Name: generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells
Uploaded: 2023-01-20T13:35:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Nous remercions tous les membres de nos laboratoires pour leurs contributions et leurs discussions essentielles. JMP a reçu un financement de la fondation T. von Zastrow, du prix FWF Wittgenstein (Z 271-B19), de l’Académie autrichienne des sciences, de l’entreprise commune Innovative Medicines Initiative 2 (JU) dans le cadre de la convention de subvention no 101005026, des réseaux transatlantiques d’excellence en recherche cardiovasculaire Leducq, du programme de chercheur émérite de l’Institut Allen, du programme des chaires de recherche Canada 150 F18-01336, ainsi que des subventions F20-02343 et F20-02015 des Instituts de recherche en santé du Canada.

<ol>
	<li>Okwuosa, I. S., Lewsey, S. C., Adesiyun, T., Blumenthal, R. S., Yancy, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+disparities+in+cardiovascular+disease:+Challenges+and+solutions.">Worldwide disparities in cardiovascular disease: Challenges and solutions.</a> International Journal of Cardiology. 202, 433-440 (2016).</li><li>Page, R. 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Il n’y a aucune relation entre les intérêts financiers des auteurs et la recherche présentée. La technologie organoïde des vaisseaux sanguins a été concédée sous licence à Stemcell Technologies. J.M.P. est l’un des fondateurs et actionnaires d’Angios Biotech qui développe des organoïdes de vaisseaux sanguins comme thérapie de transplantation vasculaire. Une demande de brevet liée à ce travail a été déposée sous le numéro Pat. US20200199541A1, énumérant Reiner A. Wimmer, Josef M. Penninger et Dontscho Kerjaschki comme inventeurs.

