Name: generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells
Uploaded: 2023-01-20T13:35:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Мы благодарим всех сотрудников наших лабораторий за критический вклад и обсуждения. JMP получила финансирование от Фонда Т. фон Застрова, премию FWF Витгенштейна (Z 271-B19), Австрийскую академию наук, совместное предприятие Innovative Medicines Initiative 2 (JU) в рамках грантового соглашения No 101005026, Leducq Transatlantic Networks of Excellence in Cardiovascular Research, Программу выдающихся исследователей Института Аллена и Канадскую программу 150 исследовательских кафедр F18-01336, а также гранты Канадских институтов исследований в области здравоохранения COVID-19 F20-02343 и F20-02015.

<ol>
	<li>Okwuosa, I. S., Lewsey, S. C., Adesiyun, T., Blumenthal, R. S., Yancy, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+disparities+in+cardiovascular+disease:+Challenges+and+solutions.">Worldwide disparities in cardiovascular disease: Challenges and solutions.</a> International Journal of Cardiology. 202, 433-440 (2016).</li><li>Page, R. L., Ghushchyan, V., Nair, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+to+action:+Responding+to+the+future+forecasting+of+cardiovascular+disease+in+America.">A call to action: Responding to the future forecasting of cardiovascular disease in America.</a> American Health &amp; Drug Benefits. 4 (5), 280-288 (2011).</li><li>Ferrara, N., Davis-Smyth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+vascular+endothelial+growth+factor.">The biology of vascular endothelial growth factor.</a> Endocrine Reviews. 18 (1), 4-25 (1997).</li><li>Ishitobi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flk1-GFP+BAC+Tg+mice:+An+animal+model+for+the+study+of+blood+vessel+development.">Flk1-GFP BAC Tg mice: An animal model for the study of blood vessel development.</a> Experimental Animals. 59 (5), 615-622 (2010).</li><li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells,+pericytes+and+astrocytes.">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+creating+tissue-engineered+biomimetic+blood+vessels+using+3D+bioprinting+technology.">A novel strategy for creating tissue-engineered biomimetic blood vessels using 3D bioprinting technology.</a> Materials. 11 (9), 1581 (2018).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Wimmer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+blood+vessel+organoids+as+a+model+of+diabetic+vasculopathy.">Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy.</a> Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).</li><li>Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+arteries+to+capillaries:+Approaches+to+engineering+human+vasculature.">From arteries to capillaries: Approaches to engineering human vasculature.</a> Advanced Functional Materials. 30 (37), 1910811 (2020).</li><li>Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+blood+vessel+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (11), 3082-3100 (2019).</li><li>Monteil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+SARS-CoV-2+infections+in+engineered+human+tissues+using+clinical-grade+soluble+human+ACE2.">Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2.</a> Cell. 181 (4), 905-913 (2020).</li><li>Patsch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=generation+of+vascular+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).</li><li>Bruveris, F. F., Ng, E. S., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF,+FGF2,+and+BMP4+regulate+transitions+of+mesoderm+to+endothelium+and+blood+cells+in+a+human+model+of+yolk+sac+hematopoiesis.">VEGF, FGF2, and BMP4 regulate transitions of mesoderm to endothelium and blood cells in a human model of yolk sac hematopoiesis.</a> Experimental Hematology. 103, 30-39 (2021).</li><li>Julian, L., Olson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+coiled-coil+containing+kinases+(ROCK):+Structure,+regulation,+and+functions.">Rho-associated coiled-coil containing kinases (ROCK): Structure, regulation, and functions.</a> Small GTPases. 5, 29846 (2014).</li><li>Anitua, E., Prado, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+reproducibility+in+stem+cell+and+PRP+therapies.">Addressing reproducibility in stem cell and PRP therapies.</a> Trends in Biotechnology. 37 (4), 340-344 (2019).</li><li>McMurtrey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytic+models+of+oxygen+and+nutrient+diffusion,+metabolism+dynamics,+and+architecture+optimization+in+three-dimensional+tissue+constructs+with+applications+and+insights+in+cerebral+organoids.">Analytic models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).