Name: generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells
Uploaded: 2023-01-20T13:35:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Wir danken allen Mitgliedern unserer Labore für kritische Anregungen und Diskussionen. JMP wurde von der T. von Zastrow-Stiftung, dem Wittgenstein-Preis des FWF (Z 271-B19), der Österreichischen Akademie der Wissenschaften, dem Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking (JU) im Rahmen der Fördervereinbarung Nr. 101005026, Leducq Transatlantic Networks of Excellence in Cardiovascular Research, dem Allen Institute Distinguished Investigator Program und dem Canada 150 Research Chairs Program F18-01336 sowie den Canadian Institutes of Health Research COVID-19 Grants F20-02343 und F20-02015 gefördert.

<ol>
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Es besteht kein Zusammenhang zwischen den finanziellen Interessen der Autorinnen und Autoren und der präsentierten Forschung. Die Blutgefäß-Organoid-Technologie wurde an Stemcell Technologies lizenziert. J.M.P. ist Gründer und Anteilseigner von Angios Biotech, das Organoide für Blutgefäße als Gefäßtransplantationstherapie entwickelt. Eine Patentanmeldung zu dieser Arbeit wurde unter Patent-Nr. US20200199541A1, in dem Reiner A. Wimmer, Josef M. Penninger und Dontscho Kerjaschki als Erfinder aufgeführt sind.

Jüngste Durchbrüche bei Stammzell-abgeleiteten Organoidkulturen haben den Rahmen für fortschrittlichere und physiologisch relevante Modelle des menschlichen Gefäßsystems geschaffen. Das hier vorgestellte Modell des humanen Blutgefäßorganoids (hBVO), das inunserem Labor 8,10 entwickelt wurde, bietet ein leistungsfähiges Mittel, um nicht nur weitere Aspekte der menschlichen Vaskulogenese, sondern auch neue Wege der Krankheitsmodellierung und regenerativen Therapie zu erforschen 8,10,11. Mehrere In-vivo-Modelle wurden verwendet, um die Entwicklung und Reifung von Blutgefäßen, Gefäßerkrankungen und endotheliale Dysfunktionen zu untersuchen 3,4. Unterschiedliche Ansätze kombinieren einzelne und mehrere liniendefinierte Zellen, die entweder aus Stammzellen gewonnen oder in vivo aus adultem Gewebe isoliert wurden, um replikative menschliche Gefäßnetzwerke zu schaffen 5,6. Das hier vorgestellte Protokoll nutzt das Prinzip der Entwicklungsbiologie und Selbstorganisation, um die ersten menschlichen Blutgefäßnetzwerke mit mehreren Zellen zu erzeugen, die im Wesentlichen aus einem einzigen hPSC 8,10 generiert werden können.
Jede Stammzelllinie hat eine einzigartige genetische Ausstattung und unterscheidet sich von anderen in Bezug auf ihre Beschaffung, Funktion und Reaktionsfähigkeit15. Daher wurde das Protokoll für humane Blutgefäß-Organoide (hBVOs) entwickelt und optimiert, um eine robuste und reproduzierbare Protokollkompatibilität mit mehreren (>12) verschiedenen hPSC-Linienzu gewährleisten 8,10. Die hier beschriebene Methode erzeugt über einen Zeitraum von 2 Wochen hPSC-abgeleitete Blutgefäßorganoide. Änderungen der Medienzusammensetzung und/oder der Techniken bei der hBVO-Erzeugung können jedoch zu einer ineffektiven Gefäßvernetzung und Organoiderzeugung führen. Die unterschiedlichen Proliferationsraten einzelner Stammzelllinien wirken sich auch deutlich auf die Reproduzierbarkeit von Stammzellexperimenten15 und damit von Organoidkulturen aus. Zum Beispiel unterliegen bei der Erzeugung der BVOs proliferativere Zellen oder eine höhere Anzahl großer Tag-1-Aggregate von Natur aus unterschiedlichen Stoffwechselumgebungen und Gas- und Nährstoffdiffusionsparametern. Dies wiederum verändert die Expositionszeiten und -effizienzen des Wachstumsfaktors, den Grad der Differenzierung und des vaskulären Primings und vor allem die Fähigkeit, Gefäßnetzwerke zu bilden, wenn die Aggregate in die Kollagen-1- und solubilisierte Basalmembranmatrix eingebettet werden.
