Name: generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells
Uploaded: 2023-01-20T13:35:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Agradecemos a todos os membros de nossos laboratórios pela contribuição crítica e discussões. A JMP recebeu financiamento da fundação T. von Zastrow, do prêmio FWF Wittgenstein (Z 271-B19), da Academia Austríaca de Ciências, da Empresa Comum Iniciativa de Medicamentos Inovadores 2 (JU) sob o acordo de subvenção nº 101005026, das Redes Transatlânticas de Excelência em Pesquisa Cardiovascular da Leducq, do Programa de Pesquisadores Distintos do Instituto Allen e do Programa de Cátedras de Pesquisa do Canadá 150 F18-01336, bem como dos subsídios F20-02343 e F20-02015 dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde COVID-19.

<ol>
	<li>Okwuosa, I. S., Lewsey, S. C., Adesiyun, T., Blumenthal, R. S., Yancy, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+disparities+in+cardiovascular+disease:+Challenges+and+solutions.">Worldwide disparities in cardiovascular disease: Challenges and solutions.</a> International Journal of Cardiology. 202, 433-440 (2016).</li><li>Page, R. 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Não há relação entre os interesses financeiros dos autores e a pesquisa apresentada. A tecnologia de organoides de vasos sanguíneos foi licenciada para a Stemcell Technologies. J.M.P. é fundador e acionista da Angios Biotech, que desenvolve organoides de vasos sanguíneos como terapia de transplante vascular. Um pedido de patente relacionado a este trabalho foi depositado sob o número Pat. US20200199541A1, listando Reiner A. Wimmer, Josef M. Penninger e Dontscho Kerjaschki como inventores.

Avanços recentes em culturas de organoides derivados de células-tronco forneceram a estrutura para modelos mais avançados e fisiologicamente relevantes de vasculatura humana. O modelo organoide de vasos sanguíneos humanos (hBVO) aqui apresentado, desenvolvido em nosso laboratório 8,10, fornece um poderoso meio de explorar não apenas outros aspectos da vasculogênese humana, mas também novos caminhos de modelagem de doenças e terapia regenerativa 8,10,11. Múltiplos modelos in vivo têm sido empregados para explorar o desenvolvimento e a maturação dos vasos sanguíneos, a doença vascular e a disfunção endotelial 3,4. Diferentes abordagens combinam células definidas por linhagens únicas e múltiplas, derivadas de células-tronco ou isoladas de tecidos adultos in vivo, para criar redes vasculares humanas replicativas 5,6. O protocolo aqui apresentado aproveita o princípio da biologia do desenvolvimento e da auto-organização para produzir a primeira rede de vasos sanguíneos humanos de linhagem multicelular que pode ser gerada, em essência, a partir de uma única hPSC 8,10.
Cada linhagem de células-tronco tem uma composição genética única e difere das outras em termos de origem, função e capacidade de resposta15. Portanto, o protocolo para organoides de vasos sanguíneos humanos (hBVOs) foi desenvolvido e otimizado para garantir uma compatibilidade de protocolo robusta e reprodutível com múltiplas (>12) diferentes linhagens de hPSC 8,10. O método descrito aqui gera organoides de vasos sanguíneos derivados de hPSC ao longo de 2 semanas. No entanto, alterações na composição do meio e/ou nas técnicas de geração de hBVO podem levar a uma rede de vasos e geração organoide ineficazes. As diferentes taxas de proliferação de linhagens individuais de células-tronco também impactam marcadamente a reprodutibilidade da experimentação com células-tronco15 e, portanto, das culturas de organoides. Por exemplo, na geração dos BVOs, células mais proliferativas ou um número maior de grandes agregados do dia 1 estão inerentemente sujeitos a diferentes ambientes metabólicos e parâmetros de difusão de gases e nutrientes. Isso, por sua vez, altera os tempos de exposição e eficiências dos fatores de crescimento, o grau de diferenciação e priming vascular e, mais importante, a capacidade de formar redes vasculares ao incorporar os agregados na matriz de colágeno 1 e membrana basal solubilizada.
