Name: generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells
Uploaded: 2023-01-20T13:35:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Ringraziamo tutti i membri dei nostri laboratori per il contributo critico e le discussioni. JMP ha ricevuto finanziamenti dalla fondazione T. von Zastrow, dal premio FWF Wittgenstein (Z 271-B19), dall'Accademia austriaca delle scienze, dall'Impresa comune (JU) Innovative Medicines Initiative 2 nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 101005026, dalle reti transatlantiche di eccellenza Leducq nella ricerca cardiovascolare, dal programma Distinguished Investigator dell'Allen Institute e dal programma di cattedre di ricerca Canada 150 F18-01336, nonché dalle sovvenzioni COVID-19 del Canadian Institutes of Health Research F20-02343 e F20-02015.

<ol>
	<li>Okwuosa, I. S., Lewsey, S. C., Adesiyun, T., Blumenthal, R. S., Yancy, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+disparities+in+cardiovascular+disease:+Challenges+and+solutions.">Worldwide disparities in cardiovascular disease: Challenges and solutions.</a> International Journal of Cardiology. 202, 433-440 (2016).</li><li>Page, R. 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Non vi è alcuna relazione tra gli interessi finanziari degli autori e la ricerca presentata. La tecnologia degli organoidi dei vasi sanguigni è stata concessa in licenza a Stemcell Technologies. J.M.P. è fondatore e azionista di Angios Biotech che sviluppa organoidi dei vasi sanguigni come terapia di trapianto vascolare. Una domanda di brevetto relativa a questo lavoro è stata depositata sotto Pat. No. US20200199541A1, elencando Reiner A. Wimmer, Josef M. Penninger e Dontscho Kerjaschki come inventori.

Le recenti scoperte nelle colture organoidi derivate da cellule staminali hanno fornito il quadro per modelli più avanzati e fisiologicamente rilevanti di vascolarizzazione umana. Il modello di organoide dei vasi sanguigni umani (hBVO) qui presentato, sviluppato nel nostro laboratorio 8,10, fornisce un potente mezzo per esplorare non solo ulteriori aspetti della vasculogenesi umana, ma anche nuove strade di modellazione della malattia e terapia rigenerativa 8,10,11. Sono stati impiegati diversi modelli in vivo per esplorare lo sviluppo e la maturazione dei vasi sanguigni, la malattia vascolare e la disfunzione endoteliale 3,4. Approcci diversi combinano cellule definite da linee singole e multiple derivate da cellule staminali o isolate da tessuti adulti in vivo per creare reti vascolari umane replicative 5,6. Il protocollo qui presentato sfrutta il principio della biologia dello sviluppo e dell'auto-organizzazione per produrre le prime reti di vasi sanguigni umani multicellulari che possono essere generate, in sostanza, da un singolo hPSC 8,10.
Ogni linea di cellule staminali ha un corredo genetico unico e differisce dalle altre in termini di approvvigionamento, funzione e reattività15. Pertanto, il protocollo per gli organoidi dei vasi sanguigni umani (hBVO) è stato sviluppato e ottimizzato per garantire una compatibilità di protocollo robusta e riproducibile con più (>12) diverse linee hPSC 8,10. Il metodo qui descritto genera organoidi dei vasi sanguigni derivati da hPSC nell'arco di 2 settimane. Tuttavia, le modifiche alla composizione del mezzo e/o alle tecniche di generazione di hBVO possono portare a una rete di vasi e a una generazione di organoidi inefficaci. I diversi tassi di proliferazione delle singole linee di cellule staminali influiscono notevolmente anche sulla riproducibilità della sperimentazione sulle cellule staminali15 e, quindi, sulle colture organoidi. Ad esempio, nel generare i BVO, più cellule proliferative o un numero maggiore di grandi aggregati del giorno 1 sono intrinsecamente soggetti a diversi ambienti metabolici e parametri di diffusione di gas e nutrienti. Questo, a sua volta, cambia i tempi di esposizione e le efficienze del fattore di crescita, il grado di differenziazione e priming vascolare e, soprattutto, la capacità di formare reti di vasi dopo aver incorporato gli aggregati nel collagene 1 e nella matrice della membrana basale solubilizzata.
