseerd met de endogene circulatie. Ze kunnen ook in vitro rijping ondergaan en dienen als modellen voor hart- en vaatziekten (d.w.z. diabetes)8 of weefseltropisme bij virusinfecties zoals SARS-CoV-211. Hoewel we eerder een geschreven protocol10 hebben gepubliceerd, bestaat er geen beschikbaar videoprotocol voor deze anders complexe techniek.
Door middel van een beknopte stapsgewijze progressie wordt hBVO-vorming bereikt door aggregaatvorming, mesoderm-inductie met behulp van een WNT-agonist, Chiron (CHIR99021) en botmorfogeen eiwit - 4 (BMP4) 12,13, vasculaire inductie via vasculaire endotheliale groeifactor A (VEGFA) en Forskolin (Fors) 12, en inbedding in een aangepaste kiemmatrix 8,10. Vasculaire rijping en netwerkvorming volgen de inbedding van de aggregaten in de kiemmatrix. Deze menselijke vaatnetwerken vormen zich binnen 2-3 weken en kunnen tot 6 maanden uit de kiemmatrix worden verwijderd en verder worden gekweekt in schaalbare kweeksystemen. Hier worden optisch geleide procedures voorzien voor de vorming en toepassing van van menselijke stamcellen afgeleide vasculatuur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% sodium bicarbonate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell dissociation reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1391, 0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-rabbit IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-546-152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-sheep IgG</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647&#8211;anti-goat IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-606-147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Faster</td>
			<td></td>
			<td>SafeFAST Premium 212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-111-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF806</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td>Multifuge 4 KR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td></td>
			<td>Galaxy 170S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Basement membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (22 x 50 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3&#8211;anti-mouse IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-166-150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modefied Eagle&#39;s Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648-10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovien Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-093-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Heraguard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted contrasting tissue culture microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Vert.A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer&#160;</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>IS009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-essential amino acids (NEAAs)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (4%) in PBS</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BM-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3169S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips (6.5-10)</td>
			<td>Mquant, Millipore</td>
			<td>109543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (P1000, P200 and P20)</td>
			<td>Gilson, Integra Pipetboy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime Surface-U 96-well plates&#160;</td>
			<td>Sumilon</td>
			<td>MS9096-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PurCol&#160;</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS gel</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS mounting solution</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5, 10 and 25 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357529, 357530, 357515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>vSMC/Pericyte</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2547</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel micro spatula (rounded end)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel spoon (double-ended)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BelArt H367290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemflex medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>stem cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10639011</td>
			<td>flexible serum-free medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 &#956;L)</td>
			<td>Biozym, Surphob</td>
			<td>VT0270, VT0250, VT0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 12-well plates TC&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 6-well plates&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30720113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>mammalian cell dissociating enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low-attachment 6-well plates</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Isotemp 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>688000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells

Een organoïde wordt gedefinieerd als een gemanipuleerd meercellig in vitro weefsel dat zijn overeenkomstige in vivo orgaan zodanig nabootst dat het kan worden gebruikt om gedefinieerde aspecten van dat orgaan in een weefselkweekschaal te bestuderen. De breedte en toepassing van humaan pluripotent stamcel (hPSC)-afgeleid organoïde onderzoek zijn aanzienlijk gevorderd om de hersenen, het netvlies, de traanbuis, het hart, de longen, de darm, de alvleesklier, de nieren en de bloedvaten te omvatten, naast verschillende andere weefsels. De ontwikkeling van methoden voor het genereren van menselijke microvessels, in het bijzonder, heeft de weg geopend voor het modelleren van de ontwikkeling en ziekte van menselijke bloedvaten in vitro en voor het testen en analyseren van nieuwe geneesmiddelen of weefseltropisme bij virusinfecties, waaronder SARS-CoV-2. Complexe en langdurige protocollen zonder visuele begeleiding belemmeren de reproduceerbaarheid van veel van stamcellen afgeleide organoïden. Bovendien vereist de inherente stochasticiteit van organoïde vormingsprocessen en zelforganisatie het genereren van optische protocollen om het begrip van de verwerving en programmering van het lot van cellen te bevorderen. Hier wordt een visueel geleid protocol gepresenteerd voor het genereren van 3D-organoïden voor menselijke bloedvaten (BVO's) die zijn ontworpen op basis van hPSC's. Met een continu keldermembraan, vasculaire endotheelcellen en georganiseerde articulatie met muurschilderingscellen, vertonen BVO's de functionele, morfologische en moleculaire kenmerken van menselijke microvasculatuur. BVO-vorming wordt geïnitieerd door aggregaatvorming, gevolgd door mesoderm en vasculaire inductie. Vasculaire rijping en netwerkvorming worden geïnitieerd en ondersteund door het inbedden van aggregaten in een 3D-collageen en opgeloste keldermembraanmatrix. Menselijke vaatnetwerken vormen zich binnen 2-3 weken en kunnen verder worden uitgebreid in schaalbare kweeksystemen. Belangrijk is dat BVO's worden getransplanteerd in immuungecompromitteerde muizenanastomose met de endogene muiscirculatie en specificeren in functionele slagaders, aderen en arteriolen. Het huidige visueel geleide protocol zal het onderzoek naar menselijke organoïden bevorderen, met name met betrekking tot bloedvaten in normale ontwikkeling, weefselvascularisatie en ziekte.

