Name: generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells
Uploaded: 2023-01-20T13:35:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

중요한 의견과 토론을 해주신 모든 실험실 구성원에게 감사드립니다. JMP는 T. von Zastrow 재단, FWF 비트겐슈타인 상(Z 271-B19), 오스트리아 과학 아카데미, 보조금 계약 No 101005026에 따른 Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking (JU), Leducq Transatlantic Networks of Excellence in Cardiovascular Research, Allen Institute Distinguished Investigator Program, Canada 150 Research Chairs Program F18-01336, 캐나다 보건원 COVID-19 보조금 F20-02343 및 F20-02015로부터 자금을 지원받았습니다.

<ol>
	<li>Okwuosa, I. S., Lewsey, S. C., Adesiyun, T., Blumenthal, R. S., Yancy, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+disparities+in+cardiovascular+disease:+Challenges+and+solutions.">Worldwide disparities in cardiovascular disease: Challenges and solutions.</a> International Journal of Cardiology. 202, 433-440 (2016).</li><li>Page, R. 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저자의 재정적 이익과 제시된 연구 사이에는 아무런 관계가 없습니다. 혈관 오가노이드 기술은 Stemcell Technologies에 라이선스가 부여되었습니다. JMP는 혈관 이식 요법으로 혈관 오가노이드를 개발하는 Angios Biotech의 설립자이자 주주입니다. 이 저작물과 관련된 특허 출원은 특허 번호로 제출되었습니다. US20200199541A1, Reiner A. Wimmer, Josef M. Penninger 및 Dontscho Kerjaschki를 발명가로 나열했습니다.