A difusão passiva de oxigênio e a administração de nutrientes essenciais a partir de um ambiente externo não é ideal para o crescimento celular a longo prazo de organoides 3D e morfogênese tecidual in vitro16. Embora dependente de vários fatores (i.e., taxa metabólica tecidual, biodisponibilidade de nutrientes e gases, ambiente estático ou dinâmico), um limite geral de difusão de 150 μm O2 e nutrientes foi estabelecido para tecidos cultivados in vitro, considerando que, fisiologicamente, os tecidos humanos apresentam cordões de células vivas dentro de 150 μm de vasos sanguíneos perfundidos17. Embora distâncias efetivas de difusão de gases e nutrientes de 70-200 μm também tenham sido propostas18,19,20,21, a densidade de construto, temperatura, pH e composição do meio impactam significativamente a eficácia da difusão. Devido à otimização da área de superfície e à comunicação do receptor integrina-beta após a incorporação no dia 6, agregados de 250-300 μm de diâmetro apresentam melhor desempenho do que aqueles >500-600 μm de diâmetro, resultando em um processo completo de brotação do vaso e um núcleo organoide minimamente condensado. Assim, o tamanho do agregado é crucial e pode ser afetado tanto pelo número de células utilizadas durante a semeadura inicial quanto pelo tempo alocado para a formação do agregado. As placas de micropoços que permitem o controle do tamanho e do número22 do agregado são uma alternativa viável à técnica de formação de agregados estocásticos resultante do uso de placas de 6 poços de fixação ultrabaixa neste protocolo. A consistência no tempo e no gerenciamento dos tamanhos agregados durante os primeiros 6 dias do protocolo hBVO é um dos, se não o mais, indicadores cruciais do desenvolvimento bem-sucedido de organoides de vasos sanguíneos de boa-fé.
As mudanças de meio no dia 1 (indução do mesoderma) e no dia 4 (indução vascular) devem ser completadas em combinação com a sedimentação dos agregados. Embora a centrifugação seja uma alternativa tentadora, as forças adicionais aplicadas aos aggerates fracamente montados podem causar aglomeração, montagem e cisalhamento indesejados, o que afeta negativamente a diferenciação, maturação e eficácia de brotação nos estágios posteriores do protocolo. Trabalhar no gelo durante o processo de incorporação do dia 6 é fundamental para preservar a polimerização adequada do ECM e a formação da camada. Durante a incorporação de agregados e a indução de brotamento, a exposição do MEC a temperaturas acima de 4°C e/ou a um pH do MEC diferente de 7,4 afetará não apenas as taxas de polimerização e a integridade da camada de MEC, mas também a eficiência de brotação dos agregados incorporados. A natureza elástica da matriz de germinação da MEC permite fácil desprendimento e transporte da placa de cultura de 12 poços para a superfície de corte estéril. Organoides individuais removidos da matriz e transferidos para placas de 96 poços de fixação ultrabaixa consumirão o restante da MEC circundante e reterão redes de microvasos endoteliais revestidas por células murais auto-organizadas com uma membrana basal contínua.
Embora não contempladas nesta proposta, alterações nas composições dos meios podem replicar doenças que, por sua vez, provocam respostas patológicas em hBVOs 8,11. Os limites da modelagem de doenças usando o sistema hBVO estão longe de ser bem conhecidos, e esta é certamente uma área que precisa ser explorada. A aplicação da tecnologia organoide de nossos vasos sanguíneos na vascularização de construções organoides previamenteavasculares23 também é de significativo impacto e interesse.