Die passive Diffusion von Sauerstoff und die Verabreichung essentieller Nährstoffe aus der äußeren Umgebung ist nicht ideal für das langfristige Zellwachstum von 3D-Organoiden und die Gewebemorphogenese in vitro16. Obwohl dies von mehreren Faktoren abhängt (z. B. der Stoffwechselrate des Gewebes, der Bioverfügbarkeit von Nährstoffen und Gasen, einer statischen oder dynamischen Umgebung), wurde für in vitro kultivierte Gewebe ein allgemeiner Grenzwert von 150 μmO2 und Nährstoffdiffusion festgelegt, da menschliche Gewebe physiologisch gesehen Stränge lebender Zellen innerhalb von 150 μm von perfundierten Blutgefäßen aufweisen17. Obwohl auch effektive Gas- und Nährstoffdiffusionsabstände von 70-200 μm vorgeschlagen wurden18,19,20,21, haben die Konstruktdichte, die Temperatur, der pH-Wert und die Medienzusammensetzung einen signifikanten Einfluss auf die Diffusionseffizienz. Aufgrund der Oberflächenoptimierung und der Integrin-beta-Rezeptor-Kommunikation nach der Einbettung am Tag 6 schneiden Aggregate mit einem Durchmesser von 250-300 μm besser ab als solche mit einem Durchmesser von >500-600 μm, was zu einem vollständigen Gefäßkeimungsprozess und einem minimal kondensierten Organoidkern führt. Daher ist die Aggregatgröße entscheidend und kann sowohl von der Anzahl der Zellen, die während der ersten Aussaat verwendet werden, als auch von der für die Aggregatbildung vorgesehenen Zeit beeinflusst werden. Mikrotiterplatten, die eine Kontrolle über die Aggregatgröße und die Anzahl22 ermöglichen, sind eine praktikable Alternative zu der ansonsten stochastischen Aggregatbildungstechnik, die sich aus der Verwendung von 6-Well-Platten mit extrem niedriger Bindung in diesem Protokoll ergibt. Die Konsistenz des Timings und des Managements der Aggregatgrößen während der ersten 6 Tage des hBVO-Protokolls ist einer der, wenn nicht sogar der wichtigste Indikator für die erfolgreiche Entwicklung von echten Blutgefäßorganoiden.
Mediumwechsel an Tag 1 (Mesoderm-Induktion) und Tag 4 (vaskuläre Induktion) müssen in Kombination mit der Sedimentation der Aggregate abgeschlossen werden. Obwohl die Zentrifugation eine verlockende Alternative ist, können die zusätzlichen Kräfte, die auf die schwach zusammengesetzten Aggerate ausgeübt werden, zu unerwünschter Verklumpung, Assemblierung und Scherung führen, was sich negativ auf die Differenzierung, Reifung und Keimungseffizienz in den späteren Phasen des Protokolls auswirkt. Die Arbeit auf Eis während des Einbettprozesses von Tag 6 ist entscheidend für die Aufrechterhaltung einer ordnungsgemäßen ECM-Polymerisation und Schichtbildung. Während der Einbettung und Induktion von Aggregaten wirkt sich die Exposition des ECM bei Temperaturen über 4 °C und/oder einem anderen ECM-pH-Wert als 7,4 nicht nur auf die Polymerisationsraten und die Integrität der ECM-Schicht, sondern auch auf die Keimeffizienz der eingebetteten Aggregate aus. Die elastische Beschaffenheit der ECM-Sprossenmatrix ermöglicht ein einfaches Abnehmen und Transportieren von der 12-Well-Kulturschale zur sterilen Schneidefläche. Einzelne Organoide, die aus der Matrix entfernt und auf 96-Well-Platten mit extrem niedriger Anhaftung übertragen werden, verbrauchen die verbleibende umgebende EZM und behalten selbstorganisierte, mit Wandzellen beschichtete endotheliale Mikrogefäßnetzwerke mit einer durchgehenden Basalmembran bei.
Obwohl sie in diesem Vorschlag nicht behandelt werden, können Veränderungen in der Medienzusammensetzung Krankheiten replizieren, die wiederum pathologische Reaktionen in hBVOs hervorrufen 8,11. Die Grenzen der Krankheitsmodellierung mit dem hBVO-System sind alles andere als bekannt, und dies ist sicherlich ein Bereich, der erforscht werden muss. Die Anwendung unserer Blutgefäß-Organoid-Technologie bei der Vaskularisierung von zuvor avaskulären Organoidkonstrukten23 ist ebenfalls von erheblicher Bedeutung und Interesse.