Des percées récentes dans les cultures organoïdes dérivées de cellules souches ont fourni le cadre pour des modèles plus avancés et physiologiquement pertinents du système vasculaire humain. Le modèle organoïde des vaisseaux sanguins humains (hBVO) présenté ici, développé dans notre laboratoire 8,10, fournit un moyen puissant d’explorer non seulement d’autres aspects de la vasculogenèse humaine, mais aussi de nouvelles voies de modélisation de la maladie et de thérapie régénérative 8,10,11. Plusieurs modèles in vivo ont été utilisés pour explorer le développement et la maturation des vaisseaux sanguins, des maladies vasculaires et du dysfonctionnement endothélial 3,4. Diverses approches combinent des cellules définies par une lignée unique et multiple, dérivées de cellules souches, soit isolées de tissus adultes in vivo pour créer des réseaux vasculaires humains réplicatifs 5,6. Le protocole présenté ici tire parti du principe de la biologie du développement et de l’auto-organisation pour produire les tout premiers réseaux de vaisseaux sanguins humains de lignées multicellulaires pouvant être générés, en substance, à partir d’un seul hPSC 8,10.
Chaque lignée de cellules souches a une constitution génétique unique et diffère des autres en termes de provenance, de fonction et de réactivité15. Par conséquent, le protocole pour les organoïdes des vaisseaux sanguins humains (hBVO) a été développé et optimisé pour assurer une compatibilité de protocole robuste et reproductible avec plusieurs (>12) lignées différentes de CSPh 8,10. La méthode décrite ici génère des organoïdes de vaisseaux sanguins dérivés de hPSC sur 2 semaines. Cependant, des modifications de la composition du milieu et/ou des techniques de génération d’hBVO peuvent entraîner une inefficacité du réseau de vaisseaux et de la génération d’organoïdes. Les taux de prolifération variables des lignées individuelles de cellules souches ont également une incidence marquée sur la reproductibilité de l’expérimentation sur les cellules souches15 et, par conséquent, des cultures organoïdes. Par exemple, lors de la génération des BVO, des cellules plus prolifératives ou un nombre plus élevé de grands agrégats du jour 1 sont intrinsèquement soumis à différents environnements métaboliques et paramètres de diffusion des gaz et des nutriments. Ceci, à son tour, modifie les temps d’exposition et l’efficacité des facteurs de croissance, le degré de différenciation et d’amorçage vasculaire et, surtout, la capacité de former des réseaux de vaisseaux lors de l’incorporation des agrégats dans le collagène 1 et la matrice membranaire basale solubilisée.
La diffusion passive de l’oxygène et l’administration de nutriments essentiels provenant d’un environnement extérieur ne sont pas idéales pour la croissance cellulaire à long terme des organoïdes 3D et la morphogenèse tissulaire in vitro16. Bien que dépendant de plusieurs facteurs (c.-à-d. le taux métabolique tissulaire, la biodisponibilité des nutriments et des gaz, un environnement statique ou dynamique), une limite générale de diffusion de 150 μmO2 et des nutriments a été établie pour les tissus cultivés in vitro, étant donné que, physiologiquement, les tissus humains présentent des cordons de cellules vivantes à moins de 150 μm des vaisseaux sanguins perfusés17. Bien que des distances effectives de diffusion des gaz et des nutriments de 70 à 200 μm aient également été proposées18,19,20,21, la densité de construction, la température, le pH et la composition du milieu ont un impact significatif sur l’efficacité de la diffusion. En raison de l’optimisation de la surface et de la communication intégrine-récepteur bêta après l’encastrement du jour 6, les agrégats de 250 à 300 μm de diamètre donnent de meilleurs résultats que ceux de > 500 à 600 μm de diamètre, ce qui entraîne un processus complet de germination des vaisseaux et un noyau organoïde peu condensé. Ainsi, la taille de l’agrégat est cruciale et peut être affectée à la fois par le nombre de cellules utilisées lors de l’ensemencement initial et par le temps alloué à la formation des agrégats. Les plaques de micropuits qui permettent de contrôler la taille des agrégats et le nombre22 sont une alternative viable à la technique de formation d’agrégats autrement stochastique résultant de l’utilisation de plaques à 6 puits à très faible attachement dans ce protocole. La cohérence dans le calendrier et la gestion des tailles agrégées au cours des 6 premiers jours du protocole hBVO est l’un des indicateurs cruciaux, sinon le plus, du développement réussi d’organoïdes de vaisseaux sanguins de bonne foi.
Les changements de milieu au jour 1 (induction du mésoderme) et au jour 4 (induction vasculaire) doivent être effectués en combinaison avec la sédimentation des agrégats. Bien que la centrifugation soit une alternative tentante, les forces supplémentaires appliquées aux exagérations faiblement assemblées peuvent provoquer une agglutination, un assemblage et un cisaillement indésirables, ce qui a un impact négatif sur la différenciation, la maturation et l’efficacité de la germination dans les dernières étapes du protocole. Travailler sur la glace pendant le processus d’encastrement du jour 6 est essentiel pour préserver la polymérisation ECM et la formation de couches. Pendant l’encastrement des agrégats et l’induction de germination, l’exposition de l’ECM à des températures supérieures à 4 °C et/ou à un pH ECM autre que 7,4 affectera non seulement les taux de polymérisation et l’intégrité de la couche ECM, mais aussi l’efficacité de germination des agrégats incorporés. La nature élastique de la matrice de germination ECM permet un détachement et un transport faciles de la boîte de culture à 12 puits à la surface de coupe stérile. Les organoïdes individuels retirés de la matrice et transférés sur des plaques à 96 puits à très faible fixation consommeront l’ECM environnant restant et conserveront des réseaux de microvaisseaux endothéliaux auto-organisés recouverts de cellules murales avec une membrane basale continue.
Bien qu’elles ne soient pas couvertes par la présente proposition, les modifications apportées à la composition des milieux peuvent reproduire des maladies qui, à leur tour, provoquent des réponses pathologiques dans les hBVO 8,11. Les limites de la modélisation des maladies à l’aide du système hBVO sont loin d’être bien connues, et c’est certainement un domaine qui doit être exploré. L’application de notre technologie organoïde des vaisseaux sanguins dans la vascularisation de constructions organoïdes précédemment avasculaires23 a également un impact et un intérêt significatifs.