La diffusione passiva di ossigeno e la somministrazione di nutrienti essenziali da un ambiente esterno non è ideale per la crescita cellulare a lungo termine di organoidi 3D e morfogenesi tissutale in vitro16. Sebbene dipenda da diversi fattori (ad esempio, il tasso metabolico tissutale, la biodisponibilità dei nutrienti e dei gas, un ambiente statico o dinamico), è stato stabilito un limite generale di 150 μm O2 e di diffusione dei nutrienti per i tessuti coltivati in vitro, considerando che, fisiologicamente, i tessuti umani presentano cordoni di cellule viventi entro 150 μm dai vasi sanguigni perfusi17. Sebbene siano state proposte distanze di diffusione efficaci di gas e nutrienti di 70-200 μm anche18,19,20,21, la densità del costrutto, la temperatura, il pH e la composizione dei mezzi influenzano significativamente l'efficacia della diffusione. Grazie all'ottimizzazione dell'area superficiale e alla comunicazione del recettore integrina-beta dopo l'incorporazione del giorno 6, gli aggregati di 250-300 μm di diametro hanno prestazioni migliori rispetto a quelli >500-600 μm di diametro, risultando in un processo completo di germinazione dei vasi e in un nucleo organoide minimamente condensato. Pertanto, la dimensione dell'aggregato è cruciale e può essere influenzata sia dal numero di celle utilizzate durante la semina iniziale che dal tempo assegnato per la formazione degli aggregati. Le piastre a micropozzetti che consentono il controllo della dimensione dell'aggregato e del numero22 sono una valida alternativa alla tecnica di formazione di aggregati altrimenti stocastica risultante dall'uso di piastre a 6 pozzetti di attacco ultra-basse in questo protocollo. La coerenza nella tempistica e nella gestione delle dimensioni degli aggregati durante i primi 6 giorni del protocollo hBVO è uno dei, se non il più importante, indicatore dello sviluppo di organoidi di vasi sanguigni in buona fede.
Le variazioni del mezzo il giorno 1 (induzione del mesoderma) e il giorno 4 (induzione vascolare) devono essere completate in combinazione con la sedimentazione degli aggregati. Sebbene la centrifugazione sia un'alternativa allettante, le forze aggiuntive applicate alle aggerate debolmente assemblate possono causare aggregazione, assemblaggio e taglio indesiderati, che influiscono negativamente sulla differenziazione, sulla maturazione e sull'efficacia della germinazione nelle fasi successive del protocollo. Lavorare sul ghiaccio durante il processo di incorporazione del giorno 6 è fondamentale per preservare la corretta polimerizzazione ECM e la formazione degli strati. Durante l'induzione dell'incorporazione e della germinazione degli aggregati, l'esposizione dell'ECM a temperature superiori a 4 °C e/o a un pH ECM diverso da 7,4 influenzerà non solo i tassi di polimerizzazione e l'integrità dello strato ECM, ma anche l'efficienza di germinazione degli aggregati incorporati. La natura elastica della matrice di germinazione ECM consente un facile distacco e trasporto dal piatto di coltura a 12 pozzetti alla superficie di taglio sterile. I singoli organoidi rimossi dalla matrice e trasferiti a piastre ultra-basse da 96 pozzetti consumeranno la rimanente ECM circostante e manterranno reti di microvasi endoteliali rivestiti di cellule murali auto-organizzate con una membrana basale continua.