줄기 세포 유래 오가노이드 배양의 최근 돌파구는 인간 혈관 구조의 보다 발전되고 생리학적으로 관련된 모델을 위한 프레임워크를 제공했습니다. 여기에 제시된 인간 혈관 오가노이드(hBVO) 모델은 우리 실험실(8,10)에서 개발되었으며, 인간 혈관 형성의 추가 측면뿐만 아니라 질병 모델링 및 재생 요법(8,10,11)의 새로운 방법을 탐색하는 강력한 수단을 제공합니다. 혈관, 혈관 질환 및 내피 기능 장애의 발달 및 성숙을 탐색하기 위해 여러 생체 내 모델이 사용되었습니다 3,4. 다양한 접근법은 줄기 세포에서 유래하거나 생체 내 성인 조직에서 분리된 단일 및 다중 계통 정의 세포를 결합하여 복제성 인간 혈관 네트워크를 생성합니다 5,6. 여기에 제시된 프로토콜은 발달 생물학 및 자기 조직화의 원리를 활용하여 본질적으로 단일 hPSC 8,10에서 생성될 수 있는 최초의 다세포 계통 인간 혈관 네트워크를 생성합니다.
각 줄기세포주는 고유한 유전적 구성을 가지고 있으며 소싱, 기능 및 반응성 측면에서 다른 세포주와 다릅니다15. 따라서, 인간 혈관 오가노이드(hBVO)에 대한 프로토콜은 다수(>12)의 서로 다른 hPSC 라인(8,10)과의 강력하고 재현 가능한 프로토콜 호환성을 보장하기 위해 개발 및 최적화되었습니다. 여기에 설명된 방법은 2주에 걸쳐 hPSC 유래 혈관 오가노이드를 생성합니다. 그러나, 배지 조성 및/또는 hBVO 생성 기술의 변경은 비효율적인 혈관 네트워크 및 오가노이드 생성으로 이어질 수 있다. 개별 줄기 세포주의 다양한 증식 속도는 줄기 세포 실험15 및 오가노이드 배양의 재현성에도 현저한 영향을 미친다. 예를 들어, BVO를 생성할 때, 더 많은 증식 세포 또는 더 많은 수의 큰 1일차 응집체는 본질적으로 상이한 대사 환경 및 가스 및 영양소 확산 파라미터의 영향을 받습니다. 이것은 차례로 성장 인자 노출 시간 및 효율, 분화 및 혈관 프라이밍 정도, 그리고 가장 중요한 것은 콜라겐 1 및 가용화된 기저막 매트릭스에 응집체를 매립할 때 혈관 네트워크를 형성하는 능력을 변화시킵니다.
외부 환경으로부터 산소의 수동적 확산과 필수 영양소의 투여는 시험관 내에서 3D 오가노이드의 장기 세포 성장과 조직 형태 형성에 이상적이지 않다 16. 비록 몇몇 요인들(즉, 조직 대사율, 영양소 및 기체 생체이용률, 정적 또는 동적 환경)에 의존하지만, 생리학적으로 인간 조직은 관류된 혈관으로부터 150 μm 이내에 살아있는 세포의 탯줄을 존재한다는 것을 고려하여, 시험관 내에서 배양된 조직에 대해 일반적인 150 μmO2 및 영양소 확산 한계가 확립되었다17. 70-200 μm의 유효 기체 및 영양소 확산 거리도 18,19,20,21로 제안되었지만, 작제물 밀도, 온도, pH 및 배지 조성은 확산 효능에 상당한 영향을 미친다. 6일차 포매 후 표면적 최적화 및 인테그린-베타 수용체 통신으로 인해 직경 250-300μm의 응집체가 직경 >500-600μm의 응집체보다 더 나은 성능을 발휘하여 완전한 혈관 발아 과정과 최소 응축 오가노이드 코어를 생성합니다. 따라서 응집체 크기는 매우 중요하며 초기 파종 중에 사용된 세포 수와 응집체 형성에 할당된 시간 모두에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 응집체 크기 및수 22를 제어할 수 있는 마이크로웰 플레이트는 이 프로토콜에서 초저 부착 6웰 플레이트의 사용으로 인한 확률론적 응집체 형성 기술에 대한 실행 가능한 대안입니다. hBVO 프로토콜의 처음 6일 동안 타이밍의 일관성과 응집체 크기 관리는 선의의 혈관 오가노이드를 성공적으로 개발하는 데 가장 중요한 지표 중 하나입니다.
1일차(중배엽 유도) 및 4일차(혈관 유도)의 배지 변화는 응집체의 침강과 함께 완료되어야 합니다. 원심분리가 매력적인 대안이지만, 약하게 조립된 응집체에 가해지는 추가 힘은 원치 않는 응집, 조립 및 전단을 유발할 수 있으며, 이는 프로토콜의 후반 단계에서 분화, 성숙 및 발아 효능에 부정적인 영향을 미칩니다. 6일차 임베딩 공정 동안 얼음 위에서 작업하는 것은 적절한 ECM 중합 및 층 형성을 보존하는 데 중요합니다. 골재 포매 및 발아 유도 중에 ECM을 4°C 이상의 온도 및/또는 7.4 이외의 ECM pH에 노출시키면 중합 속도 및 ECM 층 무결성뿐만 아니라 포매된 골재의 발아 효율에도 영향을 미칩니다. ECM 발아 매트릭스의 탄성 특성으로 인해 12웰 배양 접시에서 멸균 절단 표면으로 쉽게 분리 및 운반할 수 있습니다. 매트릭스에서 제거되고 초저 부착 96웰 플레이트로 옮겨진 개별 오가노이드는 나머지 주변 ECM을 소비하고 연속적인 기저막으로 자체 조직화된 벽화 세포 코팅 내피 미세혈관 네트워크를 유지합니다.
이 제안에서 다루지는 않았지만, 배지 구성의 변경은 hBVO에서 병리학적 반응을 유발하는 질병을 복제할 수 있습니다 8,11. hBVO 시스템을 사용한 질병 모델링의 경계는 잘 알려져 있지 않으며 이것은 확실히 탐구가 필요한 영역입니다. 이전에 무혈성 오가노이드 구조체(23)의 혈관화에 우리의 혈관 오가노이드 기술을 적용하는 것 또한 상당한 영향과 관심을 끌고 있다.