</li><li>McKeown, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+normoxia,+physoxia+and+hypoxia+in+tumours-Implications+for+treatment+response.">Defining normoxia, physoxia and hypoxia in tumours-Implications for treatment response.</a> The British Journal of Radiology. 87 (1035), 20130676 (2014).</li><li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy.">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> British Journal of Cancer. 9 (4), 539-549 (1955).</li><li>Olive, P. L., Vikse, C., Trotter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxygen+diffusion+distance+in+tumor+cubes+using+a+fluorescent+hypoxia+probe.">Measurement of oxygen diffusion distance in tumor cubes using a fluorescent hypoxia probe.</a> International Journal of Radiation Oncology. 22 (3), 397-402 (1992).</li><li>Torres Filho, I. P., Leunig, M., Yuan, F., Intaglietta, M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+microvascular+and+interstitial+oxygen+profiles+in+a+human+tumor+in+SCID+mice.">Noninvasive measurement of microvascular and interstitial oxygen profiles in a human tumor in SCID mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2081-2085 (1994).</li><li>Lanzen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+demonstration+of+instabilities+in+oxygen+concentrations+within+the+extravascular+compartment+of+an+experimental+tumor.">Direct demonstration of instabilities in oxygen concentrations within the extravascular compartment of an experimental tumor.</a> Cancer Research. 66 (4), 2219-2223 (2006).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible,+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS One. 3 (2), 1565 (2008).</li><li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=generation+of+vascularized+brain+organoids+to+study+neurovascular+interactions.">generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions.</a> eLife. 11, 76707 (2022).</li></ol>

Нет никакой связи между финансовыми интересами авторов и представляемым исследованием. Технология органоидов кровеносных сосудов была лицензирована компанией Stemcell Technologies. J.M.P. является основателем и акционером компании Angios Biotech, которая разрабатывает органоиды кровеносных сосудов в качестве терапии трансплантации сосудов. Заявка на патент, относящаяся к этой работе, была подана под патентом. US20200199541A1, перечисляя Райнера А. Виммера, Йозефа М. Пеннингера и Дончо Керьяшки в качестве изобретателей.

Недавние прорывы в органоидных культурах, полученных из стволовых клеток, обеспечили основу для более продвинутых и физиологически значимых моделей сосудистой сети человека. Представленная здесь модель органоида кровеносных сосудов человека (hBVO), разработанная в нашей лаборатории 8,10, предоставляет мощные средства для изучения не только дальнейших аспектов васкулогенеза человека, но и новых путей моделирования заболеваний и регенеративной терапии 8,10,11. Несколько моделей in vivo были использованы для изучения развития и созревания кровеносных сосудов, сосудистых заболеваний и эндотелиальной дисфункции 3,4. Различные подходы объединяют одиночные и множественные клетки, определенные по происхождению, либо полученные из стволовых клеток, либо выделенные из взрослых тканей in vivo, для создания репликативных сосудистых сетей человека 5,6. Представленный здесь протокол использует принцип биологии развития и самоорганизации, чтобы получить первые в истории сети кровеносных сосудов человека с несколькими клетками, которые могут быть созданы, по сути, из одного hPSC 8,10.
Каждая линия стволовых клеток имеет уникальный генетический состав и отличается от других с точки зрения источника, функции и чувствительности15. Таким образом, протокол для органоидов кровеносных сосудов человека (hBVO) был разработан и оптимизирован для обеспечения надежной и воспроизводимой совместимости протокола с несколькими (>12) различными линиями hPSC 8,10. Описанный здесь метод генерирует органоиды кровеносных сосудов, полученные из hPSC, в течение 2 недель. Однако изменения в составе среды и/или методах генерации hBVO могут привести к неэффективной сети сосудов и генерации органоидов. Различные скорости пролиферации отдельных линий стволовых клеток также заметно влияют на воспроизводимость экспериментов со стволовыми клетками15 и, следовательно, органоидных культур. Например, при генерации BVO большее количество пролиферативных клеток или большее количество крупных агрегатов 1-го дня по своей природе подвержены различным метаболическим средам и параметрам диффузии газов и питательных веществ. Это, в свою очередь, изменяет время и эффективность воздействия фактора роста, степень дифференцировки и прайминга сосудов и, самое главное, способность образовывать сосудистые сети при встраивании агрегатов в коллаген 1 и солюбилизированный матрикс базальной мембраны.
