Name: generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells
Uploaded: 2023-01-20T13:35:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

אנו מודים לכל חברי המעבדות שלנו על הקלט והדיונים הקריטיים. JMP קיבל מימון מקרן T. von Zastrow, פרס FWF Wittgenstein (Z 271-B19), האקדמיה האוסטרית למדעים, Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking (JU) תחת הסכם מענק מס '101005026, Leducq Transatlantic Networks of Excellence of Excellence in Cardiovascular Research, Allen Institute Distinguished Investigator Program ותוכנית 150 קתדרות המחקר של קנדה F18-01336 וכן מענקי COVID-19 של המכונים הקנדיים לחקר הבריאות F20-02343 ו- F20-02015.

<ol>
	<li>Okwuosa, I. S., Lewsey, S. C., Adesiyun, T., Blumenthal, R. S., Yancy, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+disparities+in+cardiovascular+disease:+Challenges+and+solutions.">Worldwide disparities in cardiovascular disease: Challenges and solutions.</a> International Journal of Cardiology. 202, 433-440 (2016).</li><li>Page, R. L., Ghushchyan, V., Nair, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+to+action:+Responding+to+the+future+forecasting+of+cardiovascular+disease+in+America.">A call to action: Responding to the future forecasting of cardiovascular disease in America.</a> American Health &amp; Drug Benefits. 4 (5), 280-288 (2011).</li><li>Ferrara, N., Davis-Smyth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+vascular+endothelial+growth+factor.">The biology of vascular endothelial growth factor.</a> Endocrine Reviews. 18 (1), 4-25 (1997).</li><li>Ishitobi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flk1-GFP+BAC+Tg+mice:+An+animal+model+for+the+study+of+blood+vessel+development.">Flk1-GFP BAC Tg mice: An animal model for the study of blood vessel development.</a> Experimental Animals. 59 (5), 615-622 (2010).</li><li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells,+pericytes+and+astrocytes.">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+creating+tissue-engineered+biomimetic+blood+vessels+using+3D+bioprinting+technology.">A novel strategy for creating tissue-engineered biomimetic blood vessels using 3D bioprinting technology.</a> Materials. 11 (9), 1581 (2018).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Wimmer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+blood+vessel+organoids+as+a+model+of+diabetic+vasculopathy.">Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy.</a> Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).</li><li>Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+arteries+to+capillaries:+Approaches+to+engineering+human+vasculature.">From arteries to capillaries: Approaches to engineering human vasculature.</a> Advanced Functional Materials. 30 (37), 1910811 (2020).</li><li>Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+blood+vessel+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (11), 3082-3100 (2019).</li><li>Monteil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SARS-CoV-2+infections+in+engineered+human+tissues+using+clinical-grade+soluble+human+ACE2.">Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2.</a> Cell. 181 (4), 905-913 (2020).</li><li>Patsch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=generation+of+vascular+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).</li><li>Bruveris, F. F., Ng, E. S., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF,+FGF2,+and+BMP4+regulate+transitions+of+mesoderm+to+endothelium+and+blood+cells+in+a+human+model+of+yolk+sac+hematopoiesis.">VEGF, FGF2, and BMP4 regulate transitions of mesoderm to endothelium and blood cells in a human model of yolk sac hematopoiesis.</a> Experimental Hematology. 103, 30-39 (2021).</li><li>Julian, L., Olson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+coiled-coil+containing+kinases+(ROCK):+Structure,+regulation,+and+functions.">Rho-associated coiled-coil containing kinases (ROCK): Structure, regulation, and functions.</a> Small GTPases. 5, 29846 (2014).</li><li>Anitua, E., Prado, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+reproducibility+in+stem+cell+and+PRP+therapies.">Addressing reproducibility in stem cell and PRP therapies.</a> Trends in Biotechnology. 37 (4), 340-344 (2019).</li><li>McMurtrey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytic+models+of+oxygen+and+nutrient+diffusion,+metabolism+dynamics,+and+architecture+optimization+in+three-dimensional+tissue+constructs+with+applications+and+insights+in+cerebral+organoids.">Analytic models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).</li><li>McKeown, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+normoxia,+physoxia+and+hypoxia+in+tumours-Implications+for+treatment+response.">Defining normoxia, physoxia and hypoxia in tumours-Implications for treatment response.</a> The British Journal of Radiology. 87 (1035), 20130676 (2014).</li><li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy.">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> British Journal of Cancer. 9 (4), 539-549 (1955).</li><li>Olive, P. L., Vikse, C., Trotter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxygen+diffusion+distance+in+tumor+cubes+using+a+fluorescent+hypoxia+probe.">Measurement of oxygen diffusion distance in tumor cubes using a fluorescent hypoxia probe.</a> International Journal of Radiation Oncology. 22 (3), 397-402 (1992).</li><li>Torres Filho, I. P., Leunig, M., Yuan, F., Intaglietta, M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+microvascular+and+interstitial+oxygen+profiles+in+a+human+tumor+in+SCID+mice.">Noninvasive measurement of microvascular and interstitial oxygen profiles in a human tumor in SCID mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2081-2085 (1994).</li><li>Lanzen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+demonstration+of+instabilities+in+oxygen+concentrations+within+the+extravascular+compartment+of+an+experimental+tumor.">Direct demonstration of instabilities in oxygen concentrations within the extravascular compartment of an experimental tumor.</a> Cancer Research. 66 (4), 2219-2223 (2006).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible,+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS One. 3 (2), 1565 (2008).</li><li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=generation+of+vascularized+brain+organoids+to+study+neurovascular+interactions.">generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions.</a> eLife. 11, 76707 (2022).</li></ol>