Gefäßfunktionsstörungen und Erkrankungen der Blutgefäße führen zu deutlichen Komplikationen der Organfunktionen. Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache1 und tragen auch am häufigsten zum Anstieg der Gesundheitskosten in den Vereinigten Staaten bei. Die Fallzahlen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen steigen von Jahr zu Jahr, und die Zahl dieser Fälle steigt in jüngeren Altersgruppen (20-45 Jahre)2. Es wurden mehrere In-vivo-Modelle entwickelt, um die Entwicklung und Reifung von Blutgefäßen, Gefäßerkrankungen und endotheliale Dysfunktionen zu untersuchen 3,4. Derzeit können Methoden, die einzelne und mehrere liniendefinierte Zellen kombinieren, die entweder aus Stammzellen gewonnen oder in vivo aus adultem Gewebe isoliert wurden, vaskuläre Netzwerke schaffen, die Aspekte der menschlichen Gefäßfunktion und -anatomie nachbilden 5,6. Blutgefäße haben sich während der Entwicklung aus dem Mesoderm als eines der ersten funktionellen Systeme herausgebildet und organisieren sich entweder durch einen Prozess der Assemblierung, der als "Vaskulogenese" bezeichnet wird, oder durch Erweiterung und Verzweigung von bereits vorhandenen Gefäßen, was als "Angiogenese" bezeichnet wird7.
Wimmer et al. nutzten die Möglichkeiten der Entwicklungsbiologie und der selbstgesteuerten Assemblierung und berichteten über die ersten selbstorganisierenden 3D-Organoide menschlicher Blutgefäße aus hPSCs, die die funktionellen, morphologischen und molekularen Eigenschaften des menschlichen Mikrogefäßsystems aufweisen8. Ähnlich wie das menschliche Gefäßsystem9 werden diese hBVOs mit einem Endothel, einer durchgehenden Basalmembran und umgebenden Wandzellen gebildet und liegen vor 8,10. Die hBVOs können in vivo transplantiert und mit dem endogenen Kreislauf anastomosiert werden. Sie können auch in vitro reifen und als Modelle für Herz-Kreislauf-Erkrankungen (z. B. Diabetes)8 oder Gewebetropismus bei Virusinfektionen wie SARS-CoV-2dienen 11. Obwohl wir zuvor ein schriftliches Protokoll10 veröffentlicht haben, gibt es kein verfügbares Videoprotokoll für diese ansonsten komplexe Technik.
Durch eine prägnante schrittweise Progression wird die hBVO-Bildung durch Aggregatbildung, Mesoderm-Induktion mit einem WNT-Agonisten, Chiron (CHIR99021) und knochenmorphogenem Protein - 4 (BMP4)12,13, vaskuläre Induktion über vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor A (VEGFA) und Forskolin (Fors)12 und Einbettung in eine benutzerdefinierte Sprossungsmatrixerreicht 8,10. Die Gefäßreifung und Netzwerkbildung erfolgt nach der Einbettung der Aggregate in die Keimmatrix. Diese menschlichen Gefäßnetzwerke bilden sich innerhalb von 2-3 Wochen und können aus der Keimmatrix entfernt und in skalierbaren Kultursystemen bis zu 6 Monate weiter gezüchtet werden. Hier werden optisch gesteuerte Verfahren zur Bildung und Applikation von humanen Stammzellgefäßen bereitgestellt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% sodium bicarbonate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell dissociation reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1391, 0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-rabbit IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-546-152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-sheep IgG</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647&#8211;anti-goat IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-606-147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Faster</td>
			<td></td>
			<td>SafeFAST Premium 212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-111-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF806</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td>Multifuge 4 KR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td></td>
			<td>Galaxy 170S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Basement membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (22 x 50 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3&#8211;anti-mouse IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-166-150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modefied Eagle&#39;s Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648-10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovien Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-093-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Heraguard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted contrasting tissue culture microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Vert.A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer&#160;</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>IS009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-essential amino acids (NEAAs)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (4%) in PBS</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BM-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3169S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips (6.5-10)</td>