De stappen die in dit protocol worden beschreven, zijn specifiek ontwikkeld om een gecontroleerde en nauwkeurige methode op te leveren voor het genereren van menselijke bloedvatorganoïden uit hPSC's. Het genereren van aggregaten met een diameter van 30-100 μm uit hPSC-culturen markeert het startpunt van het protocol (figuur 1, figuur 2B). De aggregaten worden geleid door stapsgewijze inducties naar mesoderm (dag 1-dag 4) en vasculaire afstammingslijnen (dag 4-dag 6) voorafgaand aan inbedding (dag 6) (figuur 2A-D), wat nodig is voor de vorming van het vaatnetwerk. De ontkieming van bijna-radiaal symmetrische vaten moet zichtbaar zijn met d7 of d8 (figuur 2E) en doorlopen tot en met d10 (figuur 2F,G). De explantatie van de hBVO's van de ECU naar de 96-well ultra-low attachment plates vermindert de kwetsbaarheid van de kiemnetwerken en maakt continu onderhoud in suspensiecultuur (figuur 2H) gedurende maximaal 6 maanden mogelijk. Tegen d15 vertonen de hBVO's een uitgebreid en verbonden endotheelnetwerk (CD31+) omgeven door pericyten (PDGFR-ß+) en gladde spieractine (SMA+) (figuur 3A-D). Een continu collageen IV (ColIV+) keldermembraan omhult de vaatnetwerken (figuur 3E). Endotheelcellen (CD31+, VE-Cadherin+) en pericyten (PDGFR-ß+) vormen respectievelijk ongeveer 30%-35% en 60%-65% van de organoïde celpopulaties8. Het actief ontkiemen van de vaten vindt plaats onder leiding van een endogeen georganiseerde tipcel (CD31+) populatie die zich presenteert met typische tipcelmorfologie, zoals overmatige filipodia 8,10. De presentatie van PDGFR-ß+ en SMA+ muurschilderingscellen die de endotheelvatnetwerken inkapselen, is te zien aan d15 van het organoïde rijpingsproces (figuur 3A,C). Na verwijdering uit de ECM en rijping in suspensiecultuur (d.w.z. d15) zijn de hBVO's houdbaar voor respectievelijke analyses of transplantatie onder de niercapsule van de muis.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig01.jpg"> Figuur 1: Schema van het hVVO-protocol met de timing en stapsgewijze progressie. Van schijnbaar homogene hPSC- of hiPSC-culturen vindt aggregaatvorming plaats in aanwezigheid van de Rho-kinaseremmer Y27632. BMP4 en CHiR-aangevuld medium wordt gebruikt om de aggregaten te instrueren naar het mesodermale lot. Mesoderm inductiemedium wordt vervangen door VEGFA en forskoline-aangevuld medium om de aggregaten te stimuleren in de richting van een vasculaire afstamming. Mechanische en chemische wachtrijen bereikt door de inbedding van de aggregaten in een collageen I en opgeloste keldermembraanmatrix en blootstelling aan VEGFA- en FGF2-bevattend medium resulteert in bijna radiaal symmetrische vasculaire ontkieming uit het aggregaatlichaam. De gegenereerde vaatnetwerken kunnen worden verwijderd uit het collageen I en het opgeloste keldermembraan