Sebbene non contemplate in questa proposta, le alterazioni delle composizioni dei media possono replicare malattie che, a loro volta, provocano risposte patologiche nelle hBVO 8,11. I confini della modellazione delle malattie utilizzando il sistema hBVO sono tutt'altro che ben noti, e questa è certamente un'area che ha bisogno di essere esplorata. Anche l'applicazione della nostra tecnologia organoide dei vasi sanguigni nella vascolarizzazione di costrutti organoidi precedentemente avascolari23 è di impatto e interesse significativi.

La disfunzione vascolare e le malattie dei vasi sanguigni presentano marcate complicanze nelle funzioni degli organi. Le malattie cardiovascolari (CVD) sono la principale causa di morte in tutto il mondo1 ed è anche il principale fattore che contribuisce all'aumento dei costi sanitari negli Stati Uniti. Il numero di casi di CVD aumenta ogni anno e un numero crescente di questi casi si verifica nei gruppi di età più giovani (20-45 anni)2. Sono stati sviluppati diversi modelli in vivo per esplorare lo sviluppo e la maturazione dei vasi sanguigni, la malattia vascolare e la disfunzione endoteliale 3,4. Attualmente, i metodi che combinano cellule singole e multiple definite dal lignaggio derivate da cellule staminali o isolate da tessuti adulti in vivo possono creare reti vascolari che replicano aspetti della funzione vascolare umana e dell'anatomia 5,6. I vasi sanguigni sono emersi come uno dei primi sistemi funzionali durante lo sviluppo dal mesoderma e si organizzano attraverso un processo di assemblaggio chiamato "vasculogenesi" o per espansione e ramificazione da vasi preesistenti, che è chiamato "angiogenesi"7.
Sfruttando il potere della biologia dello sviluppo e dell'assemblaggio auto-diretto, Wimmer et al. hanno riportato i primi organoidi 3D di vasi sanguigni umani auto-organizzanti da hPSC che mostrano le caratteristiche funzionali, morfologiche e molecolari della microvascolarizzazione umana8. Simili alla vascolarizzazione umana9, queste hBVO sono generate e presenti con un endotelio, una membrana basale continua e cellule murali circostanti 8,10. Le hBVO possono essere trapiantate in vivo e anastomoizzate con la circolazione endogena. Possono anche subire una maturazione in vitro e servire come modelli per le malattie cardiovascolari (cioè il diabete)8 o il trofismo tissutale nelle infezioni virali come SARS-CoV-211. Mentre in precedenza abbiamo pubblicato un protocollo scritto10, non esiste un protocollo video disponibile per questa tecnica altrimenti complessa.
Attraverso una concisa progressione graduale, la formazione di hBVO si realizza attraverso la formazione di aggregati, l'induzione del mesoderma utilizzando un agonista WNT, Chirone (CHIR99021) e la proteina morfogenetica ossea - 4 (BMP4)12,13, l'induzione vascolare tramite il fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGFA) e Forskolin (Fors)12 e l'incorporazione in una matrice di germinazione personalizzata 8,10. La maturazione vascolare e la formazione della rete seguono l'incorporazione degli aggregati nella matrice di germinazione. Queste reti di vasi umani si formano entro 2-3 settimane e possono essere rimosse dalla matrice di germinazione e ulteriormente coltivate in sistemi di coltura scalabili per un massimo di 6 mesi. Qui vengono fornite procedure otticamente guidate per la formazione e l'applicazione di vascolarizzazione derivata da cellule staminali umane.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% sodium bicarbonate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell dissociation reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1391, 0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-rabbit IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-546-152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-sheep IgG</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647&#8211;anti-goat IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-606-147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Faster</td>
			<td></td>
			<td>SafeFAST Premium 212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-111-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF806</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td>Multifuge 4 KR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td></td>