			<td>Mquant, Millipore</td>
			<td>109543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (P1000, P200 and P20)</td>
			<td>Gilson, Integra Pipetboy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime Surface-U 96-well plates&#160;</td>
			<td>Sumilon</td>
			<td>MS9096-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PurCol&#160;</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS gel</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS mounting solution</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5, 10 and 25 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357529, 357530, 357515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>vSMC/Pericyte</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2547</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel micro spatula (rounded end)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel spoon (double-ended)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BelArt H367290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemflex medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>stem cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10639011</td>
			<td>flexible serum-free medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 &#956;L)</td>
			<td>Biozym, Surphob</td>
			<td>VT0270, VT0250, VT0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 12-well plates TC&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 6-well plates&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30720113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>mammalian cell dissociating enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low-attachment 6-well plates</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Isotemp 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>688000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells

Ein Organoid ist definiert als ein künstlich hergestelltes multizelluläres In-vitro-Gewebe , das sein entsprechendes In-vivo-Organ nachahmt, so dass es verwendet werden kann, um definierte Aspekte dieses Organs in einer Gewebekulturschale zu untersuchen. Die Breite und Anwendung der Forschung an humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) hat sich erheblich weiterentwickelt und umfasst unter anderem das Gehirn, die Netzhaut, den Tränenkanal, das Herz, die Lunge, den Darm, die Bauchspeicheldrüse, die Niere und die Blutgefäße. Die Entwicklung von Methoden zur Erzeugung menschlicher Mikrogefäße hat insbesondere den Weg für die Modellierung der Entwicklung und Erkrankung menschlicher Blutgefäße in vitro sowie für die Erprobung und Analyse neuer Medikamente oder Gewebetropismus bei Virusinfektionen, einschließlich SARS-CoV-2, geebnet. Komplexe und langwierige Protokolle, denen es an visueller Anleitung mangelt, behindern die Reproduzierbarkeit vieler aus Stammzellen gewonnener Organoide. Darüber hinaus erfordert die inhärente Stochastizität von Organoidbildungsprozessen und Selbstorganisation die Generierung optischer Protokolle, um das Verständnis der Erfassung und Programmierung des Zellschicksals zu verbessern. In dieser Arbeit wird ein visuell geführtes Protokoll für die Erzeugung von 3D-Organoiden (BVOs) aus hPSCs vorgestellt. Mit einer durchgehenden Basalmembran, vaskulären Endothelzellen und einer organisierten Artikulation mit Wandzellen weisen BVOs die funktionellen, morphologischen und molekularen Merkmale des menschlichen Mikrogefäßsystems auf. Die BVO-Bildung wird durch Aggregatbildung eingeleitet, gefolgt von Mesoderm- und vaskulärer Induktion. Die vaskuläre Reifung und Netzwerkbildung wird durch die Einbettung von Aggregaten in eine 3D-Kollagen- und solubilisierte Basalmembranmatrix initiiert und unterstützt. Menschliche Gefäßnetzwerke bilden sich innerhalb von 2-3 Wochen und können in skalierbaren Kultursystemen weiter gezüchtet werden. Wichtig ist, dass BVOs, die in immungeschwächte Mäuse transplantiert werden, mit der endogenen Mauszirkulation anastomosieren und in funktionelle Arterien, Venen und Arteriolen spezifizieren. Das vorliegende visuell gesteuerte Protokoll wird die Forschung an menschlichen Organoiden voranbringen, insbesondere in Bezug auf Blutgefäße in normaler Entwicklung, Gewebevaskularisierung und Krankheiten.