혈관 기능 장애 및 혈관 질환은 장기 기능에 현저한 합병증을 동반합니다. 심혈관 질환(CVD)은 전 세계적으로 주요 사망 원인이며1 미국에서 의료 비용을 증가시키는 주요 원인이기도 합니다. CVD 사례 수는 매년 증가하고 있으며 이러한 사례의 증가는 젊은 연령 그룹(20-45세)에서 발생하고 있습니다2. 혈관, 혈관 질환 및 내피 기능 장애의 발달 및 성숙을 탐색하기 위해 여러 생체 내 모델이 개발되었습니다 3,4. 현재, 줄기 세포에서 유래하거나 생체 내에서 성인 조직에서 분리된 단일 및 다중 계통 정의 세포를 결합하는 방법은 인간 혈관 기능 및 해부학적 측면을 복제하는 혈관 네트워크를 생성할 수 있습니다 5,6. 혈관은 중배엽에서 발달하는 동안 최초의 기능 시스템 중 하나로 등장했으며, "혈관 신생"이라고 불리는 조립 과정을 통해 또는 "혈관 신생"이라고 불리는 기존 혈관의 확장 및 분지에 의해 조직됩니다.7.
Wimmer 등은 발달 생물학과 자기 주도적 조립의 힘을 활용하여 인간 미세혈관 구조의 기능적, 형태학적, 분자적 특성을 나타내는 hPSC의 첫 번째 자기 조직화 3D 인간 혈관 오가노이드를 보고했다8. 인간 혈관구조(human vasculastructure)9와 유사하게, 이들 hBVO는 생성되어 내피(endothelium), 연속적인 기저막(concertment membrane) 및 주변 벽화 세포(mural cell)8,10와 함께 존재한다. hBVO는 생체 내에서 이식될 수 있고 내인성 순환과 문합될 수 있습니다. 또한 시험관 내에서 성숙을 거쳐 심혈관 질환(즉, 당뇨병)8 또는 SARS-CoV-2와 같은 바이러스 감염에서 조직 친화성에 대한 모델 역할을 할 수 있다11. 이전에 서면 프로토콜(10)을 발표했지만, 이 복잡한 기술에 사용할 수 있는 비디오 프로토콜은 존재하지 않습니다.
간결한 단계적 진행을 통해 hBVO 형성은 응집체 형성, WNT 작용제인 Chiron(CHIR99021) 및 골 형태 형성 단백질-4(BMP4)12,13, 혈관 내피 성장 인자 A(VEGFA) 및 포스콜린(Fors)12을 통한 혈관 유도, 맞춤형 발아 매트릭스 8,10에 임베딩을 통해 이루어집니다.. 혈관 성숙 및 네트워크 형성은 발아 매트릭스에 응집체가 매립되는 것을 따릅니다. 이러한 인간 혈관 네트워크는 2-3주 이내에 형성되며 발아 매트릭스에서 제거하고 최대 6개월 동안 확장 가능한 배양 시스템에서 추가로 성장할 수 있습니다. 여기서, 인간 줄기 세포 유래 혈관 구조의 형성 및 적용을 위한 광학 유도 절차가 제공된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% sodium bicarbonate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell dissociation reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1391, 0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-rabbit IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-546-152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-sheep IgG</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647&#8211;anti-goat IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-606-147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Faster</td>
			<td></td>
			<td>SafeFAST Premium 212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-111-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF806</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td>Multifuge 4 KR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td></td>
			<td>Galaxy 170S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Basement membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (22 x 50 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3&#8211;anti-mouse IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-166-150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modefied Eagle&#39;s Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648-10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovien Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-093-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Heraguard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted contrasting tissue culture microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Vert.A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer&#160;</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>IS009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-essential amino acids (NEAAs)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (4%) in PBS</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BM-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3169S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips (6.5-10)</td>
			<td>Mquant, Millipore</td>
			<td>109543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (P1000, P200 and P20)</td>
			<td>Gilson, Integra Pipetboy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime Surface-U 96-well plates&#160;</td>
			<td>Sumilon</td>
			<td>MS9096-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PurCol&#160;</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS gel</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS mounting solution</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5, 10 and 25 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357529, 357530, 357515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>vSMC/Pericyte</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2547</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel micro spatula (rounded end)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel spoon (double-ended)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BelArt H367290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemflex medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>stem cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10639011</td>
			<td>flexible serum-free medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 &#956;L)</td>
			<td>Biozym, Surphob</td>
			<td>VT0270, VT0250, VT0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 12-well plates TC&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 6-well plates&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30720113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>mammalian cell dissociating enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low-attachment 6-well plates</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Isotemp 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>688000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells

오가노이드는 조직 배양 접시에서 해당 장기의 정의된 측면을 연구하는 데 사용할 수 있도록 해당 생체 내 기관을 모방하는 조작된 다세포 시험관 내 조직으로 정의됩니다. 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 유래 오가노이드 연구의 폭과 적용은 뇌, 망막, 누관, 심장, 폐, 장, 췌장, 신장 및 혈관을 비롯한 여러 조직을 포함하도록 크게 발전했습니다. 특히 인간 미세혈관 생성 방법의 개발은 시험관 내에서 인간 혈관 발달 및 질병을 모델링하고 SARS-CoV-2를 포함한 바이러스 감염에서 신약 또는 조직 친화성을 테스트 및 분석하는 길을 열었습니다. 시각적 안내가 부족한 복잡하고 긴 프로토콜은 많은 줄기 세포 유래 오가노이드의 재현성을 방해합니다. 또한, 오가노이드 형성 과정과 자기 조직화의 고유한 확률성은 세포 운명 획득 및 프로그래밍에 대한 이해를 향상시키기 위해 광학 프로토콜의 생성을 필요로 합니다. 여기에서는 hPSC로 엔지니어링된 3D 인간 혈관 오가노이드(BVO) 생성을 위한 시각적 유도 프로토콜이 제시됩니다. 연속적인 기저막, 혈관 내피 세포 및 벽화 세포와의 조직화된 관절을 나타내는 BVO는 인간 미세혈관 구조의 기능적, 형태학적, 분자적 특징을 나타냅니다. BVO 형성은 응집체 형성을 통해 시작되고 중배엽 및 혈관 유도가 뒤 따른다. 혈관 성숙 및 네트워크 형성은 3D 콜라겐 및 가용화된 기저막 매트릭스에 응집체를 내장함으로써 시작되고 지원됩니다. 인간 혈관 네트워크는 2-3주 이내에 형성되며 확장 가능한 배양 시스템에서 추가로 성장할 수 있습니다. 중요한 것은 면역이 저하된 마우스에 이식된 BVO가 내인성 마우스 순환과 문합되어 기능성 동맥, 정맥 및 세동맥으로 지정된다는 것입니다. 현재의 시각 유도 프로토콜은 특히 정상적인 발달의 혈관, 조직 혈관 형성 및 질병과 관련하여 인간 오가노이드 연구를 발전시킬 것입니다.