Пассивная диффузия кислорода и введение необходимых питательных веществ из внешней среды не идеальны для долгосрочного роста клеток 3D-органоидов и морфогенеза тканей in vitro16. Несмотря на то, что это зависит от нескольких факторов (т.е. скорости метаболизма в тканях, биодоступности питательных веществ и газов, статической или динамической среды), для тканей, культивируемых in vitro, был установлен общий предел диффузии 150 мкм O2 и питательных веществ, учитывая, что физиологически ткани человека представляют собой связки живых клеток в пределах 150 мкм от перфузированных кровеносных сосудов17. Хотя также были предложены эффективные расстояния диффузии газа и питательных веществ 70-200 мкм18,19,20,21, плотность конструкции, температура, рН и состав среды значительно влияют на эффективность диффузии. Благодаря оптимизации площади поверхности и коммуникации интегрин-бета-рецептора после встраивания на 6-й день агрегаты диаметром 250-300 мкм работают лучше, чем агрегаты диаметром >500-600 мкм, что приводит к полному процессу прорастания сосуда и минимально конденсированному органоидному ядру. Таким образом, размер агрегата имеет решающее значение и может зависеть как от количества ячеек, используемых во время первоначального посева, так и от времени, отведенного на формирование агрегата. Пластины с микролунками, которые позволяют контролировать размер заполнителя и номер22, являются жизнеспособной альтернативой методу формирования стохастических заполнителей, полученному в результате использования 6-луночных планшетов со сверхнизким креплением в этом протоколе. Последовательность в сроках и управлении размерами агрегатов в течение первых 6 дней протокола hBVO является одним из, если не самым важным, показателем успешного развития добросовестных органоидов кровеносных сосудов.
Изменения среды на 1-й день (индукция мезодермы) и на 4-й день (сосудистая индукция) должны быть завершены в сочетании с оседанием агрегатов. Хотя центрифугирование является заманчивой альтернативой, дополнительные силы, приложенные к слабо собранным агрегатам, могут вызвать нежелательное слипание, сборку и сдвиг, что отрицательно влияет на дифференциацию, созревание и эффективность прорастания на более поздних стадиях протокола. Работа на льду в течение 6-го дня процесса встраивания имеет решающее значение для сохранения правильной полимеризации ECM и формирования слоя. Во время индукции заделки и прорастания заполнителя воздействие на ЭБМ температур выше 4°С и/или рН ЭБМ, отличный от 7,4, повлияет не только на скорость полимеризации и целостность слоя ЭКМ, но и на эффективность прорастания встроенных заполнителей. Эластичная природа матрицы для проращивания ECM позволяет легко отсоединять и транспортировать из 12-луночной чашки для культивирования на стерильную режущую поверхность. Отдельные органоиды, удаленные из матрицы и перенесенные на 96-луночные пластины со сверхнизким прикреплением, будут потреблять оставшуюся окружающую ECM и сохранять самоорганизующиеся сети эндотелиальных микрососудов, покрытые клетками, с непрерывной базальной мембраной.
Хотя это предложение не охвачено этим предложением, изменения в составах сред могут воспроизводить заболевания, которые, в свою очередь, провоцируют патологические реакции в hBVOs 8,11. Границы моделирования заболеваний с использованием системы hBVO далеко не известны, и это, безусловно, область, которая нуждается в исследовании. Применение нашей технологии органоидов кровеносных сосудов в васкуляризации ранее аваскулярных органоидных конструкций23 также имеет значительное влияние и интерес.