Le dysfonctionnement vasculaire et les maladies des vaisseaux sanguins présentent des complications marquées dans les fonctions des organes. Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans le monde1 et sont également le principal facteur contribuant à l’augmentation des coûts des soins de santé aux États-Unis. Le nombre de cas de MCV augmente chaque année, et un nombre croissant de ces cas survient dans des groupes d’âge plus jeunes (20 à 45 ans)2. Plusieurs modèles in vivo ont été développés pour explorer le développement et la maturation des vaisseaux sanguins, les maladies vasculaires et le dysfonctionnement endothélial 3,4. Actuellement, les méthodes combinant des cellules définies par une ou plusieurs lignées dérivées de cellules souches ou isolées de tissus adultes in vivo peuvent créer des réseaux vasculaires qui reproduisent des aspects de la fonction vasculaire humaine et de l’anatomie 5,6. Les vaisseaux sanguins sont apparus comme l’un des premiers systèmes fonctionnels du mésoderme au cours du développement, et ils s’organisent soit par un processus d’assemblage appelé « vasculogenèse », soit par expansion et ramification à partir de vaisseaux préexistants, appelé « angiogenèse »7.
Tirant parti de la puissance de la biologie du développement et de l’assemblage autodirigé, Wimmer et al. ont rapporté les premiers organoïdes 3D auto-organisés de vaisseaux sanguins humains à partir de CSPh qui présentent les caractéristiques fonctionnelles, morphologiques et moléculaires de la microvascularisation humaine8. Semblables au système vasculaire humain9, ces hBVO sont générés et présents avec un endothélium, une membrane basale continue et des cellules murales environnantes 8,10. Les hBVO peuvent être transplantés in vivo et anastomosés avec la circulation endogène. Ils peuvent également subir une maturation in vitro et servir de modèles pour les maladies cardiovasculaires (c.-à-d. le diabète)8 ou le tropisme tissulaire dans les infections virales telles que le SRAS-CoV-211. Bien que nous ayons déjà publié un protocole écrit10, il n’existe aucun protocole vidéo disponible pour cette technique autrement complexe.
Grâce à une progression progressive concise, la formation d’hBVO est réalisée par formation agrégée, induction du mésoderme à l’aide d’un agoniste WNT, Chiron (CHIR99021) et protéine morphogénique osseuse - 4 (BMP4)12,13, induction vasculaire via le facteur de croissance endothéliale vasculaire A (VEGFA) et la forskoline (Fors)12, et intégration dans une matrice de germination personnalisée 8,10. La maturation vasculaire et la formation du réseau suivent l’incorporation des agrégats dans la matrice de germination. Ces réseaux de vaisseaux humains se forment en 2-3 semaines et peuvent être retirés de la matrice de germination et cultivés dans des systèmes de culture évolutifs jusqu’à 6 mois. Ici, des procédures optiquement guidées sont fournies pour la formation et l’application du système vasculaire dérivé de cellules souches humaines.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% sodium bicarbonate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell dissociation reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1391, 0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-rabbit IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-546-152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-sheep IgG</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647&#8211;anti-goat IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-606-147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Faster</td>
			<td></td>
			<td>SafeFAST Premium 212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-111-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF806</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td>Multifuge 4 KR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td></td>
			<td>Galaxy 170S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Basement membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (22 x 50 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3&#8211;anti-mouse IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-166-150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modefied Eagle&#39;s Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648-10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovien Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-093-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Heraguard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted contrasting tissue culture microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Vert.A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer&#160;</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>IS009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-essential amino acids (NEAAs)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (4%) in PBS</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BM-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3169S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips (6.5-10)</td>
			<td>Mquant, Millipore</td>
			<td>109543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (P1000, P200 and P20)</td>
			<td>Gilson, Integra Pipetboy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime Surface-U 96-well plates&#160;</td>
			<td>Sumilon</td>
			<td>MS9096-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PurCol&#160;</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS gel</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS mounting solution</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5, 10 and 25 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357529, 357530, 357515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>vSMC/Pericyte</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2547</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel micro spatula (rounded end)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel spoon (double-ended)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BelArt H367290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemflex medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>stem cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10639011</td>
			<td>flexible serum-free medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 &#956;L)</td>
			<td>Biozym, Surphob</td>
			<td>VT0270, VT0250, VT0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 12-well plates TC&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 6-well plates&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30720113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>mammalian cell dissociating enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low-attachment 6-well plates</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Isotemp 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>688000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells

Un organoïde est défini comme un tissu multicellulaire in vitro modifié qui imite son organe in vivo correspondant de sorte qu’il peut être utilisé pour étudier des aspects définis de cet organe dans une boîte de culture tissulaire. L’étendue et l’application de la recherche sur les organoïdes dérivés des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) ont considérablement progressé pour inclure le cerveau, la rétine, les canaux lacrymaux, le cœur, les poumons, l’intestin, le pancréas, les reins et les vaisseaux sanguins, parmi plusieurs autres tissus. Le développement de méthodes pour la génération de microvaisseaux humains, en particulier, a ouvert la voie à la modélisation in vitro du développement des vaisseaux sanguins humains et de la maladie et à l’essai et à l’analyse de nouveaux médicaments ou tropisme tissulaire dans les infections virales, y compris le SRAS-CoV-2. Des protocoles complexes et longs dépourvus de guidage visuel entravent la reproductibilité de nombreux organoïdes dérivés de cellules souches. De plus, la stochasticité inhérente aux processus de formation organoïde et à l’auto-organisation nécessite la génération de protocoles optiques pour faire progresser la compréhension de l’acquisition et de la programmation du devenir cellulaire. Ici, un protocole guidé visuellement est présenté pour la génération d’organoïdes de vaisseaux sanguins humains (BVO) 3D conçus à partir de CSPh. Présentant une membrane basale continue, des cellules endothéliales vasculaires et une articulation organisée avec des cellules murales, les BVO présentent les caractéristiques fonctionnelles, morphologiques et moléculaires de la microvascularisation humaine. La formation de BVO est initiée par la formation d’agrégats, suivie d’une induction du mésoderme et vasculaire. La maturation vasculaire et la formation de réseaux sont initiées et soutenues par l’incorporation d’agrégats dans une matrice de collagène 3D et de membrane basale solubilisée. Les réseaux de vaisseaux humains se forment en 2-3 semaines et peuvent être développés dans des systèmes de culture évolutifs. Il est important de noter que les BVO transplantés chez des souris immunodéprimées s’anastomose avec la circulation endogène de la souris et se spécifient dans les artères fonctionnelles, les veines et les artérioles. Le présent protocole guidé visuellement fera progresser la recherche sur les organoïdes humains, en particulier en ce qui concerne les vaisseaux sanguins en développement normal, la vascularisation tissulaire et la maladie.

