Name: generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells
Uploaded: 2023-01-20T13:35:00
Duration: 9 min 46 s
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重要な意見と議論をしてくれた研究室のすべてのメンバーに感謝します。JMPは、T. von Zastrow財団、FWFウィトゲンシュタイン賞(Z 271-B19)、オーストリア科学アカデミー、助成金契約No 101005026に基づく革新的医薬品イニシアチブ2共同事業(JU)、心臓血管研究におけるルダック大西洋横断ネットワーク、アレン研究所特別研究者プログラム、カナダ150研究椅子プログラムF18-01336、カナダ健康研究所COVID-19助成金F20-02343およびF20-02015から資金提供を受けました。

<ol>
	<li>Okwuosa, I. S., Lewsey, S. C., Adesiyun, T., Blumenthal, R. S., Yancy, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+disparities+in+cardiovascular+disease:+Challenges+and+solutions.">Worldwide disparities in cardiovascular disease: Challenges and solutions.</a> International Journal of Cardiology. 202, 433-440 (2016).</li><li>Page, R. 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著者の経済的利益と発表されている研究との間に関係はありません。血管オルガノイド技術は、ステムセルテクノロジーズにライセンス供与されています。J.M.P.は、血管移植療法として血管オルガノイドを開発するアンギオスバイオテックの創設者兼株主です。この作業に関連する特許出願は、特許No.US20200199541A1、ライナーA.ウィマー、ジョセフM.ペニンガー、ドンチョケルジャシュキを発明者としてリストしています。

幹細胞由来のオルガノイド培養における最近のブレークスルーは、ヒト血管系のより高度で生理学的に関連するモデルのフレームワークを提供しました。ここで紹介したヒト血管オルガノイド(hBVO)モデルは、私たちの研究室で開発されました8,10は、ヒト血管形成のさらなる側面だけでなく、疾患モデリングと再生治療の新しい道を探求する強力な手段を提供します8,10,11。血管の発達と成熟、血管疾患、および内皮機能障害を調べるために、複数のin vivoモデルが採用されています3,4。さまざまなアプローチにより、幹細胞に由来する、またはin vivoで成人組織から分離された単一および複数の系統で定義された細胞を組み合わせて、複製可能なヒト血管ネットワークを作成します5,6。ここで紹介するプロトコルは、発生生物学と自己組織化の原理を活用して、本質的に単一のhPSC 8,10から生成できる史上初の多細胞系統のヒト血管ネットワークを生み出します。
各幹細胞株には独自の遺伝子構成があり、その調達、機能、および応答性の点で他の株とは異なります15。したがって、ヒト血管オルガノイド(hBVO)のプロトコルは、複数の(>12)異なるhPSC株との堅牢で再現性のあるプロトコル互換性を確保するために開発および最適化されました8、10。ここで説明する方法は、2週間にわたってhPSC由来の血管オルガノイドを生成します。しかしながら、hBVO生成における培地組成および/または技術の変更は、無効な血管ネットワークおよびオルガノイド生成をもたらし得る。個々の幹細胞株の増殖速度の違いは、幹細胞実験15、ひいてはオルガノイド培養の再現性にも著しく影響します。例えば、BVOを生成する際に、より多くの増殖性細胞またはより多くの大きな1日目凝集体は、本質的に異なる代謝環境ならびにガスおよび栄養素拡散パラメータを受ける。これにより、成長因子の曝露時間と効率、分化の程度と血管プライミング、そして最も重要なこととして、コラーゲン1と可溶化された基底膜マトリックスに凝集体を埋め込む際に血管ネットワークを形成する能力が変化します。
酸素の受動拡散と外部環境からの必須栄養素の投与は、in vitroでの3Dオルガノイドの長期細胞増殖および組織形態形成には理想的ではありません16。いくつかの要因(すなわち、組織代謝率、栄養素およびガスのバイオアベイラビリティ、静的または動的環境)に依存するが、生理学的に、ヒト組織は灌流された血管から150μm以内に生細胞の臍帯が存在することを考慮すると、一般に150μmO2および栄養素拡散限界がインビトロで培養された組織に対して確立されている17。70〜200μmの有効ガスおよび栄養素拡散距離も提案されているが18、19、20、21、構築物密度、温度、pH、および培地組成は拡散効率に大きく影響する。表面積の最適化と6日目の埋め込み後のインテグリン-β受容体通信により、直径250〜300μmの凝集体は、直径>500〜600μmの凝集体よりも優れた性能を発揮し、完全な血管発芽プロセスと最小凝縮のオルガノイドコアをもたらします。したがって、凝集体のサイズは重要であり、最初の播種中に使用される細胞の数と凝集体の形成に割り当てられた時間の両方によって影響を受ける可能性があります。凝集体のサイズと数22の制御を可能にするマイクロウェルプレートは、このプロトコルで超低アタッチメント6ウェルプレートを使用することから生じる確率的な凝集体形成技術の実行可能な代替手段です。hBVOプロトコルの最初の6日間のタイミングと凝集サイズの管理の一貫性は、真正な血管オルガノイドの開発を成功させるための最も重要な指標の1つです。
1日目(中胚葉誘導)および4日目(血管誘導)の培地変化は、凝集体の沈降と組み合わせて完了しなければならない。遠心分離は魅力的な代替手段ですが、弱く組み立てられた凝集物に加えられる追加の力は、望ましくない凝集、組み立て、およびせん断を引き起こす可能性があり、プロトコルの後期段階での分化、成熟、および発芽の有効性に悪影響を及ぼします。6日目の埋め込みプロセス中に氷上で作業することは、適切なECM重合と層形成を維持するために重要です。凝集体の埋め込みおよび発芽誘導中に、ECMを4°Cを超える温度および/または7.4以外のECM pHにさらすと、重合速度およびECM層の完全性だけでなく、埋め込まれた凝集体の発芽効率にも影響します。ECM発芽マトリックスの弾性特性により、12ウェル培養皿から滅菌切断面への取り外しと輸送が容易になります。マトリックスから除去され、超低接着96ウェルプレートに移された個々のオルガノイドは、残りの周囲のECMを消費し、連続した基底膜を有する自己組織化された壁状細胞被覆内皮微小血管ネットワークを保持します。
この提案ではカバーされていませんが、培地組成の変更は、hBVOの病理学的応答を引き起こす疾患を再現する可能性があります8,11。hBVOシステムを用いた疾患モデリングの境界はよく知られておらず、これは確かに調査が必要な領域です。以前に無血管オルガノイド構築物23の血管新生における我々の血管オルガノイド技術の適用もまた、大きな影響と関心を有する。