이 프로토콜에 설명된 단계는 hPSC에서 인간 혈관 오가노이드를 생성하기 위한 제어되고 정확한 방법을 산출하기 위해 특별히 개발되었습니다. hPSC 배양에서 직경 30-100μm의 응집체 생성은 프로토콜의 시작점을 표시합니다(그림 1, 그림 2B). 응집체는 혈관 네트워크 형성에 필요한 임베딩(6일) 전에 중배엽(1일-4일) 및 혈관 계통(4일-6일)으로의 단계적 유도를 통해 유도됩니다(그림 2A-D). 방사상 대칭에 가까운 혈관 발아는 d7 또는 d8(그림 2E)에서 볼 수 있어야 하며 d10(그림 2F,G)까지 계속되어야 합니다. ECM에서 96웰 초저 부착 플레이트로 hBVO를 이식하면 발아 네트워크의 취약성이 줄어들고 최대 6개월 동안 현탁 배양(그림 2H) 조건에서 지속적인 유지 관리가 가능합니다. d15까지 hBVO는 혈관주위세포(PDGFR-ß+) 및 평활근 액틴(SMA+)으로 둘러싸인 광범위하고 연결된 내피(CD31+) 네트워크를 나타냅니다(그림 3A-D). 연속 콜라겐 IV(ColIV+) 기저막이 혈관 네트워크를 둘러싸고 있습니다(그림 3E). 내피 세포(CD31+, VE-Cadherin+)와 혈관주위세포(PDGFR-ß+)는 각각 오가노이드 세포 집단의 약 30%-35% 및 60%-65%를 차지한다8. 혈관의 활성 발아는 과도한 필리포디아 8,10과 같은 전형적인 팁 세포 형태를 나타내는 내인성으로 조직된 팁 세포(CD31+) 집단의 지시에 따라 발생합니다. 내피 혈관 네트워크를 캡슐화하는 PDGFR-ß+ 및 SMA+ 벽화 세포의 발현은 오가노이드 성숙 과정의 d15에서 볼 수 있습니다(그림 3A,C). ECM에서 제거하고 현탁 배양(즉, d15)에서 성숙한 후, hBVO는 마우스 신장 캡슐 아래에서 각각의 분석 또는 이식을 위해 유지될 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig01.jpg"> 그림 1: 타이밍 및 단계적 진행을 강조하는 hBVO 프로토콜의 개략도. 겉보기에 균질한 hPSC 또는 hiPSC 배양물로부터, 응집체 형성은 Rho-키나제 억제제 Y27632의 존재 하에서 일어난다. BMP4 및 CHiR 보충 배지는 응집체가 중배엽 운명을 향하도록 지시하는 데 사용됩니다. 중배엽 유도 배지는 VEGFA 및 포스콜린 보충 배지로 대체되어 혈관 계통을 향한 응집체를 자극합니다. 콜라겐 I 및 가용화된 기저막 매트릭스에 응집체를 매립하고 VEGFA 및 FGF2 함유 배지에 노출시킴으로써 달성된 기계적 및 화학적 대기열은 응집체로부터 거의 방사상 대칭적인 혈관 발아를 초래한다. 생성된 혈관 네트워크는 콜라겐 I 및 가용화된 기저막으로부터 제거될 수 있고, 추가의 성숙, 분석, 또는 생체내 이식을 위해 현탁 배양물에 배치될 수 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig02.jpg"> 그림 2: 명시야에서 캡처된 hBVO 생성의 단계적 진행. (A) -1일째 hPSC(H9) 콜로니의 전형적인 형태. (B) Y-27632의 존재 하에 6-웰 초저 부착 플레이트에서 hPSC 응집체(0일)의 생성. (C) BMP4 및 ChiR 보충 배지를 사용한 응집체의 중배엽 유도(1일차). 응집체 크기와 모양의 미묘한 변화도 관찰할 수 있습니다. (D) VEGFA 및 포스콜린 보충 배지를 사용하여 혈관 계통을 향해 프라이밍된 4일차 응집체. (E) 응집체를 발아 매트릭스에 포매하고 VEGFA 및 FGF2 보충 발아 배지에 노출시킨 지 1일째 되는 날(7일째)에 초기 혈관 발아. (F) 건강한 오가노이드 형태 및 9일째에 지속적인 혈관 발아. (G) 10일째에 싹이 트는 후기 단계 혈관. 이상적으로는 오가노이드 중심의 조밀한 세포 구조가 이때까지 사라졌습니다. (H) 성숙한(15일) 인간 혈관 오가노이드의 전형적인 형태. 초저부착 96웰 배양 플레이트에서 절단 및 성숙을 통해 주변 매트릭스를 제거하면 내부에 수용된 혈관 네트워크와 함께 오가노이드가 구형으로 형성됩니다. 스케일 바: (A,B,E,F) 250 μm; (C,D) 500 마이크로미터; (G,H) 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig03.jpg"> 그림 3: 성숙한(15일) 인간 혈관 오가노이드의 전체 마운트 염색. (A) 자가 조직화된 내피(CD31+, 자홍색) 네트워크 및 주변 혈관주위세포(PDGFR-β+, 청록색) 및 알파 평활근 액틴(SMA+, 노란색) 커버리지를 가진 성숙한(15일) 인간 혈관 오가노이드의 제시. (B) 혈관 네트워크의 SMA+(노란색) 및 PDGFR-β+(청록색) 표현을 자세히 설명하는 A의 고배율. (C) 내피(CD31+, 자홍색), 혈관주위세포(PDGFR-β+, 청록색) 및 알파-평활근 액틴(SMA+, 노란색) 상호작용의 상세한 표현. (D) 성숙한 혈관 오가노이드의 단면(왼쪽) 및 고배율(오른쪽)에서 혈관 내피(CD31+, 자홍색)-평활근(SMA+, 노란색) 상호 작용의 전체 마운트 염색. (E) 벽화 세포와 내피관의 긴밀한 결합을 통한 혈관 기저막(Col IV+, 그레이스케일)의 자기 주도적 형성. 스케일 바: (A,D[왼쪽]) 100 μm; (B,D[오른쪽],E) 25μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

이 프로토콜은 인간 만능 및 유도 만능 줄기 세포로부터 자가 조직화 혈관의 생성을 설명합니다. 이러한 혈관 네트워크는 혈관주위세포, 평활근 액틴 및 연속적인 기저막으로 둘러싸인 광범위하고 연결된 내피 네트워크를 나타냅니다.