Les étapes décrites dans ce protocole ont été développées spécifiquement pour produire une méthode contrôlée et précise pour la génération d’organoïdes de vaisseaux sanguins humains à partir de CSPh. La génération d’agrégats de 30 à 100 μm de diamètre à partir de cultures de CSPh marque le point de départ du protocole (Figure 1, Figure 2B). Les agrégats sont conduits par étapes vers le mésoderme (jour 1-jour 4) et les lignées vasculaires (jour 4-jour 6) avant l’incorporation (jour 6) (Figure 2A-D), qui est nécessaire à la formation du réseau de vaisseaux. La germination d’un vaisseau à symétrie quasi radiale doit être visible par d7 ou d8 (figure 2E) et se poursuivre par d10 (figure 2F,G). L’explantation des hBVO de l’ECM vers les plaques de fixation ultra-basses à 96 puits réduit la fragilité des réseaux de germination et permet une maintenance continue dans des conditions de culture en suspension (Figure 2H) jusqu’à 6 mois. À d15, les hBVO présentent un réseau endothélial étendu et connecté (CD31+) entouré de péricytes (PDGFR-ß+) et d’actine du muscle lisse (SMA+) (Figure 3A-D). Une membrane basale continue de collagène IV (ColIV+) enveloppe les réseaux de vaisseaux (Figure 3E). Les cellules endothéliales (CD31+, VE-Cadhérine+) et les péricytes (PDGFR-ß+) représentent respectivement environ 30 % à 35 % et 60 % à 65 % des populations de cellules organoïdes. La germination active des vaisseaux se produit sous la direction d’une population de cellules de pointe organisées de manière endogène (CD31+) qui présente une morphologie typique des cellules de pointe, comme un excès de filipodia 8,10. La présentation des cellules murales PDGFR-ß+ et SMA+ encapsulant les réseaux de vaisseaux endothéliaux peut être vue par d15 du processus de maturation organoïde (Figure 3A,C). Après le retrait de l’ECM et la maturation en culture en suspension (c.-à-d. d15), les BVO h sont valables pour les analyses respectives ou la transplantation sous la capsule rénale de souris.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma du protocole hBVO mettant en évidence le timing et la progression par étapes. À partir de cultures apparemment homogènes de CSPh ou de CSPhi, la formation d’agrégats se produit en présence de l’inhibiteur de la rho-kinase Y27632. Le milieu BMP4 et supplémenté en CHiR est utilisé pour diriger les agrégats vers le devenir mésodermique. Le milieu d’induction du mésoderme est remplacé par le VEGFA et le milieu supplémenté en forskoline pour stimuler les agrégats vers une lignée vasculaire. Les files d’attente mécaniques et chimiques obtenues grâce à l’incorporation des agrégats dans une matrice de membrane basale de collagène I et solubilisée et à l’exposition à un milieu contenant du VEGFA et du FGF2 entraînent une germination vasculaire presque radiale symétrique à partir du corps agrégé. Les réseaux de vaisseaux générés peuvent être retirés du collagène I et de la membrane basale solubilisée et placés en culture en suspension pour une maturation, une analyse ou une transplantation ultérieure in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig02.jpg"> Figure 2 : Progression par étapes de la génération hBVO capturée sous fond clair. (A) Morphologie typique des colonies hPSC (H9) au jour −1. (B) Génération d’agrégats hPSC (jour 0) sur des plaques de fixation ultra-basses à 6 puits en présence de Y-27632. (C) L’induction mésodermique d’agrégats à l’aide de BMP4 et d’un milieu supplémenté en ChiR (jour 1). Des changements subtils dans la taille et la forme de l’agrégat peuvent également être observés. (D) Les agrégats du jour 4 amorcés vers une lignée vasculaire en utilisant le VEGFA et un milieu supplémenté en forskoline. (E) Germination précoce du vaisseau le jour 7, un jour après l’incorporation des agrégats dans la matrice de germination et l’exposition au milieu de germination supplémenté en VEGFA et FGF2 (jour 7). (F) Morphologie organoïde saine et germination continue des vaisseaux au jour 9. G) Navire à un stade avancé poussant au jour 10. Idéalement, les structures cellulaires denses au centre organoïde ont disparu à ce moment-là. (H) Morphologie typique des organoïdes des vaisseaux sanguins humains matures (jour 15). L’élimination de la matrice environnante par coupe et maturation dans des plaques de culture à 96 puits à très faible attachement façonne les organoïdes de manière sphérique, les réseaux de vaisseaux étant logés à l’intérieur. Barres d’échelle: (A,B,E,F) 250 μm; C,D) 500 μm; (G,H) 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig03.jpg"> Figure 3 : Coloration en montage entier des organoïdes des vaisseaux sanguins humains matures (jour 15). (A) Présentation d’organoïdes de vaisseaux sanguins humains matures (jour 15) avec des réseaux endothéliaux auto-organisés (CD31+, magenta) et une couverture péricytaire environnante (PDGFR-β+, cyan) et d’actine musculaire alpha-lisse (SMA+, jaune). (B) Grossissement plus élevé de A détaillant l’expression SMA+ (jaune) et PDGFR-β+ (cyan) des réseaux de récipients. (C) Présentation détaillée de l’interaction endothéliale (CD31+, magenta), péricytaire (PDGFR-β+, cyan) et de l’actine musculaire alpha-lisse (SMA+, jaune). (D) Coloration intégrale de l’interaction endothéliale (CD31+, magenta)-muscle lisse (SMA+, jaune) dans une section transversale (à gauche) et un grossissement plus élevé (à droite) des organoïdes des vaisseaux sanguins matures. (E) Formation autodirigée d’une membrane basale vasculaire (Col IV+, niveaux de gris) par association étroite des cellules murales et des tubes endothéliaux. Barres d’échelle: (A,D[gauche]) 100 μm; (B,D[droite],E) 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Ce protocole décrit la génération de vaisseaux sanguins auto-organisés à partir de cellules souches pluripotentes et pluripotentes induites humaines. Ces réseaux de vaisseaux sanguins présentent un réseau endothélial étendu et connecté entouré de péricytes, d’actine musculaire lisse et d’une membrane basale continue.

Génération d’organoïdes de vaisseaux sanguins humains à partir de cellules souches pluripotentes