血管機能障害および血管疾患は、臓器機能に著しい合併症を呈します。心血管疾患(CVD)は、世界の主要な死因であり1、米国の医療費の増加の主な要因でもあります。CVDの症例数は年々増加しており、これらの症例の数は若い年齢層(20〜45歳)で発生しています2。血管の発生と成熟、血管疾患、および内皮機能障害を調べるために、複数のin vivoモデルが開発されています3,4。現在、幹細胞に由来する、またはin vivoで成人組織から単離された単一および複数の系統で定義された細胞を組み合わせる方法は、ヒトの血管機能と解剖学的構造の側面を再現する血管ネットワークを作成することができます5,6。血管は、中胚葉からの発生中に最初の機能システムの1つとして出現し、「血管形成」と呼ばれる組み立てのプロセス、または「血管新生」と呼ばれる既存の血管からの拡張と分岐のいずれかによって組織化されます7。
発生生物学と自主的な組み立ての力を活用して、Wimmerらは、ヒト微小血管系の機能的、形態学的、および分子的特徴を示すhPSCからの最初の自己組織化3Dヒト血管オルガノイドを報告しました8。ヒト血管系9と同様に、これらのhBVOは、内皮、連続基底膜、および周囲の壁細胞とともに生成され、存在する8、10。hBVOはin vivoで移植し、内因性循環で吻合することができます。また、in vitroで成熟し、心血管疾患(糖尿病など)8やSARS-CoV-2などのウイルス感染における組織向性のモデルとしても機能します11。以前にプロトコル10を公開しましたが、この複雑な手法に使用できるビデオプロトコルはありません。
簡潔な段階的進行により、hBVO形成は、凝集体形成、WNTアゴニストであるカイロン(CHIR99021)および骨形態形成タンパク質-4(BMP4)12,13を使用した中胚葉誘導、血管内皮増殖因子A(VEGFA)およびフォルスコリン(Fors)12を介した血管誘導、およびカスタム発芽マトリックスへの埋め込みによって達成されます8,10.血管の成熟およびネットワーク形成は、発芽マトリックスへの凝集体の埋め込みに従う。これらのヒト血管ネットワークは2〜3週間以内に形成され、発芽マトリックスから除去され、スケーラブルな培養システムで最大6か月間さらに成長させることができます。ここでは、ヒト幹細胞由来血管系の形成および適用のための光学ガイド下手順が提供される。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% sodium bicarbonate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell dissociation reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1391, 0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-rabbit IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-546-152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-sheep IgG</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647&#8211;anti-goat IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-606-147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Faster</td>
			<td></td>
			<td>SafeFAST Premium 212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-111-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF806</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td>Multifuge 4 KR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td></td>
			<td>Galaxy 170S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Basement membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (22 x 50 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3&#8211;anti-mouse IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-166-150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modefied Eagle&#39;s Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648-10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovien Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-093-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Heraguard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted contrasting tissue culture microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Vert.A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer&#160;</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>IS009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-essential amino acids (NEAAs)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (4%) in PBS</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BM-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3169S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips (6.5-10)</td>
			<td>Mquant, Millipore</td>
			<td>109543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (P1000, P200 and P20)</td>
			<td>Gilson, Integra Pipetboy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime Surface-U 96-well plates&#160;</td>
			<td>Sumilon</td>
			<td>MS9096-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PurCol&#160;</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS gel</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS mounting solution</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5, 10 and 25 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357529, 357530, 357515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>vSMC/Pericyte</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2547</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel micro spatula (rounded end)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel spoon (double-ended)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BelArt H367290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemflex medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>stem cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10639011</td>
			<td>flexible serum-free medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 &#956;L)</td>
			<td>Biozym, Surphob</td>
			<td>VT0270, VT0250, VT0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 12-well plates TC&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 6-well plates&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30720113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>mammalian cell dissociating enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low-attachment 6-well plates</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Isotemp 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>688000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells

オルガノイドは、対応するin vivo器官を模倣した操作された多細胞in vitro組織として定義され、組織培養皿でその器官の定義された側面を研究するために使用できます。ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来のオルガノイド研究の幅と応用は、脳、網膜、涙管、心臓、肺、腸、膵臓、腎臓、血管など、いくつかの組織を含むように大幅に進歩しています。ヒト微小血管の生成方法の開発、特に、ヒト血管の発生と疾患のin vitroでのモデリング、およびSARS-CoV-2を含むウイルス感染における新薬または組織向性の試験と分析への道が開かれました。視覚的なガイダンスがない複雑で長いプロトコルは、多くの幹細胞由来オルガノイドの再現性を妨げます。さらに、オルガノイド形成プロセスと自己組織化の固有の確率性は、細胞運命の獲得とプログラミングの理解を進めるための光学プロトコルの生成を必要とします。ここでは、hPSCから操作された3Dヒト血管オルガノイド(BVO)を生成するための視覚誘導プロトコルが提示されています。連続した基底膜、血管内皮細胞、および壁細胞との組織化された関節を示すBVOは、ヒト微小血管系の機能的、形態学的、および分子的特徴を示します。BVO形成は、凝集体形成によって開始され、続いて中胚葉および血管誘導が続く。血管の成熟とネットワーク形成は、3Dコラーゲンと可溶化された基底膜マトリックスに凝集体を埋め込むことによって開始され、サポートされます。ヒト血管ネットワークは2〜3週間以内に形成され、スケーラブルな培養システムでさらに成長させることができます。重要なことに、免疫不全マウスに移植されたBVOは、内因性マウス循環で吻合し、機能的な動脈、静脈、および細動脈に特異的です。現在の視覚誘導プロトコルは、特に正常な発達、組織血管新生、および疾患における血管に関連して、ヒトオルガノイド研究を前進させます。