אין קשר בין האינטרסים הכספיים של המחברים לבין המחקר המוצג. טכנולוגיית אורגנואיד כלי הדם קיבלה רישיון מחברת Stemcell Technologies. J.M.P. היא מייסדת ובעלת מניות בחברת Angios Biotech המפתחת אורגנואידים של כלי דם כטיפול בהשתלת כלי דם. בקשת פטנט הקשורה לעבודה זו הוגשה תחת פטנט לא. US20200199541A1, ומנה את ריינר א. וימר, יוזף מ. פנינגר ודונצ'ו קריאשקי כממציאים.

פריצות דרך אחרונות בתרביות אורגנואידים שמקורם בתאי גזע סיפקו את המסגרת למודלים מתקדמים יותר ורלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית של כלי הדם האנושיים. מודל אורגנואיד כלי הדם האנושי (hBVO) המוצג כאן, שפותח במעבדהשלנו 8,10, מספק אמצעי רב עוצמה לחקור לא רק היבטים נוספים של כלי הדם האנושיים, אלא גם דרכים חדשות של מודלים של מחלות וטיפול רגנרטיבי 8,10,11. מודלים מרובים in vivo שימשו כדי לחקור את ההתפתחות וההבשלה של כלי דם, מחלות כלי דם ותפקוד לקוי של האנדותל 3,4. גישות שונות משלבות תאים בודדים ומרובים המוגדרים על ידי שושלת שמקורם בתאי גזע או מבודדים מרקמות בוגרות in vivo כדי ליצור רשתות כלי דם אנושיות משוכפלות 5,6. הפרוטוקול המוצג כאן ממנף את עקרון הביולוגיה ההתפתחותית והארגון העצמי כדי להניב את השושלת הרב-תאית הראשונה אי פעם של רשתות כלי דם אנושיות שניתן ליצור, למעשה, מ-hPSC 8,10 יחיד.
לכל קו תאי גזע יש מטען גנטי ייחודי והוא שונה מאחרים מבחינת המקור שלו, תפקודו והיענותו15. לכן, הפרוטוקול עבור אורגנואידים של כלי דם אנושיים (hBVOs) פותח ועבר אופטימיזציה כדי להבטיח תאימות פרוטוקול חזקה וניתנת לשחזור עם מספר (>12) קווי hPSC שונים 8,10. השיטה המתוארת כאן מייצרת אורגנואידים של כלי דם שמקורם ב-hPSC במשך שבועיים. עם זאת, שינויים בהרכב המדיה או בטכניקות ביצירת hBVO עלולים להוביל ליצירת רשת כלי דם ואורגנואידים לא יעילה. שיעורי ההתרבות המשתנים של קווי תאי גזע בודדים משפיעים במידה ניכרת גם על יכולת הרבייה של ניסויים בתאי גזע15, ולכן תרביות אורגנואידים. לדוגמה, ביצירת BVOs, תאים מתרבים יותר או מספרים גבוהים יותר של אגרגטים גדולים של יום 1 כפופים מטבעם לסביבות מטבוליות שונות ולפרמטרים שונים של דיפוזיה של גז וחומרים מזינים. זה, בתורו, משנה את זמני החשיפה לגורם הצמיחה ואת היעילות, את מידת ההתמיינות ואת הפריימינג של כלי הדם, והכי חשוב, את היכולת ליצור רשתות כלי דם עם הטמעת האגרגטים בקולגן 1 ובמטריצת קרום המרתף המסיס.