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Ce protocole décrit notre génération d’organoïdes de vaisseaux sanguins humains à partir de cellules souches pluripotentes. Cette technologie peut être utilisée pour étudier les aspects de la vasculogenèse, de l’angiogenèse, des maladies vasculaires, ainsi que des pathologies vasculaires. La reproductibilité et la nature à haut débit, ainsi que sa cohérence dans de nombreuses lignées de cellules souches différentes, sont de grands avantages de cette technique.En termes d’application, certaines de nos recherches antérieures décrivent l’utilisation des organoïdes des vaisseaux sanguins pour étudier les changements morphologiques pour le système vasculaire des patients diabétiques et explorent les voies de traitement médicamenteux pour la vascularopathie diabétique. Maintenir correctement la population initiale de cellules souches, empêcher les agrégats de s’agglutiner et assurer un diamètre d’agrégat presque homogène, ce sont des facteurs essentiels pour générer de bons organoïdes de vaisseaux sanguins. Commencer la génération d’agrégats en utilisant des cellules souches pluripotentes humaines en culture, ou CSPh, ayant une confluence de 70%.À l’aide d’une pipette ou d’un système sous vide, aspirez le milieu de culture et remplacez-le par un millilitre de réactif de dissociation cellulaire avant d’incuber les cellules pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Pendant ce temps, préparer le volume nécessaire de milieu d’agrégation dans un tube conique de 15 millilitres, en suivant la formulation mentionnée dans le manuscrit du texte. Après avoir incubé les cellules, aspirer le réactif de dissociation cellulaire avant de suspendre les cellules dans un millilitre de milieu d’agrégation.Pipeter doucement le contenu de haut en bas pour créer une suspension unicellulaire. Compter les cellules à l’aide d’un dispositif automatisé de comptage de cellules ou au microscope, et calculer le nombre total de cellules nécessaires à la formation d’agrégats. La lecture de la viabilité cellulaire montre une suspension unicellulaire avec des grappes faibles ou nulles.Aspirer le surnageant du tube et ajouter le volume approprié de la suspension cellulaire au milieu d’agrégation dans le tube conique en polypropylène haute clarté de 15 millilitres et pipeter doucement la suspension cellulaire diluée de haut en bas pour assurer une distribution homogène des cellules. Pipeter trois millilitres de la suspension cellulaire diluée dans chaque puits désiré de la plaque de culture à ultra-faible fixation à six puits. Placez la plaque dans l’incubateur et minimisez toute perturbation pour maintenir la taille et la forme des agrégats.Préparer le milieu du mésoderme tel que décrit dans le manuscrit textuel. 24 heures après l’ensemencement des cellules, sortez la plaque de culture de l’incubateur. Faites tourbillonner la plaque dans un mouvement circulaire pour accumuler les agrégats au centre de chaque puits.À l’aide d’une pipette d’un millilitre, transférer doucement les agrégats avec le milieu de chaque puits dans le tube conique correspondant. Laisser les agrégats sédimenter dans les tubes coniques à température ambiante pendant une heure. Une fois sédimenté, aspirer le surnageant avec une pipette ou une pompe d’aspiration à haute sensibilité avec précaution, sans perturber les agrégats décantés.Remettez en suspension les agrégats dans chaque tube en ajoutant deux millilitres de milieu d’induction mésodermique. Ensuite, transférez la suspension de chaque tube dans le puits respectif de la plaque de culture à six puits à fixation ultra-basse. Placez l’assiette dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et laissez-la jusqu’au quatrième jour.Le quatrième jour, sortez la plaque de culture de l’incubateur, puis secouez la plaque dans un mouvement circulaire pour recueillir les agrégats au centre de chaque puits. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, transférer doucement les agrégats avec le milieu environnant de chaque puits dans le tube conique correspondant. Réglez une minuterie pendant 30 minutes pour permettre aux agrégats de sédimenter dans les tubes.Une fois les agrégats sédimentés, préparez les plaques de culture comme démontré précédemment et placez-les dans l’incubateur à 37 degrés Celsius jusqu’au sixième jour. Pour l’enrobage des agrégats et l’induction de germes vasculaires, préparer le volume final souhaité de la solution de matrice extracellulaire tout en travaillant sur la glace. Pipeter 500 microlitres de l’ECM dans un puits d’une plaque de 12 puits pour former la première couche du sandwich ECM.Pour assurer une polymérisation efficace de la première couche ECM, placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Vers la fin de l’incubation de deux heures, commencez à travailler avec les agrégats dans la plaque de culture. Rassemblez les agrégats au centre de chaque puits avant d’utiliser une pipette d’un millilitre pour transférer doucement les agrégats et le milieu de chaque puits dans un tube conique correspondant de 15 millilitres.Laisser les agrégats se déposer pendant 10 à 15 minutes avant d’aspirer le surnageant. Après quoi, gardez les tubes coniques contenant les agrégats sur la glace pendant cinq minutes. En travaillant rapidement et soigneusement, remettez les agrégats en suspension dans 500 microlitres d’ECM sans formation de bulles.