Сосудистая дисфункция и заболевания кровеносных сосудов проявляются выраженными осложнениями в функциях органов. Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смерти во всеммире1, а также основным фактором, способствующим увеличению расходов на здравоохранение в Соединенных Штатах. Число случаев сердечно-сосудистых заболеваний ежегодно увеличивается, и рост числа этих случаев происходит в более молодых возрастных группах (20-45 лет)2. Было разработано несколько моделей in vivo для изучения развития и созревания кровеносных сосудов, сосудистых заболеваний и эндотелиальной дисфункции 3,4. В настоящее время методы, объединяющие одиночные и множественные клетки, определенные по происхождению, полученные из стволовых клеток или выделенные из тканей взрослого человека in vivo, могут создавать сосудистые сети, которые воспроизводят аспекты сосудистой функции и анатомии человека 5,6. Кровеносные сосуды возникли как одна из первых функциональных систем во время развития мезодермы, и они организуются либо посредством процесса сборки, называемого «васкулогенезом», либо путем расширения и разветвления от ранее существовавших сосудов, что называется «ангиогенезом»7.
Используя возможности биологии развития и самоуправляемой сборки, Wimmer et al. сообщили о первых самоорганизующихся 3D-органоидах кровеносных сосудов человека из hPSC, которые демонстрируют функциональные, морфологические и молекулярные характеристики микроциркуляторного русла человека8. Подобно сосудистой сетичеловека 9, эти hBVO генерируются и присутствуют эндотелием, непрерывной базальной мембраной и окружающими клетками 8,10. hBVO могут быть трансплантированы in vivo и анастомозированы эндогенным кровообращением. Они также могут подвергаться созреванию in vitro и служить моделями сердечно-сосудистых заболеваний (например, диабета)8 или тканевого тропизма при вирусных инфекциях, таких как SARS-CoV-211. Несмотря на то, что ранее мы опубликовали письменный протокол10, не существует доступного видеопротокола для этого сложного метода.
Благодаря краткой ступенчатой прогрессии образование hBVO осуществляется путем формирования агрегатов, индукции мезодермы с использованием агониста WNT, Chiron (CHIR99021) и костного морфогенного белка - 4 (BMP4)12,13, сосудистой индукции с помощью фактора роста эндотелия сосудов A (VEGFA) и Forskolin (Fors)12 и встраивания в пользовательскую матрицупрорастания 8,10. Созревание сосудов и образование сетки следуют за встраиванием агрегатов в прорастающую матрицу. Эти сети сосудов человека формируются в течение 2-3 недель и могут быть удалены из матрицы прорастания и далее выращиваться в масштабируемых системах культивирования до 6 месяцев. Здесь проводятся процедуры под оптическим контролем для формирования и применения сосудистой сети, полученной из стволовых клеток человека.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% sodium bicarbonate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell dissociation reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1391, 0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-rabbit IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-546-152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-sheep IgG</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647&#8211;anti-goat IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-606-147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Faster</td>
			<td></td>
			<td>SafeFAST Premium 212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-111-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF806</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td>Multifuge 4 KR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td></td>
			<td>Galaxy 170S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Basement membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (22 x 50 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3&#8211;anti-mouse IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-166-150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modefied Eagle&#39;s Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648-10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovien Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-093-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Heraguard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted contrasting tissue culture microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Vert.A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer&#160;</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>IS009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-essential amino acids (NEAAs)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (4%) in PBS</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BM-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3169S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips (6.5-10)</td>