הדיפוזיה הפסיבית של חמצן וניהול חומרים מזינים חיוניים מסביבה חיצונית אינה אידיאלית לצמיחת תאים לטווח ארוך של אורגנואידים תלת-ממדיים ומורפוגנזה של רקמות במבחנה16. למרות שהדבר תלוי במספר גורמים (כלומר, קצב חילוף החומרים של הרקמות, הזמינות הביולוגית של חומרי המזון והגזים, סביבה סטטית או דינמית), נקבעה מגבלת דיפוזיה כללית של 150 מיקרומטר O2 וחומרים מזינים עבור רקמות בתרבית במבחנה, בהתחשב בכך שמבחינה פיזיולוגית, רקמות אנושיות מציגות חבלים של תאים חיים בטווח של 150 מיקרומטר מכלי דם מחוררים17. למרות שמרחקי דיפוזיה יעילים של גז וחומרים מזינים של 70-200 מיקרומטר הוצעו גם 18,19,20,21, צפיפות המבנה, הטמפרטורה, ה- pH והרכב המדיה משפיעים באופן משמעותי על יעילות הדיפוזיה. הודות לאופטימיזציה של שטח הפנים ותקשורת קולטני אינטגרין-בטא לאחר יום 6 הטבעה, אגרגטים בקוטר 250-300 מיקרומטר מתפקדים טוב יותר מאלו בקוטר >500-600 מיקרומטר, וכתוצאה מכך תהליך הנבטת כלי דם שלם וליבת אורגנואיד מעובה מינימלית. לפיכך, גודל הצבירה הוא קריטי ויכול להיות מושפע הן ממספר התאים המשמשים במהלך הזריעה הראשונית והן מהזמן המוקצב להיווצרות הצבירה. לוחות מיקרווול המאפשרים שליטה על גודל הצבר והמספר22 הם חלופה בת קיימא לטכניקת היווצרות האגרגטים הסטוכסטית הנובעת משימוש בלוחות חיבור 6 בארות נמוכים במיוחד בפרוטוקול זה. עקביות בתזמון ובניהול הגדלים המצטברים במהלך 6 הימים הראשונים של פרוטוקול hBVO היא אחד האינדיקטורים המכריעים, אם לא החשוב ביותר, לפיתוח מוצלח של אורגנואידים של כלי דם בתום לב.
יש להשלים שינויים בינוניים ביום 1 (השראת מזודרם) וביום 4 (השראת כלי דם) בשילוב עם שיקוע האגרגטים. למרות שצנטריפוגה היא חלופה מפתה, הכוחות הנוספים המופעלים על האגרטים החלשים עלולים לגרום לגושים, הרכבה וגזירה לא רצויים, המשפיעים לרעה על הדיפרנציאציה, ההתבגרות ויעילות ההנבטה בשלבים מאוחרים יותר של הפרוטוקול. עבודה על קרח במהלך היום 6 תהליך הטבעה הוא קריטי לשמירה על פילמור ECM תקין והיווצרות שכבות. במהלך השראת ההטבעה וההנבטה של האגרגטים, חשיפת ה-ECM לטמפרטורות מעל 4°C ו/או ECM pH שאינו 7.4 תשפיע לא רק על שיעורי הפילמור ושלמות שכבת ה-ECM אלא גם על יעילות ההנבטה של האגרגטים המשובצים. האופי האלסטי של מטריצת הנבטת ECM מאפשר ניתוק והובלה קלים מצלחת התרבית בת 12 הקידוחים למשטח החיתוך הסטרילי. אורגנואידים בודדים שהוסרו מהמטריצה והועברו ללוחות 96 בארות חיבור נמוכים במיוחד יצרכו את שארית ה- ECM שמסביב וישמרו על רשתות מיקרו-כלי אנדותל מצופים תאי קיר מאורגנים עם קרום מרתף רציף.
אמנם לא מכוסה בהצעה זו, שינויים בהרכבי התקשורת יכולים לשכפל מחלות אשר, בתורו, לעורר תגובות פתולוגיות hBVOs 8,11. גבולות מידול מחלות באמצעות מערכת hBVO רחוקים מלהיות ידועים, וזה בהחלט תחום שצריך לחקור. היישום של טכנולוגיית אורגנואיד כלי הדם שלנו בכלי הדם של מבנים אורגנואידים אווסקולריים בעבר23 הוא גם בעל השפעה ועניין משמעותיים.