만능줄기세포(Pluripotent Stem Cells)에서 인간 혈관 오가노이드(Human Blood Vessel Organoids)의 생성

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

이 프로토콜은 만능 줄기 세포에서 인간 혈관 오가노이드 생성을 설명합니다. 이 기술은 혈관 형성, 혈관 신생, 혈관 질환 및 혈관 병리의 측면을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 재현성과 높은 처리량 특성, 그리고 다양한 줄기 세포주에 걸친 일관성은 이 기술의 강력한 장점입니다.적용 측면에서 우리의 이전 연구 중 일부는 당뇨병 환자 맥관 구조의 형태학적 변화를 연구하기 위해 혈관 오가노이드를 사용하는 방법을 설명하고 당뇨병성 혈관병증에 대한 약물 치료 방법을 탐구합니다. 초기 줄기 세포 집단을 적절하게 유지하고, 응집체가 뭉치는 것을 방지하고, 거의 균질한 응집체 직경을 보장하는 것은 좋은 혈관 오가노이드를 생성하는 데 필수적인 요소입니다. 70%의 밀도를 갖는 배양된 인간 만능 줄기 세포(hPSC)를 사용하여 응집체 생성을 시작합니다.피펫 또는 진공 시스템을 사용하여 배양 배지를 흡인하고 섭씨 37도에서 5분 동안 세포를 배양하기 전에 1밀리리터의 세포 해리 시약으로 교체합니다. 한편, 텍스트 원고에 언급 된 공식에 따라 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 필요한 양의 응집 배지를 준비하십시오. 세포를 배양한 후, 1밀리리터의 응집 배지에 세포를 현탁시키기 전에 세포 해리 시약을 흡인합니다.내용물을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 자동 세포 계수 장치 또는 현미경을 사용하여 세포 수를 계산하고 응집체 형성에 필요한 총 세포 수를 계산합니다. 세포 생존율 판독값은 클러스터가 낮거나 전혀 없는 단일 세포 현탁액을 보여줍니다.튜브에서 상청액을 흡인하고 15밀리리터 고투명 폴리프로필렌 원추형 튜브의 응집 배지에 적절한 양의 세포 현탁액을 추가하고 희석된 세포 현탁액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 균질한 세포 분포를 보장합니다. 희석된 세포 현탁액의 3 밀리리터를 6-웰 초저부착 배양 플레이트의 각각의 원하는 웰에 피펫팅한다. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 응집체의 크기와 모양을 유지하기 위해 방해를 최소화하십시오.텍스트 원고에 설명 된대로 중배엽 매체를 준비하십시오. 세포의 파종 24 시간 후, 배양 접시를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 플레이트를 원을 그리며 소용돌이 치면 각 우물의 중앙에 응집체가 축적됩니다.1 밀리리터 피펫을 사용하여 각 웰에서 해당 원추형 튜브로 배지가있는 응집체를 부드럽게 옮깁니다. 응집체가 실온에서 1시간 동안 원뿔형 튜브에 침전되도록 합니다. 침전되면 침전된 응집체를 방해하지 않고 피펫 또는 고감도 흡인 펌프로 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.2 밀리리터의 중배엽 유도 매체를 추가하여 각 튜브의 응집체를 재현탁합니다. 다음으로, 각 튜브의 현탁액을 다시 초저 부착 6웰 배양 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 섭씨 37 도의 인큐베이터에 접시를 놓고 4 일째까지 그대로 두십시오.4일째 되는 날, 배양 접시를 인큐베이터에서 꺼낸 다음 접시를 원을 그리며 흔들어 각 웰 중앙에 응집체를 수집합니다. 1 밀리리터 피펫을 사용하여 주변 매체와 함께 응집체를 각 웰에서 해당 원추형 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 응집체가 튜브에 침전될 수 있도록 타이머를 30분으로 설정합니다.응집체가 침전되면 이전에 시연된 대로 배양 플레이트를 준비하고 6일까지 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 응집체 포매 및 혈관 새싹 유도를 위해, 얼음 위에서 작업하는 동안 세포 외 기질 용액의 원하는 최종 부피를 준비하십시오. 500 마이크로리터의 ECM을 12-웰 플레이트의 하나의 웰에 피펫팅하여 ECM 샌드위치의 제1 층을 형성하였다.