en in suspensiecultuur worden geplaatst voor verdere rijping, analyse of transplantatie in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig02.jpg"> Figuur 2: Stapsgewijze progressie van de hBVO-generatie vastgelegd onder brightfield. (A) Typische morfologie van hPSC (H9) kolonies op dag −1. (B) Generatie van hPSC-aggregaten (dag 0) op 6-well ultra-low attachment plates in aanwezigheid van Y-27632. (C) De mesodermale inductie van aggregaten met behulp van BMP4 en ChiR-aangevuld medium (dag 1). Subtiele veranderingen in de totale grootte en vorm kunnen ook worden waargenomen. (D) Dag 4 aggregaten geprepareerd op een vasculaire afstamming met behulp van VEGFA en forskoline-aangevuld medium. (E) Vroege kiemvaten op dag 7, één dag na inbedding van de aggregaten in de kiemmatrix en blootstelling aan VEGFA en FGF2-aangevuld kiemmedium (dag 7). (F) Gezonde organoïde morfologie en voortgezette vaatkieming op dag 9. (G) Laat stadium van het schip dat op dag 10 ontkiemt. Idealiter zijn de dichte celstructuren in het organoïde centrum tegen die tijd verdwenen. (H) Typische morfologie van volwassen (dag 15) menselijke bloedvatorganoïden. De verwijdering van de omringende matrix door snijden en rijping in ultralage aanhechtingskweekplaten met 96 putten vormt de organoïden bolvormig, waarbij de vaatnetwerken intern zijn ondergebracht. Schaalstaven: (A,B,E,F) 250 μm; (C,D) 500 μm; (G,H) 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig03.jpg"> Figuur 3: Whole-mount kleuring van volwassen (dag 15) menselijke bloedvat organoïden. (A) Presentatie van volwassen (dag 15) menselijke bloedvatorganoïden met zelfgeorganiseerde endotheel (CD31+, magenta) netwerken en omliggende pericyten (PDGFR-β+, cyaan) en alfa-gladde spieractine (SMA+, geel) dekking. (B) Hogere vergroting van A met details over de SMA+ (geel) en PDGFR-β+ (cyaan) expressie van de scheepsnetwerken. (C) Gedetailleerde presentatie van endotheel (CD31+, magenta), pericyt (PDGFR-β+, cyaan) en alfa-gladde spieractine (SMA+, geel) interactie. (D) Whole-mount kleuring van de vaat endotheliale (CD31 +, magenta) - gladde spier (SMA +, geel) interactie in een doorsnede (links) en een hogere vergroting (rechts) van volwassen bloedvat organoïden. (E) Zelfgestuurde vorming van een vasculaire keldermembraan (Col IV +, grijswaarden) door de nauwe associatie van de muurschilderingscellen en endotheelbuizen. Schaalbalken: (A,D[links]) 100 μm; (B,D[rechts],E) 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Dit protocol beschrijft de generatie van zelforganiserende bloedvaten uit menselijke pluripotente en geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze bloedvatnetwerken vertonen een uitgebreid en verbonden endotheelnetwerk omgeven door pericyten, gladde spieractine en een continu keldermembraan.