A disfunção vascular e as doenças dos vasos sanguíneos apresentam complicações marcantes nas funções dos órgãos. A doença cardiovascular (DCV) é a principal causa de morte nomundo1 e também o principal fator que contribui para o aumento dos custos de saúde nos Estados Unidos. O número de casos de DCV vem aumentando anualmente, e o aumento desses casos está ocorrendo em faixas etárias mais jovens (20-45 anos)2. Múltiplos modelos in vivo têm sido desenvolvidos para explorar o desenvolvimento e a maturação dos vasos sanguíneos, a doença vascular e a disfunção endotelial 3,4. Atualmente, métodos que combinam células definidas por linhagens únicas e múltiplas, derivadas de células-tronco ou isoladas de tecidos adultos in vivo, podem criar redes vasculares que replicam aspectos da anatomia e função vascular humana 5,6. Os vasos sanguíneos surgiram como um dos primeiros sistemas funcionais durante o desenvolvimento a partir do mesoderma, e se organizam por meio de um processo de montagem denominado "vasculogênese" ou por expansão e ramificação a partir de vasos pré-existentes, o que é denominado "angiogênese"7.
Wimmer e col. relataram os primeiros organoides de vasos sanguíneos humanos 3D auto-organizáveis a partir de hPSCs que exibem as características funcionais, morfológicas e moleculares da microvasculatura humana8. Assim como a vasculaturahumana9, esses hBVOs são gerados e apresentam endotélio, membrana basal contínua e células muraisadjacentes8,10. Os hBVOs podem ser transplantados in vivo e anastomosados com a circulação endógena. Eles também podem sofrer maturação in vitro e servir como modelos para doenças cardiovasculares (ou seja, diabetes)8 ou tropismo tecidual em infecções virais como o SARS-CoV-211. Embora tenhamos publicado anteriormente um protocolo escrito10, não existe nenhum protocolo de vídeo disponível para esta técnica complexa.
Através de uma progressão concisa stepwise, a formação de hBVO é realizada através da formação de agregados, indução do mesoderma usando um agonista WNT, Chiron (CHIR99021), e proteína morfogênica óssea - 4 (BMP4)12,13, indução vascular via fator de crescimento endotelial vascular A (VEGFA) e Forskolina (Fors)12, e incorporação em uma matriz de brotamento personalizada 8,10. A maturação vascular e a formação de redes seguem a incorporação dos agregados na matriz de brotamento. Essas redes de vasos humanos se formam dentro de 2-3 semanas e podem ser removidas da matriz de brotação e cultivadas em sistemas de cultura escaláveis por até 6 meses. Aqui, procedimentos opticamente guiados são fornecidos para a formação e aplicação de vasculatura derivada de células-tronco humanas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% sodium bicarbonate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell dissociation reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1391, 0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-rabbit IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-546-152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-sheep IgG</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647&#8211;anti-goat IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-606-147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Faster</td>
			<td></td>
			<td>SafeFAST Premium 212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-111-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF806</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td>Multifuge 4 KR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td></td>
			<td>Galaxy 170S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Basement membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (22 x 50 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3&#8211;anti-mouse IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-166-150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modefied Eagle&#39;s Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648-10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovien Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-093-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Heraguard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted contrasting tissue culture microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Vert.A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer&#160;</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>IS009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-essential amino acids (NEAAs)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (4%) in PBS</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BM-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3169S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips (6.5-10)</td>
			<td>Mquant, Millipore</td>
			<td>109543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (P1000, P200 and P20)</td>