			<td>Galaxy 170S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Basement membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (22 x 50 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3&#8211;anti-mouse IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-166-150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modefied Eagle&#39;s Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648-10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovien Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-093-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Heraguard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted contrasting tissue culture microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Vert.A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer&#160;</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>IS009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-essential amino acids (NEAAs)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (4%) in PBS</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BM-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3169S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips (6.5-10)</td>
			<td>Mquant, Millipore</td>
			<td>109543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (P1000, P200 and P20)</td>
			<td>Gilson, Integra Pipetboy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime Surface-U 96-well plates&#160;</td>
			<td>Sumilon</td>
			<td>MS9096-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PurCol&#160;</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS gel</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS mounting solution</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5, 10 and 25 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357529, 357530, 357515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>vSMC/Pericyte</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2547</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel micro spatula (rounded end)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel spoon (double-ended)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BelArt H367290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemflex medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>stem cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10639011</td>
			<td>flexible serum-free medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 &#956;L)</td>
			<td>Biozym, Surphob</td>
			<td>VT0270, VT0250, VT0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 12-well plates TC&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 6-well plates&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30720113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>mammalian cell dissociating enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low-attachment 6-well plates</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Isotemp 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>688000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells

Un organoide è definito come un tessuto multicellulare in vitro ingegnerizzato che imita il suo corrispondente organo in vivo in modo tale che possa essere utilizzato per studiare aspetti definiti di quell'organo in un piatto di coltura tissutale. L'ampiezza e l'applicazione della ricerca sugli organoidi derivati dalle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono avanzate in modo significativo per includere il cervello, la retina, il dotto lacrimale, il cuore, il polmone, l'intestino, il pancreas, i reni e i vasi sanguigni, tra molti altri tessuti. Lo sviluppo di metodi per la generazione di microvasi umani, in particolare, ha aperto la strada alla modellazione dello sviluppo e della malattia dei vasi sanguigni umani in vitro e per la sperimentazione e l'analisi di nuovi farmaci o trofismo tissutale nelle infezioni virali, incluso SARS-CoV-2. Protocolli complessi e lunghi privi di guida visiva ostacolano la riproducibilità di molti organoidi derivati da cellule staminali. Inoltre, la stocasticità intrinseca dei processi di formazione degli organoidi e l'auto-organizzazione richiede la generazione di protocolli ottici per far progredire la comprensione dell'acquisizione e della programmazione del destino cellulare. Qui, viene presentato un protocollo visivamente guidato per la generazione di organoidi 3D dei vasi sanguigni umani (BVO) progettati da hPSC. Presentando una membrana basale continua, cellule endoteliali vascolari e articolazione organizzata con cellule murali, i BVO mostrano le caratteristiche funzionali, morfologiche e molecolari della microvascolarizzazione umana. La formazione di BVO viene avviata attraverso la formazione di aggregati, seguita da mesoderma e induzione vascolare. La maturazione vascolare e la formazione della rete sono iniziate e supportate incorporando aggregati in una matrice di membrana basale 3D e collagene solubilizzata. Le reti di vasi umani si formano entro 2-3 settimane e possono essere ulteriormente coltivate in sistemi di coltura scalabili. È importante sottolineare che i BVO trapiantati in topi immunocompromessi si anastomizzano con la circolazione endogena del topo e si specificano in arterie, vene e arteriole funzionali. L'attuale protocollo a guida visiva farà progredire la ricerca sugli organoidi umani, in particolare in relazione ai vasi sanguigni nel normale sviluppo, alla vascolarizzazione dei tessuti e alle malattie.