Die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte wurden speziell entwickelt, um eine kontrollierte und präzise Methode zur Erzeugung menschlicher Blutgefäßorganoide aus hPS-Zellen zu entwickeln. Die Erzeugung von Aggregaten mit einem Durchmesser von 30-100 μm aus hPSC-Kulturen markiert den Ausgangspunkt des Protokolls (Abbildung 1, Abbildung 2B). Die Aggregate werden vor der Einbettung (Tag 6) schrittweise in Richtung Mesoderm (Tag 1-Tag 4) und Gefäßlinien (Tag 4-Tag 6) geleitet (Abbildung 2A-D), was für die Bildung eines Gefäßnetzwerks notwendig ist. Der nahezu radial symmetrische Gefäßaustrieb muss bei d7 oder d8 sichtbar sein (Abbildung 2E) und sich bis d10 fortsetzen (Abbildung 2F,G). Die Explantation der hBVOs aus der ECM in die 96-Well-Ultra-Low-Attachment-Platten reduziert die Zerbrechlichkeit der Keimnetzwerke und ermöglicht eine kontinuierliche Aufrechterhaltung unter Suspensionskulturbedingungen (Abbildung 2H) für bis zu 6 Monate. Bei d15 weisen die hBVOs ein ausgedehntes und verbundenes Endothelnetzwerk (CD31+) auf, das von Perizyten (PDGFR-ß+) und Aktin der glatten Muskulatur (SMA+) umgeben ist (Abbildung 3A-D). Eine kontinuierliche Kollagen-IV-Basalmembran (ColIV+) umhüllt die Gefäßnetzwerke (Abbildung 3E). Endothelzellen (CD31+, VE-Cadherin+) und Perizyten (PDGFR-ß+) machen etwa 30%-35% bzw. 60%-65% der Organoidzellpopulationen aus8. Die aktive Sprossung der Gefäße erfolgt unter der Leitung einer endogen organisierten Spitzenzellpopulation (CD31+), die sich mit einer typischen Spitzenzellmorphologie, wie z.B. übermäßigen Filipodien, aufweist 8,10. Die Präsentation von PDGFR-ß+ und SMA+ Wandzellen, die die endothelialen Gefäßnetzwerke einkapseln, kann durch d15 des Organoid-Reifungsprozesses gesehen werden (Abbildung 3A,C). Nach der Entfernung aus der EZM und der Reifung in einer Suspensionskultur (d.h. d15) sind die hBVOs für entsprechende Analysen oder die Transplantation unter die Nierenkapsel der Maus haltbar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des hBVO-Protokolls mit Hervorhebung des zeitlichen Ablaufs und des schrittweisen Verlaufs. Aus scheinbar homogenen hPSC- oder hiPSC-Kulturen kommt es in Gegenwart des Rho-Kinase-Inhibitors Y27632 zur Aggregatbildung. BMP4 und CHiR-supplementiertes Medium wird verwendet, um die Aggregate in Richtung des mesodermalen Schicksals zu instruieren. Das Mesoderm-Induktionsmedium wird durch VEGFA und Forskolin-supplementiertes Medium ersetzt, um die Aggregate in Richtung einer vaskulären Linie zu stimulieren. Mechanische und chemische Warteschlangen, die durch die Einbettung der Aggregate in eine Kollagen-I- und solubilisierte Basalmembranmatrix und die Exposition gegenüber VEGFA- und FGF2-haltigem Medium erreicht werden, führen zu einem nahezu radial symmetrischen vaskulären Spross aus dem Aggregatkörper. Die erzeugten Gefäßnetzwerke können aus dem Kollagen I und der solubilisierten Basalmembran entfernt und zur weiteren Reifung, Analyse oder Transplantation in vivo in Suspensionskultur gebracht werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig02.jpg"> Abbildung 2: Schrittweise Progression der hBVO-Erzeugung, aufgenommen unter Hellfeld. (A) Typische Morphologie von hPSC (H9)-Kolonien an Tag −1. (B) Erzeugung von hPSC-Aggregaten (Tag 0) auf 6-Well-Ultra-Low-Attachment-Platten in Gegenwart von Y-27632. (C) Die mesodermale Induktion von Aggregaten unter Verwendung von BMP4 und ChiR-supplementiertem Medium (Tag 1). Subtile Veränderungen in der Größe und Form der Aggregate können ebenfalls beobachtet werden. (D) Tag-4-Aggregate, die unter Verwendung von VEGFA und Forskolin-supplementiertem Medium auf eine vaskuläre Linie vorbereitet wurden. (E) Frühes Keimen des Gefäßes an Tag 7, einen Tag nach Einbettung der Aggregate in die Keimmatrix und Exposition gegenüber VEGFA und FGF2-supplementiertem Keimmedium (Tag 