Generatie van menselijke bloedvatorganoïden uit pluripotente stamcellen

Dit protocol schetst onze generatie van menselijke bloedvatorganoïden uit pluripotente stamcellen. Deze technologie kan worden gebruikt om aspecten van vasculogenese, angiogenese, vaatziekten en vasculaire pathologieën te bestuderen. De reproduceerbaarheid en hoge doorvoer, evenals de consistentie over veel verschillende stamcellijnen, zijn sterke voordelen van deze techniek.

In termen van hun toepassing, schetst een deel van ons eerdere onderzoek het gebruik van bloedvatorganoïden om de morfologische veranderingen voor diabetische patiëntenvasculatuur te bestuderen en verkent het de mogelijkheden voor medicamenteuze behandeling voor diabetische vasculopathie. Het goed onderhouden van de initiële stamcelpopulatie, het voorkomen van het samenklonteren van de aggregaten en het zorgen voor een bijna homogene aggregaatdiameter, dit zijn essentiële factoren voor het genereren van goede bloedvatorganoïden. Begin met het genereren van aggregaten met behulp van gekweekte menselijke pluripotente stamcellen, of hPSC's, met 70% confluentie.

Gebruik een pipet of een vacuümsysteem om het kweekmedium op te zuigen en te vervangen door één milliliter celdissociatiereagens voordat u de cellen gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius incubeert. Bereid ondertussen het benodigde volume aggregatiemedium voor in een conische buis van 15 milliliter, volgens de formulering die in het tekstmanuscript wordt vermeld. Na het incuberen van de cellen, zuigt u het celdissociatiereagens op voordat u de cellen in één milliliter aggregatiemedium ophangt.

Pipetteer de inhoud voorzichtig op en neer om een eencellige suspensie te creëren. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerd celtelapparaat of onder een microscoop en bereken het totale aantal cellen dat nodig is voor de vorming van aggregaten. De uitlezing van de levensvatbaarheid van de cel toont eencellige suspensie met lage tot geen clusters.

Zuig het supernatant uit de buis en voeg het juiste volume van de celsuspensie toe aan het aggregatiemedium in de 15 milliliter zeer heldere polypropyleen conische buis en pipetteer de verdunde celsuspensie voorzichtig op en neer om een homogene celverdeling te garanderen. Pipetteer drie milliliter van de verdunde celsuspensie in elke gewenste put van de zes-well ultra-low attachment cultuurplaat. Plaats de plaat in de incubator en minimaliseer eventuele verstoringen om de grootte en vorm van aggregaten te behouden.

Bereid de mesoderm media voor zoals beschreven in het tekstmanuscript. Haal 24 uur na het zaaien van de cellen de kweekplaat uit de incubator. Draai de plaat in een cirkelvormige beweging om de aggregaten in het midden van elke put te accumuleren.

Breng met behulp van een pipet van één milliliter de aggregaten met het medium van elke put voorzichtig over in de overeenkomstige conische buis. Laat de aggregaten gedurende een uur bij kamertemperatuur in de conische buizen bezinken. Eenmaal gesedimenteerd, zuig het supernatant voorzichtig op met een pipet of een zeer gevoelige aanzuigpomp, zonder de bezonken aggregaten te verstoren.

Resuspendie van de aggregaten in elke buis door toevoeging van twee milliliter mesoderm inductiemedium. Breng vervolgens de suspensie van elke buis terug in de respectievelijke put van de ultralage bevestiging van de zes-well kweekplaat. Plaats de plaat in de couveuse op 37 graden Celsius en laat hem staan tot dag vier.

Haal op dag vier de kweekplaat uit de incubator en schud de plaat vervolgens in een cirkelvormige beweging om de aggregaten in het midden van elke put te verzamelen. Breng met behulp van een pipet van één milliliter de aggregaten met het omringende medium voorzichtig over van elke put in de overeenkomstige conische buis. Stel een timer in voor 30 minuten om de aggregaten in de buizen te laten bezinken.

Zodra de aggregaten bezinken, bereidt u de kweekplaten voor zoals eerder aangetoond en plaatst u ze in de incubator bij 37 graden Celsius tot dag zes. Voor geaggregeerde inbedding en vatkieminductie, bereid het gewenste eindvolume van de extracellulaire matrixoplossing voor terwijl u op ijs werkt. Pipetteer 500 microliter van de ECU in één put van een 12-well plaat om de eerste laag van de ECM sandwich te vormen.