			<td>Mquant, Millipore</td>
			<td>109543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (P1000, P200 and P20)</td>
			<td>Gilson, Integra Pipetboy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime Surface-U 96-well plates&#160;</td>
			<td>Sumilon</td>
			<td>MS9096-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PurCol&#160;</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS gel</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS mounting solution</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5, 10 and 25 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357529, 357530, 357515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>vSMC/Pericyte</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2547</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel micro spatula (rounded end)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel spoon (double-ended)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BelArt H367290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemflex medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>stem cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10639011</td>
			<td>flexible serum-free medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 &#956;L)</td>
			<td>Biozym, Surphob</td>
			<td>VT0270, VT0250, VT0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 12-well plates TC&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 6-well plates&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30720113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>mammalian cell dissociating enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low-attachment 6-well plates</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Isotemp 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>688000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells

Органоид определяется как сконструированная многоклеточная ткань in vitro , которая имитирует соответствующий орган in vivo , так что ее можно использовать для изучения определенных аспектов этого органа в чашке для культивирования тканей. Широта и применение исследований органоидов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC), значительно продвинулись вперед и включают мозг, сетчатку, слезный проток, сердце, легкие, кишечник, поджелудочную железу, почки и кровеносные сосуды, а также ряд других тканей. В частности, разработка методов генерации микрососудов человека открыла путь для моделирования развития кровеносных сосудов человека и заболеваний in vitro , а также для тестирования и анализа новых лекарств или тканевого тропизма при вирусных инфекциях, включая SARS-CoV-2. Сложные и длинные протоколы, лишенные визуального руководства, препятствуют воспроизводимости многих органоидов, полученных из стволовых клеток. Кроме того, неотъемлемая стохастичность процессов формирования органоидов и самоорганизации требует создания оптических протоколов для углубления понимания приобретения и программирования клеточной судьбы. Здесь представлен визуально управляемый протокол для генерации 3D-органоидов кровеносных сосудов человека (BVO), разработанных из hPSC. Представляя непрерывную базальную мембрану, эндотелиальные клетки сосудов и организованное сочленение с клетками фрески, BVO демонстрируют функциональные, морфологические и молекулярные особенности микроциркуляторного русла человека. Образование BVO инициируется путем образования агрегатов, за которым следует мезодерма и сосудистая индукция. Созревание сосудов и формирование сети инициируются и поддерживаются путем встраивания агрегатов в 3D-коллагеновую и солюбилизированную матрицу базальной мембраны. Сети сосудов человека формируются в течение 2-3 недель и могут быть дополнительно выращены в масштабируемых системах культивирования. Важно отметить, что BVO, трансплантированные мышам с ослабленным иммунитетом, анастомозируют эндогенное кровообращение мыши и попадают в функциональные артерии, вены и артериолы. Настоящий визуально управляемый протокол будет способствовать исследованиям органоидов человека, особенно в отношении кровеносных сосудов в нормальном развитии, васкуляризации тканей и заболеваний.