첫 번째 ECM 층의 효과적인 중합을 보장하기 위해 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 2시간 동안 두십시오. 2 시간의 배양이 끝날 무렵, 배양 접시의 응집체 작업을 시작하십시오. 1밀리리터 피펫을 사용하여 각 웰의 응집체와 배지를 해당 15밀리리터 원뿔형 튜브로 부드럽게 옮기기 전에 각 웰의 중앙에 응집체를 수집합니다.상층액을 흡인하기 전에 응집체가 10-15분 동안 침전되도록 합니다. 그런 다음 골재가 들어 있는 원추형 튜브를 얼음 위에 5분 동안 보관합니다. 신속하고 신중하게 작업하여 기포 형성 없이 500마이크로리터의 ECM에 응집체를 재현탁합니다.피펫을 사용하여 12-웰 플레이트의 웰 내부의 이미 중합된 제1 ECM 층 위에 ECM 응집체 현탁액을 적층합니다. 그 동안 텍스트 원고에 설명 된대로 발아 배지를 준비하십시오. 섭씨 37도에서 2시간 배양한 후 섭씨 37도로 예열된 발아 배지 1밀리리터를 웰에 넣어 혈관 분화를 유도합니다.무균 상태에서 작업하려면 무균 주걱의 둥근 끝을 사용하여 혈관 네트워크를 포함하는 ECM 발아 매트릭스를 풉니다. 그런 다음 멸균 집게와 멸균 주걱의 둥근 끝을 사용하여 느슨한 젤 디스크를 10cm 배양 접시의 뚜껑에 조심스럽게 옮깁니다. 원하는 배율과 초점으로 조정된 실체 현미경으로 뚜껑에 젤을 놓고 멸균 바늘을 사용하여 단일 혈관 네트워크를 절단하여 이 과정에서 얻은 혈관화되지 않은 ECM의 양을 제한합니다.분리된 오가노이드를 3밀리리터의 발아 배지를 함유하는 초저부착 6웰 플레이트의 한 웰로 다시 부드럽게 옮깁니다. 다음으로, 1 밀리리터 피펫을 사용하여, 단일 오가노이드를 초저 부착 96-웰 플레이트의 적절한 수의 웰로 옮긴다. 일단 옮겨지면, 200 마이크로리터의 예열 발아 배지를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다.96웰 플레이트에서 분리한 후 4-6일이 지나면 오가노이드를 고정하고 염색하기 전에 오가노이드가 둥글고 건강한 형태를 갖는지 확인합니다. hPSC에서 생성된 인간 혈관 오가노이드(hBVO)의 단계적 진행 이미지를 명시야에서 캡처했습니다. 0일째에, 직경이 30 내지 100 미크론에 이르는 응집체가 hPSC 배양물로부터 생성되었다.응집체의 크기와 모양의 미묘한 변화가 1일째 중배엽 유도 시 관찰되었으며, 이는 응집체가 혈관 프라이밍을 거치면서 4일째에 추가로 변화했습니다. 거의 방사상 대칭적인 초기 혈관 발아는 발아 매트릭스에 응집체를 매립한 다음 날인 7일째에 관찰할 수 있습니다. 건강한 오가노이드 형태와 지속적인 혈관 발아가 9일째에 나타났으며, 이는 오가노이드 중심의 조밀한 세포 구조가 거의 사라진 10일째까지 발아하는 후기 단계 혈관으로 진행되었습니다.성숙한 인간 혈관 오가노이드의 전형적인 형태는 15일까지 명확하게 관찰되었습니다. 15일째에 성숙한 hBVO의 전체 마운트 염색은 CD31 양성이고 PDGFR 베타 양성 기생충 및 SMA 양성 알파-평활근 액틴에 의해 둘러싸인 광범위하고 연결된 내피 네트워크를 나타내었다. 내피 혈관 네트워크를 캡슐화하는 PDGFR-베타 양성 및 SMA 양성 벽화 세포가 잘 관찰됩니다.혈관 네트워크를 감싸는 연속적인 콜라겐 IV-양성 기저막이 또한 관찰되었다. 포매 단계 동안 세포외 기질의 적절한 중합을 보장하는 것은 효과적인 혈관 발아에 매우 중요합니다. 연구원들은 우리의 혈관 오가노이드 기술을 사용하여 이전에 무혈성이었던 뇌 및 신장과 같이 이미 확립된 오가노이드 모델에서 초기 혈관 구획을 생성했습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

연구

생체공학

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

인간 다능성 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오르가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역 염색에 의한 특성화

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

화학적으로 정의된 조건하에서 인간 유도된 다능성 줄기 세포에서 성숙한 신장 분피의 유도된 분화

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

섬유아세포, 선별 애플리케이션을 위한 인간 공학형 결합 조직

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...