תפקוד לקוי של כלי הדם ומחלות כלי דם נוכחים עם סיבוכים ניכרים בתפקודי איברים. מחלות לב וכלי דם (CVD) הן סיבת המוות המובילה בעולם1 והיא גם הגורם העיקרי לעלייה בעלויות הבריאות בארצות הברית. מספרי מקרי CVD גדלים מדי שנה, ומספר עולה של מקרים אלה מתרחש בקבוצות גיל צעירות יותר (20-45 שנים)2. מודלים מרובים in vivo פותחו כדי לחקור את ההתפתחות וההבשלה של כלי דם, מחלות כלי דם ותפקוד לקוי של האנדותל 3,4. כיום, שיטות המשלבות תאים בודדים ומרובים המוגדרים על ידי שושלת שמקורם בתאי גזע או שבודדו מרקמות בוגרות in vivo יכולות ליצור רשתות כלי דם המשכפלות היבטים של תפקוד כלי הדם האנושיים והאנטומיה 5,6. כלי הדם התפתחו כאחת המערכות התפקודיות הראשונות במהלך ההתפתחות מהמזודרם, והם מתארגנים באמצעות תהליך הרכבה הנקרא "וסקולוגנזה" או על ידי התרחבות והסתעפות מכלי דם קיימים, המכונה "אנגיוגנזה"7.
תוך מינוף כוחה של ביולוגיה התפתחותית והרכבה מכוונת עצמית, וימר ועמיתיו דיווחו על אורגנואידים תלת-ממדיים ראשונים של כלי דם אנושיים בעלי ארגון עצמי מתאי גזע גזעיים (hPSC), המציגים את המאפיינים הפונקציונליים, המורפולוגיים והמולקולריים של כלי הדם הזעירים האנושיים8. בדומה לכלי הדם האנושיים9, hBVOs אלה נוצרים ונוכחים עם אנדותל, קרום מרתף רציף, ותאי ציור קיר סביבו 8,10. hBVOs ניתן להשתיל in vivo ו anastomosed עם מחזור הדם אנדוגני. הם יכולים גם לעבור התבגרות במבחנה ולשמש מודלים למחלות לב וכלי דם (כלומר, סוכרת)8 או טרופיזם רקמות בזיהומים וירוסים כגון SARS-CoV-211. בעוד שפרסמנו בעבר פרוטוקול כתוב10, לא קיים פרוטוקול וידאו זמין עבור טכניקה מורכבת זו.
באמצעות התקדמות הדרגתית תמציתית, היווצרות hBVO מושגת באמצעות היווצרות אגרגטים, השראת מזודרם באמצעות אגוניסט WNT, כירון (CHIR99021), וחלבון מורפוגני עצם - 4 (BMP4)12,13, השראת כלי דם באמצעות גורם גדילה אנדותל כלי דם A (VEGFA) ופורסקולין (Fors)12, והטבעה במטריצת הנבטה מותאמת אישית 8,10. התבגרות כלי הדם והיווצרות הרשת עוקבות אחר הטבעה של האגרגטים במטריצת הנבט. רשתות כלי דם אנושיים אלה נוצרות תוך 2-3 שבועות וניתן להסיר אותן ממטריצת ההנבטה ולגדול עוד יותר במערכות תרבית ניתנות להרחבה למשך עד 6 חודשים. כאן, נהלים מונחים אופטית מסופקים להיווצרות ויישום של כלי דם נגזר תאי גזע אנושיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% sodium bicarbonate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell dissociation reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1391, 0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-rabbit IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-546-152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-sheep IgG</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647&#8211;anti-goat IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-606-147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Faster</td>
			<td></td>
			<td>SafeFAST Premium 212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-111-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF806</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td>Multifuge 4 KR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td></td>
			<td>Galaxy 170S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Basement membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (22 x 50 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3&#8211;anti-mouse IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-166-150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modefied Eagle&#39;s Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648-10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovien Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-093-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Heraguard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted contrasting tissue culture microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Vert.A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer&#160;</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>IS009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-essential amino acids (NEAAs)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (4%) in PBS</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BM-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3169S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips (6.5-10)</td>
			<td>Mquant, Millipore</td>
			<td>109543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (P1000, P200 and P20)</td>
			<td>Gilson, Integra Pipetboy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime Surface-U 96-well plates&#160;</td>
			<td>Sumilon</td>
			<td>MS9096-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PurCol&#160;</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS gel</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS mounting solution</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5, 10 and 25 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357529, 357530, 357515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>vSMC/Pericyte</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2547</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel micro spatula (rounded end)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel spoon (double-ended)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BelArt H367290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemflex medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>stem cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10639011</td>
			<td>flexible serum-free medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 &#956;L)</td>
			<td>Biozym, Surphob</td>
			<td>VT0270, VT0250, VT0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 12-well plates TC&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 6-well plates&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30720113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>mammalian cell dissociating enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low-attachment 6-well plates</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Isotemp 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>688000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells

אורגנואיד מוגדר כרקמה רב-תאית מהונדסת במבחנה המחקה את האיבר המקביל לה in vivo כך שניתן להשתמש בו כדי לחקור היבטים מוגדרים של אותו איבר בצלחת תרבית רקמה. הרוחב והיישום של מחקר אורגנואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) התקדמו באופן משמעותי וכוללים את המוח, הרשתית, צינור הדמעות, הלב, הריאות, המעי, הלבלב, הכליות וכלי הדם, בין מספר רקמות אחרות. פיתוח שיטות ליצירת כלי דם אנושיים, במיוחד, פתח את הדרך למידול התפתחות כלי דם אנושיים ומחלות במבחנה ולבדיקה וניתוח של תרופות חדשות או טרופיזם רקמות בזיהומים וירוסים, כולל SARS-CoV-2. פרוטוקולים מורכבים וממושכים ללא הנחיה חזותית מעכבים את יכולת השחזור של אורגנואידים רבים שמקורם בתאי גזע. בנוסף, הסטוכסטיות האינהרנטית של תהליכי היווצרות אורגנואידים וארגון עצמי מחייבת יצירת פרוטוקולים אופטיים כדי לקדם את ההבנה של רכישה ותכנות של גורל התא. כאן, פרוטוקול מונחה חזותית מוצג עבור הדור של אורגנואידים תלת-ממדיים של כלי דם אנושיים (BVOs) שהונדסו מ-hPSCs. BVOs מציגים קרום מרתף רציף, תאי אנדותל וסקולריים וארטיקולציה מאורגנת עם תאי קיר, ומציגים את התכונות הפונקציונליות, המורפולוגיות והמולקולריות של כלי הדם הזעירים האנושיים. היווצרות BVO מתחילה באמצעות היווצרות מצטברת, ואחריה מזודרם ואינדוקציה וסקולרית. הבשלת כלי הדם והיווצרות הרשת יזומות ונתמכות על ידי הטמעת אגרגטים בקולגן תלת-ממדי ובמטריצת קרום מרתף מסיסה. רשתות כלי שיט אנושיים נוצרות תוך 2-3 שבועות וניתן להגדיל אותן עוד יותר במערכות תרבית מדרגיות. חשוב לציין, BVOs מושתלים בעכברים מדוכאי חיסון אנסטומוזים עם זרימת עכבר אנדוגנית ומציינים לעורקים פונקציונליים, ורידים ועורקים. הפרוטוקול הנוכחי מונחה חזותית יקדם את מחקר האורגנואידים בבני אדם, במיוחד ביחס לכלי דם בהתפתחות תקינה, כלי דם של רקמות ומחלות.