Этапы, описанные в этом протоколе, были разработаны специально для получения контролируемого и точного метода генерации органоидов кровеносных сосудов человека из hPSCs. Генерация агрегатов диаметром 30-100 мкм из культур hPSC знаменует собой отправную точку протокола (рис. 1, рис. 2B). Агрегаты проходят ступенчатую индукцию к мезодерме (1-4-й день) и сосудистым линиям (4-6-й день) до встраивания (6-й день) (рис. 2A-D), что необходимо для формирования сосудистой сети. Почти радиально-симметричное прорастание сосудов должно быть видно d7 или d8 (рис. 2E) и продолжаться до d10 (рис. 2F, G). Эксплантация hBVO из ECM в 96-луночные пластины со сверхнизким креплением снижает хрупкость прорастающих сетей и позволяет продолжать обслуживание в условиях суспензионной культуры (рис. 2H) до 6 месяцев. К d15 hBVO демонстрируют обширную и связанную эндотелиальную (CD31+) сеть, окруженную перицитами (PDGFR-ß+) и актином гладких мышц (SMA+) (рис. 3A-D). Непрерывная базальная мембрана коллагена IV (ColIV+) окутывает сосудистые сети (рис. 3E). Эндотелиальные клетки (CD31+, VE-кадгерин+) и перициты (PDGFR-ß+) составляют приблизительно 30%-35% и 60%-65% популяций органоидных клеток, соответственно8. Активное прорастание сосудов происходит под руководством эндогенно организованной популяции верхушечных клеток (CD31+), которая имеет типичную морфологию верхушечных клеток, такую как чрезмерная филиподия 8,10. Представление фресочных клеток PDGFR-ß+ и SMA+, инкапсулирующих сети эндотелиальных сосудов, можно увидеть на d15 процесса созревания органоидов (рис. 3A, C). После удаления из ECM и созревания в культуре суспензии (т.е. d15) hBVO пригодны для соответствующих анализов или трансплантации под капсулу почки мыши.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig01.jpg"> Рисунок 1: Схема протокола hBVO с указанием времени и ступенчатой прогрессии. Из, казалось бы, однородных культур hPSC или hiPSC происходит образование агрегатов в присутствии ингибитора Rho-киназы Y27632. BMP4 и CHiR-дополненная среда используется для инструктажа агрегатов к мезодермальной судьбе. Индукционная среда мезодермы заменяется средой с добавлением VEGFA и форсколина, чтобы стимулировать агрегаты к сосудистой линии. Механические и химические очереди, достигаемые за счет встраивания агрегатов в коллаген I и солюбилизированный матрикс базальной мембраны и воздействия среды, содержащей VEGFA и FGF2, приводят к почти радиально-симметричному прорастанию сосудов из тела агрегата. Образующиеся сосудистые сети могут быть удалены из коллагена I и солюбилизированной базальной мембраны и помещены в суспензионную культуру для дальнейшего созревания, анализа или трансплантации in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig02.jpg"> Рисунок 2: Ступенчатая прогрессия генерации hBVO, захваченная светлым полем. (A) Типичная морфология колоний hPSC (H9) в день −1. (B) Генерация агрегатов hPSC (день 0) на 6-луночных пластинах со сверхнизким креплением в присутствии Y-27632. (C) Мезодермальная индукция агрегатов с использованием среды с добавлением BMP4 и ChiR (день 1). Также можно наблюдать незначительные изменения в размере и форме агрегата. (D) Агрегаты 4-го дня, подготовленные к сосудистой линии с использованием VEGFA и среды, дополненной форсколином. (E) Раннее прорастание сосудов на 7-й день, через день после встраивания агрегатов в матрицу прорастания и воздействия среды для прорастания с добавлением VEGFA и FGF2 (день 7). (F) Здоровая морфология органоидов и продолжение прорастания сосудов на 9-й день. (G) Прорастание сосуда на поздней стадии на 10-й день. В идеале плотные клеточные структуры в органоидном центре к этому времени исчезнут. (H) Типичная морфология зрелых (15-й день) органоидов кровеносных сосудов человека. Удаление окружающей матрицы путем разрезания и созревания в 96-луночных культуральных пластинах со сверхнизким прикреплением формирует органоиды сферически, а сосудистые сети размещаются внутри. Масштабные линейки: (A, B, E, F) 250 мкм; (C,D) 500 мкм; (G,H) 200 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig03.jpg"> Рисунок 3: Окрашивание зрелых (15-й день) органоидов кровеносных сосудов человека. (A) Презентация зрелых (15-й день) органоидов кровеносных сосудов человека с самоорганизующимися эндотелиальными (CD31+, пурпурные) сетями и окружающим перицитами (PDGFR-β+, голубой) и альфа-гладкими мышцами (SMA+, желтый) покрытием. (B) Более высокое увеличение A, детализирующее SMA+ (желтый) и PDGFR-β+ (голубой) экспрессию сосудистых сетей. (C) Подробное представление об эндотелиальном (CD31+, пурпурный), перицитарном (PDGFR-β+, голубой) и альфа-гладкомышечном актине (SMA+, желтый) взаимодействии. (D) Окрашивание эндотелия сосудов (CD31+, пурпурный) и гладких мышц (SMA+, желтый) в поперечном сечении (слева) и более высокое увеличение (справа) зрелых органоидов кровеносных сосудов. (E) Самонаправленное формирование сосудистой базальной мембраны (Col IV+, оттенки серого) за счет тесной ассоциации клеток фрески и эндотелиальных трубок. Масштабные линейки: (A,D[слева]) 100 мкм; (B,D[справа],E) 25 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Этот протокол описывает генерацию самоорганизующихся кровеносных сосудов из плюрипотентных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Эти сети кровеносных сосудов демонстрируют обширную и связанную эндотелиальную сеть, окруженную перицитами, актином гладких мышц и непрерывной базальной мембраной.