7). (F) Gesunde organoide Morphologie und anhaltendes Gefäßkeimen an Tag 9. (G) Sprossung des Gefäßes im Spätstadium am 10. Tag. Im Idealfall sind die dichten Zellstrukturen im Organoidzentrum zu diesem Zeitpunkt verschwunden. (H) Typische Morphologie reifer (Tag 15) menschlicher Blutgefäßorganoide. Das Entfernen der umgebenden Matrix durch Schneiden und Reifung in 96-Well-Kulturplatten mit extrem niedrigem Aufsatz formt die Organoide kugelförmig, wobei die Gefäßnetzwerke intern untergebracht sind. Maßstabsbalken: (A,B,E,F) 250 μm; (C,D) 500 μm; (G,H) 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig03.jpg"> Abbildung 3: Whole-Mount-Färbung von reifen (Tag 15) menschlichen Blutgefäß-Organoiden. (A) Darstellung von reifen (Tag 15) menschlichen Blutgefäß-Organoiden mit selbstorganisierten endothelialen (CD31+, magenta) Netzwerken und umgebender Perizyte (PDGFR-β+, cyan) und alpha-glattem Muskelaktin (SMA+, gelb). (B) Höhere Vergrößerung von A, die die SMA+ (gelb) und PDGFR-β+ (cyan) Ausprägung der Gefäßnetzwerke detailliert beschreibt. (C) Detaillierte Darstellung der Interaktion zwischen Endothel (CD31+, Magenta), Perizyten (PDGFR-β+, Cyan) und Alpha-Glattmuskel-Aktin (SMA+, gelb). (D) Whole-Mount-Färbung der Interaktion zwischen Gefäßendothel (CD31+, magenta) und glatter Muskulatur (SMA+, gelb) in einem Querschnitt (links) und einer höheren Vergrößerung (rechts) von reifen Blutgefäßorganoiden. (E) Selbstgesteuerte Bildung einer vaskulären Basalmembran (Col IV+, Graustufen) durch die enge Assoziation von Wandzellen und Endotheltuben. Maßstabsbalken: (A,D[links]) 100 μm; (B,D[rechts],E) 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von selbstorganisierenden Blutgefäßen aus humanen pluripotenten und induzierten pluripotenten Stammzellen. Diese Blutgefäßnetzwerke weisen ein ausgedehntes und verbundenes Endothelnetzwerk auf, das von Perizyten, Aktin der glatten Muskulatur und einer durchgehenden Basalmembran umgeben ist.

Erzeugung menschlicher Blutgefäß-Organoide aus pluripotenten Stammzellen

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Dieses Protokoll beschreibt unsere Erzeugung von Organoiden menschlicher Blutgefäße aus pluripotenten Stammzellen. Diese Technologie kann verwendet werden, um Aspekte der Vaskulogenese, Angiogenese, Gefäßerkrankungen sowie vaskuläre Pathologien zu untersuchen. Die Reproduzierbarkeit und der hohe Durchsatz sowie die Konsistenz über viele verschiedene Stammzelllinien hinweg sind starke Vorteile dieser Technik.In Bezug auf ihre Anwendung skizzieren einige unserer früheren Forschungsarbeiten die Verwendung von Blutgefäßorganoiden zur Untersuchung der morphologischen Veränderungen für das Gefäßsystem von Diabetikern und erforschen medikamentöse Behandlungsmöglichkeiten für diabetische Vaskulopathie. Die ordnungsgemäße Aufrechterhaltung der ursprünglichen Stammzellpopulation, die Verhinderung der Verklumpung der Aggregate und die Gewährleistung eines nahezu homogenen Aggregatdurchmessers sind wesentliche Faktoren für die Erzeugung guter Blutgefäßorganoide. Beginnen Sie mit der Erzeugung von Aggregaten unter Verwendung kultivierter humaner pluripotenter Stammzellen (hPSCs) mit einer Konfluenz von 70 %.Mit einer Pipette oder einem Vakuumsystem wird das Nährmedium abgesaugt und durch einen Milliliter Zelldissoziationsreagenz ersetzt, bevor die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert werden. In der Zwischenzeit wird das erforderliche Volumen des Aggregationsmediums in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen gemäß der im Textmanuskript genannten Formulierung hergestellt. Nach der Inkubation der Zellen wird das Zelldissoziationsreagenz abgesaugt, bevor die Zellen in einem Milliliter Aggregationsmedium suspendiert werden.Pipettieren Sie den Inhalt vorsichtig auf und ab, um eine einzellige Suspension zu erzeugen. Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzählgerät oder unter einem Mikroskop und berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen, die für die Aggregatbildung erforderlich sind. Die Viabilitätsanzeige der Zellen zeigt eine Einzelzellsuspension mit geringen bis gar keinen Clustern.Saugen Sie den Überstand aus dem Röhrchen ab und geben Sie das entsprechende Volumen der Zellsuspension in das Aggregationsmedium in dem 15-Milliliter-Kegelröhrchen aus hochklarem Polypropylen und pipettieren Sie die verdünnte Zellsuspension vorsichtig auf und ab, um eine homogene Zellverteilung zu gewährleisten. Pipettieren Sie drei Milliliter der verdünnten Zellsuspension in jede gewünschte Vertiefung der Sechs-Well-Kulturplatte mit extrem niedriger Bindung. Legen Sie die Platte in den Inkubator und minimieren Sie jegliche Störungen, um die Größe und Form der Aggregate zu erhalten.Bereiten Sie das Mesodermmedium wie im Textmanuskript beschrieben vor. 24 Stunden nach der Aussaat der Zellen die Kulturplatte aus dem Inkubator nehmen. Schwenken Sie die Platte in kreisförmigen Bewegungen, um die Aggregate in der Mitte jedes Brunnens anzusammeln.Mit einer Ein-Milliliter-Pipette werden die Aggregate mit dem Medium aus jeder Vertiefung vorsichtig in das entsprechende konische Röhrchen überführt. Lassen Sie die Aggregate eine Stunde lang in den konischen Rohren bei Raumtemperatur sedimentieren. Nach dem Sedimentieren wird der Überstand vorsichtig mit einer Pipette oder einer hochempfindlichen Ansaugpumpe angesaugt, ohne die abgesetzten Aggregate zu stören.Resuspendieren Sie die Aggregate in jedem Röhrchen, indem Sie zwei Milliliter Mesoderm-Induktionsmedium hinzufügen. Als nächstes übertragen Sie die Suspension aus jedem Röhrchen zurück in die entsprechende Vertiefung der Sechs-Well-Kulturplatte mit extrem niedrigem Aufsatz. Stellen Sie den Teller bei 37 Grad Celsius in den Inkubator und lassen Sie ihn bis zum vierten Tag stehen.Nehmen Sie am vierten Tag die Kulturplatte aus dem Inkubator und schütteln Sie die Platte dann in kreisenden Bewegungen, um die Aggregate in der Mitte jeder Vertiefung zu sammeln. Mit einer Ein-Milliliter-Pipette werden die Aggregate mit dem umgebenden Medium aus jeder Vertiefung vorsichtig in das entsprechende konische Rohr überführt. Stellen Sie einen Timer auf 30 Minuten, damit sich die Zuschlagstoffe in den Rohren absetzen können.Sobald die Aggregate sedimentiert sind, bereiten Sie die Kulturplatten wie zuvor gezeigt vor und legen Sie sie bis zum sechsten Tag bei 37 Grad Celsius in den Inkubator. Für die Einbettung von Aggregaten und die Induktion von Gefäßsprossen wird das gewünschte Endvolumen der extrazellulären Matrixlösung vorbereitet, während auf Eis gearbeitet wird. Pipettieren Sie 500 Mikroliter des ECM in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte, um die erste Schicht des ECM-Sandwiches zu bilden.Um eine effektive Polymerisation der ersten ECM-Schicht zu gewährleisten, legen Sie die Platte für zwei Stunden in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Gegen Ende der zweistündigen Inkubationszeit beginnen Sie mit der Arbeit mit den Aggregaten in der Kulturplatte. Sammeln Sie die Aggregate in der Mitte jeder Vertiefung, bevor Sie die Aggregate und das Medium mit einer Ein-Milliliter-Pipette vorsichtig aus jeder Vertiefung in ein entsprechendes konisches 15-Milliliter-Rohr überführen.Lassen Sie die Aggregate 10 bis 15 Minuten ruhen, bevor Sie den Überstand ansaugen. Halten Sie anschließend die konischen Röhrchen mit den Aggregaten fünf Minuten lang auf Eis. Arbeiten Sie schnell und vorsichtig und resuspendieren Sie die Aggregate in 500 Mikrolitern ECM ohne Blasenbildung.Schichten Sie die ECM-Aggregatsuspension mit einer Pipette auf die bereits polymerisierte erste ECM-Schicht innerhalb des Wells in der 12-Well-Platte. Bereiten Sie in der Zwischenzeit das Keimmedium wie