Generatie van menselijke bloedvatorganoïden uit pluripotente stamcellen

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Dit protocol schetst onze generatie van menselijke bloedvatorganoïden uit pluripotente stamcellen. Deze technologie kan worden gebruikt om aspecten van vasculogenese, angiogenese, vaatziekten en vasculaire pathologieën te bestuderen. De reproduceerbaarheid en hoge doorvoer, evenals de consistentie over veel verschillende stamcellijnen, zijn sterke voordelen van deze techniek.In termen van hun toepassing, schetst een deel van ons eerdere onderzoek het gebruik van bloedvatorganoïden om de morfologische veranderingen voor diabetische patiëntenvasculatuur te bestuderen en verkent het de mogelijkheden voor medicamenteuze behandeling voor diabetische vasculopathie. Het goed onderhouden van de initiële stamcelpopulatie, het voorkomen van het samenklonteren van de aggregaten en het zorgen voor een bijna homogene aggregaatdiameter, dit zijn essentiële factoren voor het genereren van goede bloedvatorganoïden. Begin met het genereren van aggregaten met behulp van gekweekte menselijke pluripotente stamcellen, of hPSC's, met 70% confluentie.Gebruik een pipet of een vacuümsysteem om het kweekmedium op te zuigen en te vervangen door één milliliter celdissociatiereagens voordat u de cellen gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius incubeert. Bereid ondertussen het benodigde volume aggregatiemedium voor in een conische buis van 15 milliliter, volgens de formulering die in het tekstmanuscript wordt vermeld. Na het incuberen van de cellen, zuigt u het celdissociatiereagens op voordat u de cellen in één milliliter aggregatiemedium ophangt.Pipetteer de inhoud voorzichtig op en neer om een eencellige suspensie te creëren. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerd celtelapparaat of onder een microscoop en bereken het totale aantal cellen dat nodig is voor de vorming van aggregaten. De uitlezing van de levensvatbaarheid van de cel toont eencellige suspensie met lage tot geen clusters.Zuig het supernatant uit de buis en voeg het juiste volume van de celsuspensie toe aan het aggregatiemedium in de 15 milliliter zeer heldere polypropyleen conische buis en pipetteer de verdunde celsuspensie voorzichtig op en neer om een homogene celverdeling te garanderen. Pipetteer drie milliliter van de verdunde celsuspensie in elke gewenste put van de zes-well ultra-low attachment cultuurplaat. Plaats de plaat in de incubator en minimaliseer eventuele verstoringen om de grootte en vorm van aggregaten te behouden.Bereid de mesoderm media voor zoals beschreven in het tekstmanuscript. Haal 24 uur na het zaaien van de cellen de kweekplaat uit de incubator. Draai de plaat in een cirkelvormige beweging om de aggregaten in het midden van elke put te accumuleren.Breng met behulp van een pipet van één milliliter de aggregaten met het medium van elke put voorzichtig over in de overeenkomstige conische buis. Laat de aggregaten gedurende een uur bij kamertemperatuur in de conische buizen bezinken. Eenmaal gesedimenteerd, zuig het supernatant voorzichtig op met een pipet of een zeer gevoelige aanzuigpomp, zonder de bezonken aggregaten te verstoren.Resuspendie van de aggregaten in elke buis door toevoeging van twee milliliter mesoderm inductiemedium. Breng vervolgens de suspensie van elke buis terug in de respectievelijke put van de ultralage bevestiging van de zes-well kweekplaat. Plaats de plaat in de couveuse op 37 graden Celsius en laat hem staan tot dag vier.Haal op dag vier de kweekplaat uit de incubator en schud de plaat vervolgens in een cirkelvormige beweging om de aggregaten in het midden van elke put te verzamelen. Breng met behulp van een pipet van één milliliter de aggregaten met het omringende medium voorzichtig over van elke put in de overeenkomstige conische buis. Stel een timer in voor 30 minuten om de aggregaten in de buizen te laten bezinken.Zodra de aggregaten bezinken, bereidt u de kweekplaten voor zoals eerder aangetoond en plaatst u ze in de incubator bij 37 graden Celsius tot dag zes. Voor geaggregeerde inbedding en vatkieminductie, bereid het gewenste eindvolume van de extracellulaire matrixoplossing voor terwijl u op ijs werkt. Pipetteer 500 microliter van de ECU in één put van een 12-well plaat om de eerste laag van de ECM sandwich te vormen.Om een effectieve polymerisatie van de eerste ECM-laag te garanderen, plaatst u de plaat gedurende twee uur in een incubator bij 37 graden Celsius. Begin tegen het einde van de twee uur durende incubatie met de aggregaten in de