			<td>Gilson, Integra Pipetboy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime Surface-U 96-well plates&#160;</td>
			<td>Sumilon</td>
			<td>MS9096-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PurCol&#160;</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS gel</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS mounting solution</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5, 10 and 25 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357529, 357530, 357515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>vSMC/Pericyte</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2547</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel micro spatula (rounded end)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel spoon (double-ended)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BelArt H367290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemflex medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>stem cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10639011</td>
			<td>flexible serum-free medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 &#956;L)</td>
			<td>Biozym, Surphob</td>
			<td>VT0270, VT0250, VT0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 12-well plates TC&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 6-well plates&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30720113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>mammalian cell dissociating enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low-attachment 6-well plates</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Isotemp 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>688000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells

Um organoide é definido como um tecido multicelular projetado in vitro que imita seu órgão correspondente in vivo de tal forma que pode ser usado para estudar aspectos definidos desse órgão em uma placa de cultura de tecidos. A amplitude e a aplicação da pesquisa organoide derivada de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) avançaram significativamente para incluir o cérebro, retina, ducto lacrimal, coração, pulmão, intestino, pâncreas, rim e vasos sanguíneos, entre vários outros tecidos. O desenvolvimento de métodos para a geração de microvasos humanos, especificamente, abriu caminho para a modelagem do desenvolvimento de vasos sanguíneos humanos e doenças in vitro e para o teste e análise de novas drogas ou tropismo tecidual em infecções por vírus, incluindo o SARS-CoV-2. Protocolos complexos e demorados, sem orientação visual, dificultam a reprodutibilidade de muitos organoides derivados de células-tronco. Além disso, a estocástico inerente aos processos de formação de organoides e auto-organização requer a geração de protocolos ópticos para avançar na compreensão da aquisição e programação do destino celular. Aqui, um protocolo visualmente guiado é apresentado para a geração de organoides de vasos sanguíneos humanos (BVOs) 3D projetados a partir de hPSCs. Apresentando membrana basal contínua, células endoteliais vasculares e articulação organizada com células murais, as BVOs exibem as características funcionais, morfológicas e moleculares da microvasculatura humana. A formação de BVO é iniciada através da formação de agregados, seguida de mesoderma e indução vascular. A maturação vascular e a formação de redes são iniciadas e suportadas pela incorporação de agregados em uma matriz 3D de colágeno e membrana basal solubilizada. As redes de vasos humanos se formam dentro de 2-3 semanas e podem ser cultivadas em sistemas de cultura escaláveis. É importante ressaltar que os BVOs transplantados em camundongos imunocomprometidos se anastomosam com a circulação endógena de camundongos e especificam em artérias, veias e arteríolas funcionais. O presente protocolo visualmente guiado fará avançar a pesquisa em organoides humanos, particularmente em relação a vasos sanguíneos em desenvolvimento normal, vascularização tecidual e doença.

As etapas descritas neste protocolo foram desenvolvidas especificamente para produzir um método controlado e preciso para a geração de organoides de vasos sanguíneos humanos a partir de hPSCs. A geração de agregados de 30-100 μm de diâmetro a partir de culturas hPSC marca o ponto de partida do protocolo (Figura 1, Figura 2B). Os agregados são conduzidos através de induções passo a passo em direção ao mesoderma (dia 1 dia 4) e linhagens vasculares (dia 4 dia 6) antes da incorporação (dia 6) (Figura 2A-D), o que é necessário para a formação da rede vascular. O brotamento quase radialmente simétrico dos vasos deve ser visível por d7 ou d8 (Figura 2E) e continuar até d10 (Figura 2F,G). O explante dos hBVOs do ECM para as placas de