im Textmanuskript beschrieben vor. Nach zweistündiger Inkubation bei 37 Grad Celsius wird ein Milliliter auf 37 Grad Celsius vorgewärmtes Keimmedium in die Vertiefung gegeben, um eine Differenzierung der Blutgefäße zu induzieren.Verwenden Sie unter sterilen Bedingungen das abgerundete Ende eines sterilen Spatels, um die EZM-Sprossungsmatrix zu lösen, die die Gefäßnetzwerke enthält. Anschließend wird die gelöste Gelscheibe mit einer sterilen Pinzette und dem abgerundeten Ende eines sterilen Spatels vorsichtig auf den Deckel einer 10-Zentimeter-Kulturschale übertragen. Legen Sie das Gel unter ein Stereomikroskop, das auf die gewünschte Vergrößerung und den gewünschten Fokus eingestellt ist, auf den Deckel und schneiden Sie mit sterilen Nadeln einzelne Blutgefäßnetzwerke heraus, um die Menge der dabei erhaltenen nicht-vaskularisierten EZM zu begrenzen.Übertragen Sie die isolierten Organoide vorsichtig zurück in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz, die drei Milliliter Keimmedium enthält. Anschließend werden die einzelnen Organoide mit einer Ein-Milliliter-Pipette in die entsprechende Anzahl von Vertiefungen in einer 96-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz übertragen. Geben Sie nach dem Transfer 200 Mikroliter vorgewärmtes Keimmedium in jede Vertiefung der 96-Well-Platte.Stellen Sie vier bis sechs Tage nach der Isolierung in der 96-Well-Platte sicher, dass die Organoide eine runde und gesunde Morphologie besitzen, bevor Sie mit der Fixierung und Färbung fortfahren. Bilder des schrittweisen Fortschreitens der Erzeugung des menschlichen Blutgefäßorganoids (hBVO) aus hPS-Zellen wurden unter Hellfeld aufgenommen. Am Tag Null wurden aus der hPSC-Kultur Aggregate mit einem Durchmesser von 30 bis 100 Mikrometern erzeugt.Subtile Veränderungen in der Größe und Form der Aggregate wurden bei der Induktion des Mesoderms am ersten Tag beobachtet, die sich am vierten Tag weiter änderten, als die Aggregate einem vaskulären Priming unterzogen wurden. Eine nahezu radialsymmetrische frühe Gefäßkeimung kann am siebten Tag, einen Tag nach der Einbettung der Aggregate in die Keimmatrix, beobachtet werden. Am neunten Tag wurde eine gesunde organoide Morphologie und ein fortgesetztes Gefäßsprießen beobachtet, das sich bis zum 10. Tag zu Gefäßen im Spätstadium entwickelte, als die dichten Zellstrukturen im Organoidzentrum fast verschwanden.Die für reife menschliche Blutgefäßorganoide typische Morphologie wurde an Tag 15 deutlich beobachtet. Die Whole-Mount-Färbung der reifen hBVOs an Tag 15 zeigte ein ausgedehntes und zusammenhängendes endotheliales Netzwerk, das CD31-positiv war und von PDGFR-beta-positiven Parasiten und SMA-positivem alpha-glattem Muskelaktin umgeben war. Die PDGFR-beta-positiven und SMA-positiven Wandzellen, die die endothelialen Gefäßnetzwerke einkapseln, sind gut beobachtet.Eine kontinuierliche Kollagen-IV-positive Basalmembran, die die Gefäßnetzwerke umhüllt, wurde ebenfalls beobachtet. Die Gewährleistung einer ordnungsgemäßen Polymerisation der extrazellulären Matrix während des Einbettungsschritts ist entscheidend für eine effektive Sprossung der Blutgefäße. Forscher haben unsere Blutgefäß-Organoid-Technologie genutzt, um frühe vaskuläre Kompartimente in bereits etablierten Organoidmodellen wie Gehirn und Niere zu erzeugen, die zuvor avaskulär waren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Forschung

Biotechnik

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalierbare Generierung von reifen Zerebellar-Organoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen und Charakterisierung durch Immunostainierung

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Geführte Differenzierung reifer Nierenpodozyten aus human induzierten pluripotenten Stammzellen unter chemisch definierten Bedingungen

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...