À l’aide d’une pipette, déposer la suspension d’agrégats ECM sur la première couche ECM déjà polymérisée à l’intérieur du puits dans la plaque de 12 puits. En attendant, préparez le milieu de germination tel que décrit dans le manuscrit textuel. Après deux heures d’incubation à 37 degrés Celsius, ajouter un millilitre de milieu de germination préchauffé à 37 degrés Celsius dans le puits pour induire la différenciation des vaisseaux sanguins.Travailler dans des conditions stériles, utiliser l’extrémité arrondie d’une spatule stérile pour desserrer la matrice de germination ECM contenant les réseaux vasculaires. Ensuite, à l’aide d’une pince stérile et de l’extrémité arrondie d’une spatule stérile, transférez soigneusement le disque de gel desserré sur le couvercle d’une boîte de culture de 10 centimètres. Placez le gel sur le couvercle sous un stéréomicroscope ajusté au grossissement et à la mise au point souhaités, et utilisez des aiguilles stériles pour découper des réseaux de vaisseaux sanguins uniques, en essayant de limiter la quantité d’ECM non vascularisée obtenue dans le processus.Retransférer doucement les organoïdes isolés dans un puits d’une plaque de six puits à fixation ultra-basse contenant trois millilitres de milieu de germination. Ensuite, à l’aide d’une pipette d’un millilitre, transférer les organoïdes individuels au nombre approprié de puits dans une plaque de fixation ultra-basse de 96 puits. Une fois transféré, ajoutez 200 microlitres de milieu de germination préchauffé dans chaque puits de la plaque de 96 puits.Quatre à six jours après l’isolement dans la plaque de 96 puits, assurez-vous que les organoïdes possèdent une morphologie ronde et saine avant de procéder à leur réparation et à leur coloration. Des images de la progression progressive de la génération organoïde des vaisseaux sanguins humains, ou hBVO, à partir des CSPh ont été capturées en champ clair. Au jour zéro, des agrégats allant de 30 à 100 microns de diamètre ont été générés à partir de la culture hPSC.Des changements subtils dans la taille et la forme des agrégats ont été observés lors de l’induction du mésoderme le premier jour, qui a encore changé le quatrième jour lorsque les agrégats ont subi un amorçage vasculaire. Une germination précoce des vaisseaux à symétrie quasi radiale peut être observée le septième jour, un jour après l’incorporation des agrégats dans la matrice de germination. Une morphologie organoïde saine et une germination continue des vaisseaux ont été observées le neuvième jour, qui a progressé vers des vaisseaux à un stade avancé au jour 10 lorsque les structures cellulaires denses au centre organoïde ont presque disparu.La morphologie typique des organoïdes des vaisseaux sanguins humains matures a été clairement observée au jour 15. La coloration complète des hBVO matures au jour 15 a montré un réseau endothélial étendu et connecté qui était CD31-positif et entouré de parasites PDGFR-bêta-positifs et d’actine musculaire alpha-lisse SMA-positive. Les cellules murales PDGFR-bêta-positives et SMA-positives encapsulant les réseaux de vaisseaux endothéliaux sont bien observées.Une membrane basale positive au collagène IV continue enveloppant les réseaux de vaisseaux a également été observée. Assurer une polymérisation correcte de la matrice extracellulaire pendant l’étape d’incorporation est essentiel à une germination efficace des vaisseaux sanguins. Les chercheurs ont utilisé notre technologie organoïde des vaisseaux sanguins pour générer des compartiments vasculaires précoces dans des modèles organoïdes déjà établis, tels que le cerveau et les reins, qui étaient auparavant avasculaires.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Le développement, l&#39;expansion et<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi des cellules NK humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et et induit des cellules souches pluripotentes (CISP)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Recherche

Bio-ingénierie

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation de progéniteurs myoangioblastes dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des modèles murins de régénération musculaire

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Génération efficace et l’édition de CISP exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolement des fibroblastes dermiques humains adultes de la peau abdominale et génération de cellules souches pluripotentes induites à l'aide d'une méthode de non-intégration

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Génération évolutive d’Organoïdes cérébellaires matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines et caractérisation par immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Différenciation guidée des podocytes rénaux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans des conditions chimiquement définies

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Tissu conjonctif humain dérivé de fibroblastes pour les applications de dépistage

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...