Le fasi descritte in questo protocollo sono state sviluppate specificamente per produrre un metodo controllato e preciso per la generazione di organoidi dei vasi sanguigni umani da hPSC. La generazione di aggregati di 30-100 μm di diametro da colture hPSC segna il punto di partenza del protocollo (Figura 1, Figura 2B). Gli aggregati sono guidati attraverso induzioni graduali verso il mesoderma (giorno 1-giorno 4) e le linee vascolari (giorno 4-giorno 6) prima dell'incorporazione (giorno 6) (Figura 2A-D), che è necessaria per la formazione della rete vascolare. La germinazione dei vasi quasi radialmente simmetrica deve essere visibile da d7 o d8 (figura 2E) e continuare attraverso d10 (figura 2F,G). L'espianto degli hBVO dall'ECM alle piastre di attacco ultra-basse a 96 pozzetti riduce la fragilità delle reti di germinazione e consente una manutenzione continua in condizioni di coltura in sospensione (Figura 2H) fino a 6 mesi. Con d15, le hBVO mostrano una rete endoteliale estesa e connessa (CD31+) circondata da periciti (PDGFR-ß+) e actina della muscolatura liscia (SMA+) (Figura 3A-D). Una membrana basale continua di collagene IV (ColIV+) avvolge le reti vascolari (Figura 3E). Le cellule endoteliali (CD31+, VE-Cadherin+) e i periciti (PDGFR-ß+) comprendono rispettivamente circa il 30%-35% e il 60%-65% delle popolazioni di cellule organoidi. La germinazione attiva dei vasi avviene sotto la direzione di una popolazione di cellule della punta organizzata endogenamente (CD31+) che si presenta con la tipica morfologia delle cellule della punta, come l'eccessiva filipodia 8,10. La presentazione delle cellule murali PDGFR-ß+ e SMA+ che incapsulano le reti dei vasi endoteliali può essere vista da d15 del processo di maturazione organoide (Figura 3A,C). Dopo la rimozione dalla ECM e la maturazione in coltura in sospensione (cioè d15), le hBVO sono utilizzabili per le rispettive analisi o trapianto sotto la capsula renale del topo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig01.jpg"> Figura 1: Schema del protocollo hBVO evidenziando la tempistica e la progressione graduale. Da colture hPSC o hiPSC apparentemente omogenee, la formazione di aggregati avviene in presenza dell'inibitore della Rho-chinasi Y27632. BMP4 e CHiR-integrato mezzo è usato per istruire gli aggregati verso il destino mesodermico. Il mezzo di induzione del mesoderma viene sostituito da VEGFA e mezzo integrato con forskolina per stimolare gli aggregati verso una linea vascolare. Le code meccaniche e chimiche ottenute attraverso l'incorporazione degli aggregati in una matrice di membrana basale solubilizzata e il collagene I e l'esposizione al mezzo contenente VEGFA e FGF2 si traduce in una germinazione vascolare quasi radialmente simmetrica dal corpo aggregato. Le reti di vasi generate possono essere rimosse dal collagene I e dalla membrana basale solubilizzata e collocate in coltura in sospensione per un'ulteriore maturazione, analisi o trapianto in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig02.jpg"> Figura 2: Progressione graduale della generazione di hBVO catturata in campo chiaro. (A) Morfologia tipica delle colonie di hPSC (H9) al giorno −1. (B) Generazione di aggregati hPSC (giorno 0) su piastre di attacco ultra-basse a 6 pozzetti in presenza di Y-27632. (C) L'induzione mesodermica di aggregati utilizzando BMP4 e terreno integrato con ChiR (giorno 1). Si possono anche osservare sottili cambiamenti nella dimensione e nella forma dell'aggregato. (D) Aggregati del giorno 4 innescati verso una linea vascolare utilizzando VEGFA e terreno integrato con forskolina. (E) germinazione precoce dei vasi il giorno 7, un giorno dopo l'incorporazione degli aggregati nella matrice di germinazione e l'esposizione al terreno di germinazione integrato con VEGFA e FGF2 (giorno 7). (F) Morfologia organoide sana e germogliamento continuo dei vasi il giorno 9. (G) Nave in fase avanzata che germoglia al giorno 10. Idealmente, le strutture cellulari dense al centro organoide sono scomparse a questo punto. (H) Morfologia tipica degli organoidi maturi (giorno 15) dei vasi