Генерация органоидов кровеносных сосудов человека из плюрипотентных стволовых клеток

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

В этом протоколе описывается наше поколение органоидов кровеносных сосудов человека из плюрипотентных стволовых клеток. Эта технология может быть использована для изучения аспектов васкулогенеза, ангиогенеза, сосудистых заболеваний, а также сосудистых патологий. Воспроизводимость и высокая пропускная способность, а также его постоянство во многих различных линиях стволовых клеток являются сильными преимуществами этого метода.Что касается их применения, некоторые из наших предыдущих исследований описывают использование органоидов кровеносных сосудов для изучения морфологических изменений сосудистой сети пациентов с диабетом и исследуют возможности медикаментозного лечения диабетической васкулопатии. Правильное поддержание исходной популяции стволовых клеток, предотвращение слипания агрегатов и обеспечение почти однородного диаметра агрегата - это важные факторы для создания хороших органоидов кровеносных сосудов. Начните генерацию агрегатов с использованием культивируемых плюрипотентных стволовых клеток человека или hPSCs, имеющих 70% слияние.Используя пипетку или вакуумную систему, аспирируйте питательную среду и замените ее одним миллилитром реагента для диссоциации клеток, прежде чем инкубировать клетки в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия. Тем временем подготовьте необходимый объем агрегационной среды в конической трубке объемом 15 миллилитров, следуя рецептуре, указанной в текстовой рукописи. После инкубации клеток аспирируют реагент диссоциации клеток, прежде чем суспендировать клетки в одном миллилитре агрегационной среды.Аккуратно пипеткой нанесите содержимое вверх и вниз, чтобы создать одноклеточную суспензию. Подсчитайте клетки с помощью автоматического устройства для подсчета клеток или под микроскопом и рассчитайте общее количество клеток, необходимых для образования агрегатов. Показания жизнеспособности клеток показывают одноклеточную суспензию с низким уровнем кластеров или без них.Аспирируйте надосадочную жидкость из трубки и добавьте соответствующий объем клеточной суспензии в агрегационную среду в 15-миллилитровой полипропиленовой конической трубке высокой прозрачности и осторожно пипеткой разбавленную клеточную суспензию вверх и вниз, чтобы обеспечить однородное распределение клеток. Пипеткой вводят три миллилитра разбавленной клеточной суспензии в каждую желаемую лунку шестилуночной пластины для культивирования со сверхнизким прикреплением. Поместите тарелку в инкубатор и сведите к минимуму любые помехи, чтобы сохранить размер и форму агрегатов.Подготовьте мезодерму, как описано в текстовой рукописи. Через 24 часа после посева клеток достаньте культуральную тарелку из инкубатора. Вращайте пластину круговыми движениями, чтобы накопить заполнители в центре каждой лунки.С помощью пипетки объемом один миллилитр аккуратно перенесите агрегаты со средой из каждой лунки в соответствующую коническую трубку. Дайте заполнителям осаждаться в конических трубах при комнатной температуре в течение одного часа. После осаждения аспирируйте надосадочную жидкость пипеткой или высокочувствительным аспирационным насосом осторожно, не нарушая осевшие агрегаты.Ресуспендируйте агрегаты в каждой пробирке, добавив два миллилитра среды для индукции мезодермы. Затем перенесите суспензию из каждой трубки обратно в соответствующую лунку шестилуночной культуральной пластины со сверхнизкой насадкой. Поместите тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и оставьте до четвертого дня.На четвертый день выньте культуральную тарелку из инкубатора, затем встряхните пластину круговыми движениями, чтобы собрать агрегаты в центре каждой лунки. С помощью одномиллилитровой пипетки аккуратно перенесите агрегаты с окружающей средой из каждой лунки в соответствующую коническую трубку. Установите таймер на 30 минут, чтобы заполнители оседали в пробирках.Как только агрегаты осядут, подготовьте культуральные пластины, как показано ранее, и поместите их в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия до шестого дня. Для заделки агрегата и индукции ростков сосудов приготовьте желаемый конечный объем раствора внеклеточного матрикса во время работы на льду. Пипетка 500 микролитров ECM в одну лунку 12-луночной пластины, чтобы сформировать первый слой сэндвича ECM.