このプロトコルに記載されているステップは、hPSCからヒト血管オルガノイドを生成するための制御された正確な方法を得るために特別に開発されました。hPSC培養物からの直径30〜100μmの凝集体の生成は、プロトコルの開始点を示しています(図1、図2B)。凝集体は、血管網形成に必要な包埋(6日目)の前に、中胚葉(1日目〜4日目)および血管系統(4日目〜6日目)に向かって段階的な誘導を介して導かれます(図2A-D)。ほぼ放射状に対称な血管の発芽は、d7またはd8(図2E)で見え、d10(図2F、G)まで続く必要があります。ECMから96ウェルの超低アタッチメントプレートにhBVOを移植することで、発芽ネットワークの脆弱性が軽減され、浮遊培養(図2H)条件で最大6か月間継続して維持できます。d15までに、hBVOは周皮細胞(PDGFR-ß+)と平滑筋アクチン(SMA+)に囲まれた広範で接続された内皮(CD31+)ネットワークを示します(図3A-D)。連続コラーゲンIV(ColIV+)基底膜が血管ネットワークを包み込みます(図3E)。内皮細胞(CD31+、VE-Cadherin+)および周皮細胞(PDGFR-ß+)は、オルガノイド細胞集団のそれぞれ約30%-35%および60%-65%を構成する8。血管の活発な発芽は、過剰なフィリポディア8,10などの典型的な先端細胞の形態を示す内因的に組織化された先端細胞(CD31+)集団の指示の下で起こります。内皮血管ネットワークを封入するPDGFR-ß+およびSMA+壁画細胞の提示は、オルガノイド成熟プロセスのd15によって見ることができます(図3A、C)。ECMから除去し、浮遊培養(すなわち、d15)で成熟した後、hBVOは、それぞれの分析またはマウス腎被膜下での移植に維持可能です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig01.jpg"> 図1:タイミングと段階的な進行を強調したhBVOプロトコルの概略図。一見均質なhPSCまたはhiPSC培養物から、Rhoキナーゼ阻害剤Y27632の存在下で凝集体形成が起こります。BMP4およびCHiRを添加した培地は、凝集体を中胚葉運命に向けて誘導するために使用される。中胚葉誘導培地は、VEGFAおよびフォルスコリン添加培地に置き換えられ、血管系譜に向かって凝集体を刺激する。コラーゲンIおよび可溶化基底膜マトリックスへの凝集体の埋め込み、およびVEGFAおよびFGF2含有培地への曝露によって達成される機械的および化学的キューは、凝集体からのほぼ放射状に対称な血管発芽をもたらす。生成された血管ネットワークは、コラーゲンIおよび可溶化された基底膜から除去され、さらなる成熟、分析、またはin vivoでの移植のために浮遊培養に入れることができる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig02.jpg"> 図2:明視野下で捉えられたhBVO生成の段階的な進行。 (A)-1日目におけるhPSC(H9)コロニーの典型的な形態。(B)Y-27632の存在下での6ウェル超低接着プレート上でのhPSC凝集体の生成(0日目)。(C)BMP4およびChiR添加培地を用いた凝集体の中胚葉誘導(1日目)。凝集体の大きさや形状の微妙な変化も観察できます。(D)4日目の凝集体は、VEGFAおよびフォルスコリン添加培地を使用して血管系譜に向けてプライミングされた。(e)早期血管発芽7日目、凝集体を発芽マトリックスに包埋し、VEGFAおよびFGF2を添加した発芽培地に曝露した翌日(7日目)。(F)健康なオルガノイド形態と9日目の継続的な血管発芽。(G)10日目に発芽する後期血管。理想的には、オルガノイド中心の密な細胞構造はこの時までに消えています。(H)成熟(15日目)ヒト血管オルガノイドの典型的な形態。超低付着96ウェル培養プレートでの切断と成熟による周囲のマトリックスの除去は、容器ネットワークが内部に収容された状態で、オルガノイドを球状に成形します。スケールバー: (A、B、E、F) 250 μm;(C,D) 500 μm;(G,H) 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig03.jpg"> 図3:成熟(15日目)ヒト血管オルガノイドの全マウント染色。 (A)自己組織化された内皮(CD31+、マゼンタ)ネットワークおよび周囲の周皮細胞(PDGFR-β+、シアン)およびアルファ平滑筋アクチン(SMA+、黄色)カバレッジを有する成熟(15日目)ヒト血管オルガノイドの提示。(B)血管網のSMA+(黄色)およびPDGFR-β+(シアン)発現を詳述するAのより高い倍率。(C)内皮(CD31+、マゼンタ)、周皮細胞(PDGFR-β+、シアン)、およびα平滑筋アクチン(SMA+、黄色)相互作用の詳細な提示。(D)血管内皮(CD31+、マゼンタ)-平滑筋(SMA+、黄色)の相互作用の断面(左)および成熟血管オルガノイドの高倍率(右)の全面染色。(E)壁細胞と内皮管の密接な関連による血管基底膜(Col IV+、グレースケール)の自己指向性形成。スケールバー: (A,D[左]) 100 μm;(B,D[右],E) 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