השלבים המתוארים בפרוטוקול זה פותחו במיוחד כדי להניב שיטה מבוקרת ומדויקת ליצירת אורגנואידים של כלי דם אנושיים מתאי גזע גזעיים (hPSC). יצירת אגרגטים בקוטר 30-100 מיקרומטר מתרביות hPSC מסמנת את נקודת ההתחלה של הפרוטוקול (איור 1, איור 2B). הצברים מובלים דרך אינדוקציות הדרגתיות לכיוון מזודרם (יום 1-יום 4) ושושלות כלי דם (יום 4-יום 6) לפני הטבעה (יום 6) (איור 2A-D), אשר הכרחי להיווצרות רשת כלי שיט. הנבטת כלי דם כמעט רדיאלית סימטרית חייבת להיראות על-ידי d7 או d8 (איור 2E) ולהמשיך דרך d10 (איור 2F,G). העברת ה-hBVOs מה-ECM ללוחות החיבור האולטרה-נמוכים של 96 בארות מפחיתה את השבריריות של רשתות ההנבטה ומאפשרת תחזוקה מתמשכת בתנאי תרבית מתלה (איור 2H) למשך עד 6 חודשים. עד d15, hBVOs מציגים רשת אנדותל נרחבת ומחוברת (CD31+) המוקפת בפריציטים (PDGFR-ß+) ואקטין שרירים חלקים (SMA+) (איור 3A-D). קרום מרתף רציף של קולגן IV (ColIV+) עוטף את רשתות כלי הדם (איור 3E). תאי אנדותל (CD31+, VE-Cadherin+) ופריציטים (PDGFR-ß+) מהווים כ-30%-35% ו-60%-65% מאוכלוסיות התאים האורגנואידים, בהתאמה8. ההנבטה הפעילה של כלי הדם מתרחשת בהנחיית אוכלוסיית תאי קצה מאורגנים אנדוגנית (CD31+) המציגה מורפולוגיה טיפוסית של תאי חוד, כגון פיליפודיה מוגזמת 8,10. ניתן לראות את ההצגה של תאי ציור קיר PDGFR-ß+ ו-SMA+ העוטפים את רשתות כלי האנדותל על-ידי d15 של תהליך ההבשלה האורגנואידי (איור 3A,C). לאחר הסרה מה-ECM והבשלה בתרבית ההשעיה (כלומר, d15), hBVOs ניתנים לניתוח או השתלה בהתאמה מתחת לכמוסת הכליה של העכבר.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig01.jpg"> איור 1: סכמה של פרוטוקול hBVO המדגישה את העיתוי ואת ההתקדמות בשלבים. מתרביות hPSC או hiPSC הומוגניות לכאורה, היווצרות מצטברת מתרחשת בנוכחות מעכב רו-קינאז Y27632. BMP4 ו CHiR תוספת מדיום משמש כדי להנחות את האגרגטים לקראת גורל mesodermal. מדיום השראת מזודרם מוחלף על ידי VEGFA ומדיום בתוספת פורסקולין כדי לעורר את האגרגטים לעבר שושלת כלי דם. תורים מכניים וכימיים המושגים באמצעות הטבעה של האגרגטים במטריצת קולגן I וקרום מרתף מסיס וחשיפה לתווך המכיל VEGFA ו- FGF2 גורמים להנבטת כלי דם כמעט רדיאלית סימטרית מגוף הצבירה. ניתן להסיר את רשתות כלי הדם שנוצרו מקולגן I ומממברנת המרתף המסיסה, ולהכניס אותן לתרבית תרחיף לצורך הבשלה נוספת, ניתוח או השתלה in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig02.jpg"> איור 2: התקדמות הדרגתית של דור hBVO שנלכד תחת שדה בהיר. (A) מורפולוגיה אופיינית של מושבות hPSC (H9) ביום -1. (B) יצירת אגרגטים hPSC (יום 0) על לוחות חיבור אולטרה-נמוכים של 6 בארות בנוכחות Y-27632. (C) השראת מזודרמיס של אגרגטים באמצעות BMP4 ותוספת ChiR (יום 1). ניתן להבחין גם בשינויים עדינים בגודל המצטבר ובצורה המצטברת. (D) יום 4 אגרגטים דרוכים לקראת שושלת כלי דם באמצעות VEGFA ותוספת פורסקולין. (E) הנבטת כלי דם מוקדמת ביום 7, יום לאחר הטמעת האגרגטים במטריצת ההנבטה וחשיפה למדיום הנבטה בתוספת VEGFA ו-FGF2 (יום 7). (F) מורפולוגיה אורגנואידית בריאה והמשך הנבטת כלי הדם ביום ה-9. (ז) כלי בשלב מאוחר הנובט ביום ה-10. באופן אידיאלי, מבני התאים הצפופים במרכז האורגנואידים נעלמו בשלב זה. (H) מורפולוגיה אופיינית של אורגנואידים בוגרים (יום 15) של כלי דם אנושיים. הסרת המטריצה שמסביב על ידי חיתוך והבשלה בלוחות תרבית 96 בארות חיבור נמוכים במיוחד מעצבת את האורגנואידים בצורה כדורית, כאשר רשתות הכלים שוכנות פנימיות. פסי קנה מידה: (A,B,E,F) 250 מיקרומטר; (C,D) 500 מיקרומטר; (G,H) 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig03.jpg"> איור 3: צביעה מלאה של אורגנואידים בוגרים (יום 15) של כלי דם אנושיים. (A) הצגה של אורגנואידים בוגרים (יום 15) של כלי דם אנושיים עם רשתות אנדותל מאורגנות (CD31+, מגנטה) וכיסוי פריציטים (PDGFR-β+, ציאן) ואקטין שריר חלק אלפא (SMA+, צהוב). (B) הגדלה גבוהה יותר של A המפרטת את הביטוי SMA+ (צהוב) ו- PDGFR-β+ (ציאן) של רשתות כלי השיט. (C) הצגה מפורטת של אינטראקציית אנדותל (CD31+, מגנטה), פריציט (PDGFR-β+, ציאן) ואקטין שריר חלק אלפא (SMA+, צהוב). (D) צביעה מלאה של כלי הדם אנדותל (CD31+, מגנטה)-שריר חלק (SMA+, צהוב) בחתך רוחב (משמאל) והגדלה גבוהה יותר (מימין) של אורגנואידים של כלי דם בוגרים. (E) היווצרות מכוונת עצמית של קרום מרתף כלי דם (Col IV+, גווני אפור) באמצעות הקשר הקרוב של תאי הקיר וצינורות האנדותל. פסי קנה מידה: (A,D [משמאל]) 100 מיקרומטר; (B,D[מימין],E) 25 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

פרוטוקול זה מתאר את היצירה של כלי דם המארגנים את עצמם מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ומושרים פלוריפוטנטים. רשתות כלי דם אלה מציגות רשת אנדותל נרחבת ומחוברת המוקפת בפריציטים, אקטין שריר חלק וקרום מרתף רציף.