fixação ultrabaixas de 96 poços reduz a fragilidade das redes de brotação e permite a manutenção contínua em condições de cultura de suspensão (Figura 2H) por até 6 meses. Em d15, os hBVOs exibem uma extensa e conectada rede endotelial (CD31+) circundada por pericitos (PDGFR-ß+) e actina de músculo liso (SMA+) (Figura 3A-D). Uma membrana basal contínua de colágeno IV (ColIV+) envolve as redes vasculares (Figura 3E). As células endoteliais (CD31+, VE-Caderina+) e pericitos (PDGFR-ß+) compreendem aproximadamente 30%-35% e 60%-65% das populações de células organoides, respectivamente8. O brotamento ativo dos vasos ocorre sob a direção de uma população de células pontais (CD31+) organizadas endogenamente que apresenta morfologia típica das células da ponta, como o excesso de filípodes 8,10. A apresentação das células murais PDGFR-ß+ e SMA+ encapsulando as redes vasculares endoteliais pode ser vista por d15 do processo de maturação organoide (Figura 3A,C). Após a remoção da MEC e maturação em cultura de suspensão (i.e., d15), os hBVOs são sustentáveis para as respectivas análises ou transplante sob a cápsula renal de camundongo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig01.jpg"> Figura 1: Esquema do protocolo hBVO destacando o tempo e a progressão gradual. A partir de culturas aparentemente homogêneas de hPSC ou hiPSC, a formação de agregados ocorre na presença do inibidor de Rho-quinase Y27632. O meio BMP4 e CHiR-suplementado é usado para instruir os agregados em direção ao destino mesodérmico. O meio de indução do mesoderma é substituído por VEGFA e meio suplementado com forskolin para estimular os agregados em direção a uma linhagem vascular. Filas mecânicas e químicas obtidas através da incorporação dos agregados em uma matriz de membrana basal solubilizada e colágeno I e exposição a meio contendo VEGFA e FGF2 resultam em brotamento vascular quase radialmente simétrico do corpo agregado. As redes vasculares geradas podem ser removidas do colágeno I e da membrana basal solubilizada e colocadas em cultura de suspensão para posterior maturação, análise ou transplante in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig02.jpg"> Figura 2: Progressão gradual da geração de hBVO capturada sob campo claro. (A) Morfologia típica de colônias hPSC (H9) no dia −1. (B) Geração de agregados hPSC (dia 0) em placas de fixação ultrabaixa de 6 poços na presença de Y-27632. (C) A indução mesodérmica de agregados utilizando BMP4 e meio ChiR suplementado (dia 1). Mudanças sutis no tamanho e na forma dos agregados também podem ser observadas. (D) Agregados do dia 4 preparados para uma linhagem vascular usando VEGFA e meio suplementado com forskolina. (E) Brotação precoce do vaso no dia 7, um dia após a incorporação dos agregados na matriz de brotação e exposição ao meio de brotação suplementado com VEGFA e FGF2 (dia 7). (F) Morfologia organoide saudável e brotação contínua do vaso no 9º dia. (G) Navio em fase avançada brotando no dia 10. Idealmente, as estruturas celulares densas no centro organoide desapareceram por esta altura. (H) Morfologia típica de organoides de vasos sanguíneos humanos maduros (dia 15). A remoção da matriz circundante por corte e maturação em placas de cultura de 96 poços de fixação ultrabaixa molda os organoides esfericamente, com as redes de vasos alojadas internamente. Barras de escala: (A,B,E,F) 250 μm; (C,D) 500 μm; (G,H) 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig03.jpg"> Figura 3: Coloração de montagem total de organoides de vasos sanguíneos humanos maduros (dia 15). (A) Apresentação de organoides de vasos sanguíneos humanos maduros (dia 15) com redes endoteliais auto-organizadas (CD31+, magenta) e cobertura pericitária (PDGFR-β+, ciano) e actina de músculo liso alfa (SMA+, amarelo). (B) Maior ampliação de A detalhando a expressão SMA+ (amarelo) e PDGFR-β+ (ciano) das redes de vasos. (C) Apresentação detalhada da interação endotelial (CD31+, magenta), pericito (PDGFR-β+, ciano) e alfa-actina de músculo liso (SMA+, amarelo). (D) Coloração de montagem total da interação endotelial (CD31+, magenta)-músculo liso (SMA+, amarelo) do vaso em um corte transversal (esquerda) e uma maior ampliação (direita) de organoides de vasos sanguíneos maduros. (E) Formação autodirigida de uma membrana basal vascular (Col IV+, escala de cinza) através da estreita associação das células murais e tubos endoteliais. Barras de escala: (A,D[esquerda]) 100 μm; (B,D[direita],E) 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Este protocolo descreve a geração de vasos sanguíneos auto-organizadores a partir de células-tronco pluripotentes e pluripotentes induzidas humanas. Essas redes vasculares exibem uma extensa e conectada rede endotelial circundada por pericitos, actina de músculo liso e membrana basal contínua.