kweekplaat. Verzamel de aggregaten in het midden van elke put voordat u een pipet van één milliliter gebruikt om de aggregaten en het medium van elke put voorzichtig over te brengen in een overeenkomstige conische buis van 15 milliliter.Laat de aggregaten 10 tot 15 minuten bezinken voordat je het supernatant aanzuigt. Houd daarna de conische buizen met de aggregaten vijf minuten op ijs. Werk snel en voorzichtig en resuspendien de aggregaten in 500 microliter ECM zonder bubbelvorming.Leg met behulp van een pipet de ECM-aggregaatsuspensie bovenop de reeds gepolymeriseerde eerste ECM-laag in de put in de 12-putplaat. Bereid in de tussentijd het kiemmedium voor zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voeg na twee uur incubatie bij 37 graden Celsius een milliliter kiemmedium voorverwarmd tot 37 graden Celsius toe aan de put om bloedvatdifferentiatie te induceren.Gebruik onder steriele omstandigheden het afgeronde uiteinde van een steriele spatel om de ECM-kiemmatrix met de vasculaire netwerken los te maken. Breng vervolgens met behulp van een steriele tang en het afgeronde uiteinde van een steriele spatel de losgemaakte gelschijf voorzichtig over op het deksel van een kweekschaal van 10 centimeter. Plaats de gel op het deksel onder een stereomicroscoop die is aangepast aan de gewenste vergroting en focus, en gebruik steriele naalden om enkele bloedvatnetwerken uit te snijden, in een poging de hoeveelheid niet-gevasculariseerde ECM die tijdens het proces wordt verkregen, te beperken.Breng de geïsoleerde organoïden voorzichtig terug in één put van een ultralage aanhechtingsplaat met zes putten die drie milliliter kiemmedium bevat. Breng vervolgens met behulp van een pipet van één milliliter de enkele organoïden over naar het juiste aantal putten in een ultralage 96-putplaat. Voeg na overdracht 200 microliter voorverwarmd kiemmedium toe aan elke put van de 96-putplaat.Vier tot zes dagen na isolatie in de 96-putplaat, zorg ervoor dat de organoïden een ronde en gezonde morfologie bezitten voordat ze worden gefixeerd en gekleurd. Beelden van stapsgewijze progressie van de menselijke bloedvatorganoïde, of hBVO, generatie van hPSC's werden vastgelegd onder helder veld. Op dag nul werden aggregaten met een diameter van 30 tot 100 micron gegenereerd uit de hPSC-cultuur.Subtiele veranderingen in de grootte en vorm van de aggregaten werden waargenomen bij mesoderminductie op dag één, die verder veranderde op dag vier toen de aggregaten vasculaire priming ondergingen. Bijna radiaal-symmetrisch vroeg kiemen van vaten kan worden waargenomen op dag zeven, een dag na het inbedden van de aggregaten in de kiemmatrix. Gezonde organoïde morfologie en voortgezette vaatkieming werd gezien op dag negen, die zich ontwikkelde tot vaten in een laat stadium die ontkiemden op dag 10 toen de dichte celstructuren in het organoïde centrum bijna verdwenen.Morfologie typisch voor volwassen menselijke bloedvatorganoïden werd duidelijk waargenomen op dag 15. Hele mount kleuring van de volwassen hBVO's op dag 15 vertoonde en uitgebreid en verbonden endotheelnetwerk dat CD31-positief was en omringd door PDGFR-bèta-positieve parasieten en SMA-positieve alfa-gladde spieractine. De PDGFR-bèta-positieve en SMA-positieve muurschilderingscellen die de endotheelvatnetwerken inkapselen, worden goed waargenomen.Een continu collageen IV-positief keldermembraan dat de vaatnetwerken omhult, werd ook waargenomen. Zorgen voor een goede polymerisatie van de extracellulaire matrix tijdens de inbeddingsstap is van cruciaal belang voor een effectieve ontkieming van bloedvaten. Onderzoekers hebben onze bloedvatorganoïde technologie gebruikt om vroege vasculaire compartimenten te genereren in reeds gevestigde organoïde modellen, zoals hersenen en nieren, die eerder avasculair waren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Ontwikkeling, uitbreiding en<em&gt; In vivo</em&gt; Controle van Human NK cellen uit menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) en en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Schaalbare generatie van volwassen cerebellar organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen en karakterisering door immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Geleide differentiatie van rijpe nierpodocyten uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen onder chemisch gedefinieerde omstandigheden

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblast afgeleide human engineered bindweefsel voor screeningstoepassingen

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...