sanguigni umani. La rimozione della matrice circostante mediante taglio e maturazione in piastre di coltura a 96 pozzetti a bassissimo attacco modella gli organoidi sfericamente, con le reti di vasi alloggiate internamente. Barre scala: (A,B,E,F) 250 μm; (C,D) 500 μm; (G,H) 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig03.jpg"> Figura 3: Colorazione a montaggio intero di organoidi di vasi sanguigni umani maturi (giorno 15). (A) Presentazione di organoidi di vasi sanguigni umani maturi (giorno 15) con reti endoteliali auto-organizzate (CD31+, magenta) e periciti circostanti (PDGFR-β+, ciano) e actina del muscolo liscio alfa (SMA+, giallo). (B) Maggiore ingrandimento di A che dettaglia l'espressione SMA+ (gialla) e PDGFR-β+ (ciano) delle reti di vasi. (C) Presentazione dettagliata dell'interazione endoteliale (CD31+, magenta), pericitario (PDGFR-β+, ciano) e actina della muscolatura liscia alfa (SMA+, giallo). (D) Colorazione a montaggio intero dell'interazione vaso endoteliale (CD31+, magenta)-muscolo liscio (SMA+, giallo) in una sezione trasversale (a sinistra) e un maggiore ingrandimento (a destra) degli organoidi dei vasi sanguigni maturi. (E) Formazione autodiretta di una membrana basale vascolare (Col IV+, scala di grigi) attraverso la stretta associazione delle cellule murali e dei tubi endoteliali. Barre di scala: (A,D[sinistra]) 100 μm; (B,D[destra],E) 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

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Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Questo protocollo descrive la generazione di vasi sanguigni auto-organizzanti da cellule staminali pluripotenti e pluripotenti indotte umane. Queste reti di vasi sanguigni mostrano una rete endoteliale estesa e connessa circondata da periciti, actina muscolare liscia e una membrana basale continua.

Generazione di organoidi dei vasi sanguigni umani da cellule staminali pluripotenti

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Questo protocollo delinea la nostra generazione di organoidi dei vasi sanguigni umani da cellule staminali pluripotenti. Questa tecnologia può essere utilizzata per studiare aspetti della vasculogenesi, dell'angiogenesi, delle malattie vascolari e delle patologie vascolari. La riproducibilità e la natura ad alto rendimento, così come la sua coerenza in molte diverse linee di cellule staminali, sono forti vantaggi di questa tecnica.In termini di applicazione, alcune delle nostre precedenti ricerche delineano l'uso di organoidi dei vasi sanguigni per studiare i cambiamenti morfologici per la vascolarizzazione del paziente diabetico ed esplora le vie di trattamento farmacologico per la vasculopatia diabetica. Mantenere correttamente la popolazione iniziale di cellule staminali, prevenire l'aggregazione degli aggregati e garantire un diametro aggregato quasi omogeneo, questi sono fattori essenziali per generare buoni organoidi dei vasi sanguigni. Iniziare la generazione di aggregati utilizzando cellule staminali pluripotenti umane in coltura, o hPSC, con una confluenza del 70%.Utilizzando una pipetta o un sistema a vuoto, aspirare il terreno di coltura e sostituirlo con un millilitro di reagente di dissociazione cellulare prima di incubare le cellule per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Nel frattempo, preparare il volume necessario di mezzo di aggregazione in un tubo conico da 15 millilitri, seguendo la formulazione menzionata nel manoscritto testuale. Dopo aver incubato le cellule, aspirare il reagente di dissociazione cellulare prima di sospendere le cellule in un millilitro di mezzo di aggregazione.Pipettare delicatamente il contenuto su e giù per creare una sospensione a cella singola. Contare le cellule utilizzando un dispositivo automatico di conteggio delle cellule o al microscopio e calcolare il numero totale di cellule necessarie per la formazione degli aggregati. La lettura della vitalità cellulare mostra la sospensione a singola cellula con cluster bassi o nulli.Aspirare il surnatante dal tubo e aggiungere il volume appropriato della sospensione cellulare al mezzo di aggregazione nel tubo conico in polipropilene ad alta trasparenza da 15 millilitri e pipettare delicatamente la sospensione cellulare diluita su e giù per garantire una distribuzione cellulare omogenea. Pipettare tre millilitri della sospensione cellulare diluita in ciascun pozzetto desiderato della piastra di coltura a sei pozzetti a bassissimo attacco. Posizionare la piastra nell'incubatore e ridurre al minimo qualsiasi disturbo per mantenere le dimensioni e la forma degli aggregati.Preparare il mezzo del mesoderma come descritto nel manoscritto testuale. 