Geração de Organoides de Vasos Sanguíneos Humanos a partir de Células-Tronco Pluripotentes

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Este protocolo descreve a nossa geração de organoides de vasos sanguíneos humanos a partir de células estaminais pluripotentes. Esta tecnologia pode ser utilizada para estudar aspectos da vasculogênese, angiogênese, doenças vasculares, bem como patologias vasculares. A reprodutibilidade e a natureza de alto rendimento, bem como sua consistência em muitas linhagens diferentes de células-tronco, são fortes vantagens desta técnica.Em termos de sua aplicação, algumas de nossas pesquisas anteriores delineiam o uso de organoides de vasos sanguíneos para estudar as alterações morfológicas da vasculatura de pacientes diabéticos e exploram caminhos de tratamento medicamentoso para vasculopatia diabética. Manter adequadamente a população inicial de células-tronco, evitar que os agregados se aglutinem e garantir um diâmetro de agregado quase homogêneo, esses são fatores essenciais para gerar bons organoides dos vasos sanguíneos. Iniciar a geração de agregados usando células-tronco pluripotentes humanas cultivadas, ou hPSCs, com 70% de confluência.Usando uma pipeta ou um sistema de vácuo, aspirar o meio de cultura e substituí-lo por um mililitro de reagente de dissociação celular antes de incubar as células por cinco minutos a 37 graus Celsius. Enquanto isso, prepare o volume necessário de meio de agregação em um tubo cônico de 15 mililitros, seguindo a formulação mencionada no manuscrito do texto. Após incubar as células, aspirar o reagente de dissociação celular antes de suspender as células em um mililitro de meio de agregação.Pipete suavemente o conteúdo para cima e para baixo para criar uma suspensão de célula única. Conte as células usando um dispositivo automatizado de contagem de células ou sob um microscópio e calcule o número total de células necessárias para a formação de agregados. A leitura da viabilidade celular mostra suspensão de célula única com baixo ou nenhum aglomerado.Aspirar o sobrenadante do tubo e adicionar o volume adequado da suspensão celular ao meio de agregação no tubo cônico de polipropileno de alta claridade de 15 mililitros e pipetar suavemente a suspensão de células diluídas para cima e para baixo para garantir uma distribuição celular homogênea. Pipetar três mililitros da suspensão de células diluídas em cada poço desejado da placa de cultura de fixação ultrabaixa de seis poços. Coloque a placa na incubadora e minimize qualquer perturbação para manter o tamanho e a forma dos agregados.Preparar o meio mesodérmico conforme descrito no manuscrito do texto. 24 horas após a semeadura das células, retirar a placa de cultura da incubadora. Gire a placa em movimento circular para acumular os agregados no centro de cada poço.Usando uma pipeta de um mililitro, transfira suavemente os agregados com o meio de cada poço para o tubo cônico correspondente. Deixar sedimentar os agregados nos tubos cônicos à temperatura ambiente por uma hora. Uma vez sedimentado, aspirar o sobrenadante com uma pipeta ou uma bomba aspiradora de alta sensibilidade cautelosamente, sem perturbar os agregados sedimentados.Ressuspender os agregados em cada tubo adicionando dois mililitros de meio de indução mesodérmico. Em seguida, transfira a suspensão de cada tubo de volta para o respectivo poço da placa de cultura de seis poços de fixação ultrabaixa. Coloque a placa na incubadora a 37 graus Celsius e deixe até o quarto dia.No quarto dia, retire a placa de cultura da incubadora e, em seguida, agite a placa em movimento circular para coletar os agregados no centro de cada poço. Usando uma pipeta de um mililitro, transfira suavemente os agregados com o meio circundante de cada poço para o tubo cônico correspondente. Ajuste um temporizador por 30 minutos para permitir que os agregados sedimentem nos tubos.Uma vez que os agregados sedimentam, prepare as placas de cultura como demonstrado anteriormente e coloque-as na incubadora a 37 graus Celsius até o sexto dia. Para incorporação de agregados e indução de brotos de vasos, prepare o volume final desejado da solução de matriz extracelular enquanto trabalha com gelo. Pipetar 500 microlitros do ECM em um poço de uma placa de 12 poços para formar a primeira camada do sanduíche ECM.Para garantir a polimerização eficaz da primeira camada de ECM, coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por duas horas. Ao final das duas horas de incubação, comece a trabalhar com os agregados na placa de cultura. Reúna os agregados