Om een effectieve polymerisatie van de eerste ECM-laag te garanderen, plaatst u de plaat gedurende twee uur in een incubator bij 37 graden Celsius. Begin tegen het einde van de twee uur durende incubatie met de aggregaten in de kweekplaat. Verzamel de aggregaten in het midden van elke put voordat u een pipet van één milliliter gebruikt om de aggregaten en het medium van elke put voorzichtig over te brengen in een overeenkomstige conische buis van 15 milliliter.

Laat de aggregaten 10 tot 15 minuten bezinken voordat je het supernatant aanzuigt. Houd daarna de conische buizen met de aggregaten vijf minuten op ijs. Werk snel en voorzichtig en resuspendien de aggregaten in 500 microliter ECM zonder bubbelvorming.

Leg met behulp van een pipet de ECM-aggregaatsuspensie bovenop de reeds gepolymeriseerde eerste ECM-laag in de put in de 12-putplaat. Bereid in de tussentijd het kiemmedium voor zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voeg na twee uur incubatie bij 37 graden Celsius een milliliter kiemmedium voorverwarmd tot 37 graden Celsius toe aan de put om bloedvatdifferentiatie te induceren.

Gebruik onder steriele omstandigheden het afgeronde uiteinde van een steriele spatel om de ECM-kiemmatrix met de vasculaire netwerken los te maken. Breng vervolgens met behulp van een steriele tang en het afgeronde uiteinde van een steriele spatel de losgemaakte gelschijf voorzichtig over op het deksel van een kweekschaal van 10 centimeter. Plaats de gel op het deksel onder een stereomicroscoop die is aangepast aan de gewenste vergroting en focus, en gebruik steriele naalden om enkele bloedvatnetwerken uit te snijden, in een poging de hoeveelheid niet-gevasculariseerde ECM die tijdens het proces wordt verkregen, te beperken.

Breng de geïsoleerde organoïden voorzichtig terug in één put van een ultralage aanhechtingsplaat met zes putten die drie milliliter kiemmedium bevat. Breng vervolgens met behulp van een pipet van één milliliter de enkele organoïden over naar het juiste aantal putten in een ultralage 96-putplaat. Voeg na overdracht 200 microliter voorverwarmd kiemmedium toe aan elke put van de 96-putplaat.

Vier tot zes dagen na isolatie in de 96-putplaat, zorg ervoor dat de organoïden een ronde en gezonde morfologie bezitten voordat ze worden gefixeerd en gekleurd. Beelden van stapsgewijze progressie van de menselijke bloedvatorganoïde, of hBVO, generatie van hPSC's werden vastgelegd onder helder veld. Op dag nul werden aggregaten met een diameter van 30 tot 100 micron gegenereerd uit de hPSC-cultuur.

Subtiele veranderingen in de grootte en vorm van de aggregaten werden waargenomen bij mesoderminductie op dag één, die verder veranderde op dag vier toen de aggregaten vasculaire priming ondergingen. Bijna radiaal-symmetrisch vroeg kiemen van vaten kan worden waargenomen op dag zeven, een dag na het inbedden van de aggregaten in de kiemmatrix. Gezonde organoïde morfologie en voortgezette vaatkieming werd gezien op dag negen, die zich ontwikkelde tot vaten in een laat stadium die ontkiemden op dag 10 toen de dichte celstructuren in het organoïde centrum bijna verdwenen.

Morfologie typisch voor volwassen menselijke bloedvatorganoïden werd duidelijk waargenomen op dag 15. Hele mount kleuring van de volwassen hBVO's op dag 15 vertoonde en uitgebreid en verbonden endotheelnetwerk dat CD31-positief was en omringd door PDGFR-bèta-positieve parasieten en SMA-positieve alfa-gladde spieractine. De PDGFR-bèta-positieve en SMA-positieve muurschilderingscellen die de endotheelvatnetwerken inkapselen, worden goed waargenomen.

Een continu collageen IV-positief keldermembraan dat de vaatnetwerken omhult, werd ook waargenomen. Zorgen voor een goede polymerisatie van de extracellulaire matrix tijdens de inbeddingsstap is van cruciaal belang voor een effectieve ontkieming van bloedvaten. Onderzoekers hebben onze bloedvatorganoïde technologie gebruikt om vroege vasculaire compartimenten te genereren in reeds gevestigde organoïde modellen, zoals hersenen en nieren, die eerder avasculair waren.