24 ore dopo la semina delle cellule, estrarre la piastra di coltura dall'incubatore. Ruotare la piastra con un movimento circolare per accumulare gli aggregati al centro di ciascun pozzetto.Utilizzando una pipetta da un millilitro, trasferire delicatamente gli aggregati con il mezzo da ciascun pozzetto nel tubo conico corrispondente. Lasciare sedimentare gli aggregati nei tubi conici a temperatura ambiente per un'ora. Una volta sedimentato, aspirare il surnatante con una pipetta o una pompa di aspirazione ad alta sensibilità con cautela, senza disturbare gli aggregati sedimentati.Risospendere gli aggregati in ogni tubo aggiungendo due millilitri di mezzo di induzione del mesoderma. Quindi, trasferire la sospensione da ciascun tubo nel rispettivo pozzetto della piastra di coltura a sei pozzetti di attacco ultra-bassa. Posizionare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e lasciarla fino al quarto giorno.Il quarto giorno, estrarre la piastra di coltura dall'incubatore, quindi scuotere la piastra con un movimento circolare per raccogliere gli aggregati al centro di ciascun pozzetto. Utilizzando una pipetta da un millilitro, trasferire delicatamente gli aggregati con il mezzo circostante da ciascun pozzetto nel tubo conico corrispondente. Impostare un timer per 30 minuti per consentire agli aggregati di sedimentare nei tubi.Una volta che gli aggregati sedimentano, preparare le piastre di coltura come precedentemente dimostrato e posizionarle nell'incubatore a 37 gradi Celsius fino al sesto giorno. Per l'incorporazione di aggregati e l'induzione di germogli di vaso, preparare il volume finale desiderato della soluzione di matrice extracellulare mentre si lavora sul ghiaccio. Pipettare 500 microlitri di ECM in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti per formare il primo strato del sandwich ECM.Per garantire un'efficace polimerizzazione del primo strato ECM, posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per due ore. Verso la fine dell'incubazione di due ore, inizia a lavorare con gli aggregati nella piastra di coltura. Raccogliere gli aggregati al centro di ciascun pozzetto prima di utilizzare una pipetta da un millilitro per trasferire delicatamente gli aggregati e il mezzo da ciascun pozzetto in un corrispondente tubo conico da 15 millilitri.Lasciare decantare gli aggregati per 10-15 minuti prima di aspirare il surnatante. Dopodiché, tenere i tubi conici contenenti gli aggregati su ghiaccio per cinque minuti. Lavorando rapidamente e con attenzione, risospendere gli aggregati in 500 microlitri di ECM senza formazione di bolle.Utilizzando una pipetta, sovrapporre la sospensione di aggregati ECM sopra il primo strato ECM già polimerizzato all'interno del pozzetto nella piastra a 12 pozzetti. Nel frattempo, prepara il mezzo di germinazione come descritto nel manoscritto testuale. Dopo due ore di incubazione a 37 gradi Celsius, aggiungere un millilitro di mezzo di germinazione preriscaldato a 37 gradi Celsius nel pozzo per indurre la differenziazione dei vasi sanguigni.Lavorando in condizioni sterili, utilizzare l'estremità arrotondata di una spatola sterile per allentare la matrice di germinazione ECM contenente le reti vascolari. Quindi, usando una pinza sterile e l'estremità arrotondata di una spatola sterile, trasferire con attenzione il disco di gel allentato sul coperchio di un piatto di coltura di 10 centimetri. Posizionare il gel sul coperchio sotto uno stereomicroscopio regolato per l'ingrandimento e la messa a fuoco desiderati e