no centro de cada poço antes de usar uma pipeta de um mililitro para transferir suavemente os agregados e o meio de cada poço para um tubo cônico correspondente de 15 mililitros.Deixe os agregados assentarem por 10 a 15 minutos antes de aspirar o sobrenadante. Em seguida, mantenha os tubos cônicos contendo os agregados sobre gelo por cinco minutos. Trabalhando de forma rápida e cuidadosa, ressuspenda os agregados em 500 microlitros de ECM sem formação de bolhas.Usando uma pipeta, coloque a suspensão de agregados ECM sobre a primeira camada de ECM já polimerizada dentro do poço na placa de 12 poços. Enquanto isso, prepare o meio de brotação, conforme descrito no manuscrito do texto. Após duas horas de incubação a 37 graus Celsius, adicione um mililitro de meio de brotação pré-aquecido a 37 graus Celsius no poço para induzir a diferenciação dos vasos sanguíneos.Trabalhando em condições estéreis, use a extremidade arredondada de uma espátula estéril para soltar a matriz de brotamento da MEC que contém as redes vasculares. Em seguida, usando pinças estéreis e a extremidade arredondada de uma espátula estéril, transfira cuidadosamente o disco de gel solto para a tampa de uma placa de cultura de 10 centímetros. Coloque o gel sobre a pálpebra sob um estereomicroscópio ajustado para a ampliação e foco desejados e use agulhas estéreis para cortar as redes de vasos sanguíneos únicos, tentando limitar a quantidade de MEC não vascularizada obtida no processo.Transfira suavemente os organoides isolados de volta para um poço de uma placa de seis poços de fixação ultrabaixa contendo três mililitros de meio de brotação. Em seguida, usando uma pipeta de um mililitro, transfira os organoides individuais para o número apropriado de poços em uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa. Uma vez transferido, adicione 200 microlitros de meio de brotação pré-aquecido em cada poço da placa de 96 poços.Quatro a seis dias após o isolamento na placa de 96 poços, certifique-se de que os organoides possuam uma morfologia redonda e saudável antes de proceder à fixação e mancha. Imagens da progressão gradual da geração organoide dos vasos sanguíneos humanos, ou hBVO, a partir de hPSCs foram capturadas sob campo claro. No dia zero, agregados variando de 30 a 100 mícrons de diâmetro foram gerados a partir da cultura de hPSC.Mudanças sutis no tamanho e na forma dos agregados foram observadas na indução do mesoderma no primeiro dia, que se alteraram ainda mais no quarto dia à medida que os agregados foram submetidos ao priming vascular. A brotação inicial dos vasos, quase radialmente simétrica, pode ser observada no sétimo dia, um dia após a incorporação dos agregados na matriz de brotação. A morfologia organoide saudável e o brotamento contínuo dos vasos foram vistos no nono dia, que progrediu para vasos em estágio avançado brotando no dia 10, quando as estruturas celulares densas no centro organoide quase desapareceram.A morfologia típica de organoides de vasos sanguíneos humanos maduros foi claramente observada no 15º dia. A coloração de montagem total dos hBVOs maduros no dia 15 exibiu uma extensa e conectada rede endotelial que era CD31-positiva e circundada por parasitas PDGFR-beta-positivos e actina de músculo liso alfa-positiva para SMA. As células murais positivas para PDGFR-beta e SMA-positivas que encapsulam as redes vasculares endoteliais são bem observadas.Membrana basal contínua positiva para colágeno IV envolvendo as redes vasculares também foi observada. Garantir uma polimerização adequada da matriz extracelular durante a etapa de incorporação é fundamental para a brotação eficaz dos vasos sanguíneos. Pesquisadores têm usado nossa tecnologia de organoides de vasos sanguíneos para gerar compartimentos vasculares precoces em modelos organoides já estabelecidos, como cérebro e rim, que antes eram avasculares.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Desenvolvimento, expansão e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Bioengenharia

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Geração escalável de organoides cerebelares maduros de células-tronco pluripotentes humanas e caracterização por imunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Diferenciação guiada de podocitos renais maduros de células-tronco pluripotentes induzidas humanas sob condições quimicamente definidas

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Tecido conjuntivo de engenharia humana derivada do fibroblasto para aplicações de triagem

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...