このプロトコルは、ヒト多能性および人工多能性幹細胞からの自己組織化血管の生成を記載する。これらの血管ネットワークは、周皮細胞、平滑筋アクチン、および連続した基底膜に囲まれた広範で接続された内皮ネットワークを示します。

多能性幹細胞からのヒト血管オルガノイドの作製

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

このプロトコルは、多能性幹細胞からのヒト血管オルガノイドの生成の概要を示しています。この技術は、血管新生、血管新生、血管疾患、ならびに血管病理学の側面を研究するために使用することができる。再現性とハイスループットの性質、および多くの異なる幹細胞株にわたる一貫性は、この技術の強力な利点です。それらの応用に関して、私たちの以前の研究のいくつかは、糖尿病患者の血管系の形態学的変化を研究するための血管オルガノイドの使用を概説し、糖尿病性血管障害の薬物治療の道を探っています。初期幹細胞集団を適切に維持し、凝集体の凝集を防ぎ、ほぼ均質な凝集体直径を確保することは、良好な血管オルガノイドを生成するために不可欠な要素です。70%のコンフルエント性を有する培養ヒト多能性幹細胞(hPSC)を用いて凝集体の生成を開始します。ピペットまたは真空システムを使用して、培養液を吸引し、1ミリリットルの細胞解離試薬と交換してから、細胞を摂氏37度で5分間インキュベートします。一方、テキスト原稿に記載されている処方に従って、15ミリリットルの円錐管で必要量の凝集培地を準備します。細胞をインキュベートした後、細胞解離試薬を吸引してから、細胞を1ミリリットルの凝集培地に懸濁します。内容物を静かに上下にピペットで移動して、単一細胞懸濁液を作成します。自動細胞計数装置または顕微鏡下で細胞を計数し、凝集体形成に必要な細胞の総数を計算します。細胞生存率の読み出しは、クラスターが少ないかまったくない単一細胞懸濁液を示しています。チューブから上清を吸引し、15ミリリットルの高透明度ポリプロピレンコニカルチューブ内の凝集培地に適切な量の細胞懸濁液を加え、希釈した細胞懸濁液を上下に静かにピペットで移動して、均一な細胞分布を確保します。3ミリリットルの希釈細胞懸濁液を6ウェル超低付着培養プレートの各所望のウェルにピペットで入れる。プレートをインキュベーターに入れ、骨材のサイズと形状を維持するために外乱を最小限に抑えます。テキスト原稿に記載されているように中胚葉培地を準備します。細胞の播種後24時間で、培養プレートをインキュベーターから取り出す。プレートを円を描くように旋回させて、各ウェルの中央に凝集体を蓄積します。1ミリリットルのピペットを使用して、培地を含む凝集体を各ウェルから対応する円錐管に静かに移します。骨材を円錐管内に室温で1時間沈降させます。沈降したら、沈殿した凝集体を乱すことなく、ピペットまたは高感度吸引ポンプで上清を慎重に吸引します。2ミリリットルの中胚葉誘導培地を添加して、各チューブ内の凝集体を再懸濁する。次に、懸濁液を各チューブから超低付着6ウェル培養プレートのそれぞれのウェルに戻します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れ、4日目まで放置します。4日目に、培養プレートをインキュベーターから取り出し、プレートを円を描くように振って、各ウェルの中央にある凝集体を回収します。1ミリリットルのピペットを使用して、凝集体を周囲の培地とともに各ウェルから対応する円錐管に静かに移します。タイマーを30分に設定して、骨材がチューブ内に沈殿できるようにします。凝集体が沈降したら、前述のように培養プレートを準備し、6日目まで摂氏37度のインキュベーターに入れます。凝集体の埋め込みと血管スプラウト誘導のために、氷上で作業しながら、細胞外マトリックス溶液の所望の最終容量を準備します。500マイクロリットルのECMを12ウェルプレートの1つのウェルにピペットで入れ、ECMサンドイッチの第1層を形成する。最初のECM層の効果的な重合を確実にするために、プレートを摂氏37度のインキュベーターに2時間置きます。2時間のインキュベーションの終わりに向かって、培養プレート内の凝集体の操作を開始します。1ミリリットルのピペットを使用して、各ウェルの凝集体と培地を各ウェルの対応する15ミリリットルの円錐管に静かに移す前に、各ウェルの中央に凝集体を集めます。