יצירת אורגנואידים של כלי דם אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

פרוטוקול זה מתאר את הדור שלנו של אורגנואידים של כלי דם אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטים. טכנולוגיה זו יכולה לשמש לחקר היבטים של כלי דם, אנגיוגנזה, מחלות כלי דם, כמו גם פתולוגיות של כלי הדם. יכולת השחזור ואופי התפוקה הגבוהה, כמו גם העקביות שלה על פני קווי תאי גזע רבים ושונים, הם יתרונות חזקים של טכניקה זו.מבחינת היישום שלהם, חלק מהמחקרים הקודמים שלנו מתארים את השימוש באורגנואידים של כלי דם כדי לחקור את השינויים המורפולוגיים עבור כלי הדם של חולי סוכרת ובוחנים דרכים לטיפול תרופתי בכלי דם סוכרתיים. שמירה נכונה על אוכלוסיית תאי הגזע הראשונית, מניעת הצטברות האגרגטים והבטחת קוטר מצרפי כמעט הומוגני, אלה הם גורמים חיוניים ליצירת אורגנואידים טובים של כלי דם. התחל ליצור אגרגטים באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בתרבית, או hPSCs, בעלי מפגש של 70%.באמצעות פיפטה או מערכת ואקום, שאפו את מדיום התרבית והחליפו אותו במיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה של תאים לפני הדגירה על התאים למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בינתיים, הכינו את הנפח הדרוש של אמצעי צבירה בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, בעקבות הניסוח המוזכר בכתב היד של הטקסט. לאחר הדגירה על התאים, שאפו את מגיב הדיסוציאציה התאית לפני השעיית התאים במיליליטר אחד של תווך הצבירה.הקפיץ בעדינות את התוכן למעלה ולמטה כדי ליצור השעיה של תא יחיד. ספור את התאים באמצעות מכשיר ספירת תאים אוטומטי או תחת מיקרוסקופ, וחשב את מספר התאים הכולל הדרוש להיווצרות צבירה. קריאת הכדאיות של התא מציגה השעיה של תא בודד עם אשכולות נמוכים או ללא אשכולות.שאפו את הסופרנאטנט מהצינור והוסיפו את הנפח המתאים של תרחיף התא למדיום הצבירה בצינור החרוטי פוליפרופילן בעל בהירות גבוהה של 15 מיליליטר והפייטו בעדינות את תרחיף התא המדולל מעלה ומטה כדי להבטיח פיזור תאים הומוגני. פיפטה שלושה מיליליטר של תרחיף התא המדולל לתוך כל באר רצויה של צלחת תרבית חיבור שש בארות אולטרה נמוכה. מניחים את הצלחת באינקובטור וממזערים כל הפרעה כדי לשמור על גודל וצורת האגרגטים.הכינו את מדיית המזודרם כמתואר בכתב היד של הטקסט. 24 שעות לאחר הזריעה של התאים, מוציאים את צלחת התרבית מהאינקובטור. מערבלים את הצלחת בתנועה סיבובית כדי לצבור את האגרגטים במרכז כל באר.באמצעות פיפטה של מיליליטר, מעבירים בעדינות את האגרגטים עם המדיום מכל באר לתוך הצינור החרוטי המתאים. אפשרו לאגרגטים לשקע בצינורות החרוטיים בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר השקיעה, שאפו את הסופרנאטנט עם פיפטה או משאבה בעלת רגישות גבוהה בזהירות מבלי להפריע לצברים המתיישבים.השהה מחדש את האגרגטים בכל צינור על ידי הוספת שני מיליליטר של מדיום אינדוקציה מזודרם. לאחר מכן, להעביר את המתלה מכל צינור בחזרה לתוך הבאר המתאימה של צלחת חיבור אולטרה נמוך שש בארות תרבית. מניחים את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ומשאירים אותה עד היום הרביעי.ביום הרביעי, הוציאו את צלחת התרבית מהאינקובטור, ואז נערו את הצלחת בתנועה סיבובית כדי לאסוף את האגרגטים במרכז כל באר. באמצעות פיפטה של מיליליטר, מעבירים בעדינות את האגרגטים עם המדיום שמסביב מכל באר לתוך הצינור החרוטי המתאים. כוונו טיימר למשך 30 דקות כדי לאפשר לצברים לשקע בצינורות.לאחר שהמשקעים מצטברים, הכינו את לוחות התרבית כפי שהודגם קודם לכן והניחו אותם באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד היום השישי. להטבעה אגרגטית והשראת נבטי כלי, הכינו את הנפח הסופי הרצוי של תמיסת המטריצה החוץ תאית תוך כדי עבודה על קרח. פיפטה 500 מיקרוליטר של ECM לתוך באר אחת של צלחת 12 בארות כדי ליצור את השכבה הראשונה של כריך ECM.כדי להבטיח פילמור יעיל של שכבת ECM הראשונה, מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לקראת סוף הדגירה בת השעתיים, מתחילים לעבוד עם האגרגטים בצלחת התרבית. אספו את האגרגטים במרכז כל באר לפני שתשתמשו בפיפט של מיליליטר כדי להעביר בעדינות את האגרגטים והמדיום מכל באר לצינור חרוטי מתאים של 15 מיליליטר.