utilizzare aghi sterili per tagliare le reti di singoli vasi sanguigni, cercando di limitare la quantità di ECM non vascolarizzata ottenuta nel processo.Trasferire delicatamente gli organoidi isolati in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti di attacco ultra-bassa contenente tre millilitri di terreno di germinazione. Successivamente, utilizzando una pipetta da un millilitro, trasferire i singoli organoidi al numero appropriato di pozzetti in una piastra a 96 pozzetti ultra-bassa. Una volta trasferito, aggiungere 200 microlitri di mezzo di germinazione preriscaldato in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti.Da quattro a sei giorni dopo l'isolamento nella piastra da 96 pozzetti, assicurarsi che gli organoidi possiedano una morfologia rotonda e sana prima di procedere a fissarli e colorarli. Le immagini della progressione graduale della generazione di organoidi dei vasi sanguigni umani, o hBVO, da hPSC sono state catturate in campo luminoso. Il giorno zero, dalla coltura hPSC sono stati generati aggregati che vanno da 30 a 100 micron di diametro.Sottili cambiamenti nelle dimensioni e nella forma degli aggregati sono stati osservati all'induzione del mesoderma il primo giorno, che è ulteriormente cambiato il quarto giorno quando gli aggregati sono stati sottoposti a priming vascolare. La germinazione precoce dei vasi quasi radialmente simmetrica può essere osservata il settimo giorno, un giorno dopo aver incorporato gli aggregati nella matrice di germinazione. La morfologia organoide sana e la continua germinazione dei vasi sono state osservate il nono giorno, che è progredito fino alla fase avanzata dei vasi che germogliano entro il giorno 10 quando le dense strutture cellulari al centro organoide sono quasi scomparse.La morfologia tipica degli organoidi dei vasi sanguigni umani maturi è stata chiaramente osservata entro il giorno 15. La colorazione a montaggio intero degli hBVO maturi al giorno 15 ha mostrato una rete endoteliale estesa e connessa che era CD31-positiva e circondata da parassiti PDGFR-beta-positivi e actina della muscolatura alfa-liscia SMA-positiva. Le cellule murali PDGFR-beta-positive e SMA-positive che incapsulano le reti dei vasi endoteliali sono ben osservate.È stata anche osservata una membrana basale continua di collagene IV-positivo che avvolge le reti vascolari. Garantire una corretta polimerizzazione della matrice extracellulare durante la fase di incorporazione è fondamentale per un'efficace germinazione dei vasi sanguigni. I ricercatori hanno utilizzato la nostra tecnologia degli organoidi dei vasi sanguigni per generare compartimenti vascolari precoci in modelli organoidi già stabiliti, come cervello e reni, che in precedenza erano aspercolari.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Sviluppo, di espansione, e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule NK umane da cellule staminali embrionali umane (hESC) ed e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Ricerca

Bioingegneria

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Trapianto di progenitori miogenici pluripotenti derivati da cellule staminali indotte simili a mesoangioblasti nei modelli di topo di rigenerazione muscolare

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Efficiente generazione e la modifica di IPSCs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolamento di fibroblasti dermici umani adulti dalla pelle addominale e generazione di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un metodo non integrato

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Generazione scalabile di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti umane e caratterizzazione da immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Differenziazione guidata di podociti renali maturi da cellule staminali pluripotenti indotte umane in condizioni chimicamente definite

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Tessuto connettivo ingegnerizzato umano derivato da fibroblasti per applicazioni di screening

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...