上清を吸引する前に、凝集体を10〜15分間沈降させます。その後、骨材を含む円錐形のチューブを氷の上に5分間保ちます。迅速かつ慎重に作業し、気泡が形成されることなく500マイクロリットルのECMに凝集体を再懸濁します。ピペットを使用して、12ウェルプレートのウェル内のウェル内のすでに重合された最初のECM層の上にECM凝集懸濁液を層状にします。それまでの間、テキスト原稿に記載されているように発芽培地を準備します。摂氏37度で2時間インキュベートした後、摂氏37度に予熱した発芽培地1ミリリットルをウェルに加え、血管分化を誘導します。無菌条件下で作業する場合は、滅菌スパチュラの丸みを帯びた端を使用して、血管網を含むECM発芽マトリックスを緩めます。次に、滅菌鉗子と滅菌ヘラの丸みを帯びた端を使用して、緩めたゲルディスクを10センチメートルの培養皿の蓋に慎重に移します。所望の倍率および焦点に調整された実体顕微鏡下で蓋の上にゲルを置き、そして滅菌針を使用して単一の血管網を切り取り、その過程で得られる血管新生されていないECMの量を制限しようとする。単離したオルガノイドを、3ミリリットルの発芽培地を含む超低アタッチメント6ウェルプレートの1ウェルに静かに戻します。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、単一のオルガノイドを超低アタッチメント96ウェルプレート内の適切な数のウェルに移します。移管したら、200マイクロリットルの予熱した発芽培地を96ウェルプレートの各ウェルに加えます。96ウェルプレートでの単離後4〜6日で、オルガノイドの固定と染色に進む前に、オルガノイドが丸くて健康な形態を持っていることを確認してください。hPSCからのヒト血管オルガノイド(hBVO)生成の段階的な進行の画像を明視野下で撮影した。0日目に、hPSC培養から直径30〜100ミクロンの範囲の凝集体が生成された。凝集体の大きさと形状の微妙な変化は、1日目の中胚葉誘導時に観察され、4日目に凝集体が血管プライミングを受けるにつれてさらに変化しました。ほぼ放射対称の初期の血管発芽は、凝集体を発芽マトリックスに埋め込んだ翌日の7日目に観察できます。9日目に健康なオルガノイド形態と継続的な血管発芽が見られ、オルガノイド中心の密な細胞構造がほとんど消失する10日目までに後期血管発芽に進行した。成熟ヒト血管オルガノイドに典型的な形態は、15日目までに明確に観察された。15日目の成熟hBVOの全マウント染色は、CD31陽性であり、PDGFR-β陽性寄生虫およびSMA陽性α平滑筋アクチンに囲まれた広範囲で接続された内皮ネットワークを示しました。内皮血管網を封入したPDGFRβ陽性およびSMA陽性の壁画細胞はよく観察される。血管網を包む連続的なコラーゲンIV陽性基底膜も観察された。包埋ステップ中に細胞外マトリックスの適切な重合を確実にすることは、効果的な血管発芽にとって重要です。研究者は、当社の血管オルガノイド技術を使用して、以前は貪欲であった脳や腎臓などのすでに確立されたオルガノイドモデルで初期の血管コンパートメントを生成しました。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

開発、展開、および<em生体内で&gt;</em&gt;ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）からヒトNK細胞のモニタリングとや人工多能性幹細胞（性IPSC）

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

ヒト多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドのスケーラブルな生成と免疫染色による特徴付け

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

化学的に定義された条件下でのヒト人工多能性幹細胞からの成熟した腎臓ポドサイトの誘導分化

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

スクリーニング用途のための線維芽細胞由来ヒト工学的結合組織

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...