הניחו לצברים להסתפק במשך 10 עד 15 דקות לפני שאתם שואפים את הסופרנטנט. לאחר מכן, לשמור את צינורות חרוט המכילים את האגרגטים על קרח במשך חמש דקות. עבודה מהירה וזהירה, להשעות מחדש את האגרגטים ב 500 מיקרוליטר של ECM ללא היווצרות בועה.באמצעות פיפטה, שכב את מתלה אגרגציית ECM על גבי שכבת ECM הראשונה שכבר פולימרית בתוך הבאר בלוח 12 בארות. בינתיים, הכינו את אמצעי הנביטה כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר שעתיים של דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מוסיפים מיליליטר אחד של תווך הנבטה שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס לתוך הבאר כדי לגרום להתמיינות כלי הדם.עבודה בתנאים סטריליים, השתמש בקצה המעוגל של מרית סטרילית כדי לשחרר את מטריצת הנבטת ECM המכילה את רשתות כלי הדם. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים סטריליים וקצה מעוגל של מרית סטרילית, מעבירים בזהירות את דיסק הג'ל המשוחרר על מכסה צלחת תרבית של 10 סנטימטרים. הניחו את הג'ל על המכסה תחת מיקרוסקופ סטריאו המותאם להגדלה ולמיקוד הרצויים, והשתמשו במחטים סטריליות כדי לחתוך רשתות כלי דם בודדים, בניסיון להגביל את כמות האק"מ הלא וסקולרי המתקבל בתהליך.מעבירים בעדינות את האורגנואידים המבודדים חזרה לבאר אחת של צלחת בעלת שש בארות חיבור נמוכה במיוחד המכילה שלושה מיליליטר של תווך הנבטה. לאחר מכן, באמצעות פיפטה של מיליליטר, להעביר את אורגנואידים יחיד למספר המתאים של בארות בחיבור נמוך במיוחד 96 בארות לוחית. לאחר ההעברה, להוסיף 200 מיקרוליטר של אמצעי הנבטה שחומם מראש לתוך כל באר של צלחת 96 באר.ארבעה עד שישה ימים לאחר הבידוד בצלחת של 96 בארות, ודא שלאורגנואידים יש מורפולוגיה עגולה ובריאה לפני שתמשיך לתקן ולהכתים אותם. תמונות של התקדמות הדרגתית של כלי הדם האנושי אורגנואיד, או hBVO, דור מ hPSCs צולמו תחת שדה בהיר. ביום האפס נוצרו אגרגטים בקוטר של 30 עד 100 מיקרון מתרבית hPSC.שינויים קלים בגודל ובצורה של האגרגטים נצפו עם השראת מזודרם ביום הראשון, אשר השתנו עוד יותר ביום הרביעי כאשר האגרגטים עברו פריימינג וסקולרי. ניתן לצפות בהנבטת כלי דם מוקדמת כמעט רדיאלית ביום השביעי, יום לאחר הטמעת האגרגטים במטריצת הנבטה. מורפולוגיה בריאה של אורגנואידים והמשך הנבטת כלי דם נצפו ביום התשיעי, שהתקדם לכלי דם בשלב מאוחר שנבטו ביום ה-10 כאשר מבני התאים הצפופים במרכז האורגנואידים כמעט נעלמו.מורפולוגיה אופיינית לאורגנואידים של כלי דם אנושיים בוגרים נצפתה בבירור ביום ה -15. צביעה שלמה של hBVOs בוגרים ביום ה -15 הציגה רשת אנדותל נרחבת ומחוברת שהייתה חיובית CD31 ומוקפת בטפילים PDGFR-בטא חיוביים ואקטין שריר אלפא חלק חיובי SMA. תאי הקיר PDGFR-beta-positive ו-SMA חיוביים העוטפים את רשתות כלי הדם של האנדותל נצפו היטב.כמו כן נצפתה קרום מרתף רציף קולגן IV חיובי העוטף את רשתות כלי השיט. הבטחת פילמור תקין של המטריצה החוץ תאית בשלב ההטבעה היא קריטית להנבטה יעילה של כלי הדם. חוקרים השתמשו בטכנולוגיית האורגנואידים של כלי הדם שלנו כדי ליצור תאים מוקדמים של כלי דם במודלים אורגנואידים שכבר נקבעו, כגון מוח וכליות, שהיו בעבר אווסקולריים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

פיתוח, הרחבה, ו<em&gt; בvivo</emתאי גזע pluripotent&gt; ניטור של תאי NK אדם מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ומושרה (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

דור מדרגי של אורגנואידים המוח הקטן בוגר מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ואפיון על ידי אימונוסטיין

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

הבחנה מודרכת של פודוקיטים בוגרים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם בתנאים מוגדרים כימית

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

פיברובלסט נגזר רקמת חיבור מהונדסת אנושית עבור יישומי הקרנה

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...