Чтобы обеспечить эффективную полимеризацию первого слоя ECM, поместите планшет в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на два часа. Ближе к концу двухчасовой инкубации начинайте работать с агрегатами в культуральной тарелке. Соберите заполнители в центре каждой лунки, прежде чем использовать пипетку объемом один миллилитр, чтобы аккуратно перенести заполнители и среду из каждой лунки в соответствующую коническую трубку объемом 15 миллилитров.Дайте агрегатам отстояться в течение 10-15 минут перед аспирацией надосадочной жидкости. После этого держите конические трубки, содержащие заполнители, на льду в течение пяти минут. Работая быстро и осторожно, ресуспендируйте агрегаты в 500 микролитрах ECM без образования пузырьков.С помощью пипетки нанесите суспензию агрегата ECM поверх уже полимеризованного первого слоя ECM внутри скважины в 12-луночном планшете. Тем временем подготовьте среду для проращивания, как описано в рукописи текста. После двух часов инкубации при температуре 37 градусов по Цельсию добавьте в лунку один миллилитр проращивающей среды, предварительно нагретой до 37 градусов по Цельсию, чтобы вызвать дифференциацию кровеносных сосудов.Работая в стерильных условиях, используйте закругленный конец стерильного шпателя, чтобы ослабить матрицу прорастания ECM, содержащую сосудистые сети. Затем стерильными щипцами и закругленным концом стерильного шпателя аккуратно перенесите разрыхленный гелевый диск на крышку 10-сантиметровой чашки для культуры. Поместите гель на крышку под стереомикроскоп, настроенный на желаемое увеличение и фокусировку, и используйте стерильные иглы, чтобы вырезать отдельные сети кровеносных сосудов, пытаясь ограничить количество неваскуляризированного ECM, полученного в процессе.Аккуратно перенесите изолированные органоиды обратно в одну лунку шестилуночной пластины со сверхнизкой насадкой, содержащей три миллилитра прорастающей среды. Затем, используя пипетку объемом в один миллилитр, перенесите отдельные органоиды в соответствующее количество лунок в пластину со сверхнизкой насадкой на 96 лунок. После переноса добавьте 200 микролитров предварительно подогретой среды для проращивания в каждую лунку 96-луночной пластины.Через четыре-шесть дней после изоляции в 96-луночном планшете убедитесь, что органоиды обладают круглой и здоровой морфологией, прежде чем приступать к их фиксации и окрашиванию. Изображения ступенчатой прогрессии генерации органоида кровеносных сосудов человека, или hBVO, из hPSCs были получены в светлом поле. На нулевой день из культуры hPSC были получены агрегаты диаметром от 30 до 100 микрон.Тонкие изменения в размере и форме агрегатов наблюдались при индукции мезодермы в первый день, которые еще больше изменились на четвертый день, когда агрегаты подверглись сосудистому праймингу. Почти радиально-симметричное раннее прорастание сосудов можно наблюдать на седьмой день, через день после встраивания агрегатов в матрицу прорастания. Здоровая морфология органоидов и продолжающееся прорастание сосудов наблюдались на девятый день, которые прогрессировали до прорастания сосудов на поздней стадии к 10-му дню, когда плотные клеточные структуры в органоидном центре почти исчезли.Морфология, типичная для зрелых органоидов кровеносных сосудов человека, отчетливо наблюдалась к 15-му дню. Окрашивание зрелых hBVO на 15-й день показало обширную и связанную эндотелиальную сеть, которая была CD31-положительной и окруженной PDGFR-бета-положительными паразитами и SMA-положительным альфа-гладкомышечным актином. PDGFR-бета-положительные и SMA-положительные фресочные клетки, инкапсулирующие сети эндотелиальных сосудов, хорошо наблюдаются.Также наблюдалась непрерывная коллагеновая IV-положительная базальная мембрана, обволакивающая сосудистые сети. Обеспечение надлежащей полимеризации внеклеточного матрикса на этапе встраивания имеет решающее значение для эффективного прорастания кровеносных сосудов. Исследователи использовали нашу технологию органоидов кровеносных сосудов для создания ранних сосудистых компартментов в уже установленных органоидных моделях, таких как мозг и почки, которые ранее были аваскулярными.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Развитие, расширение и<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Контроль за соблюдением NK-клетки из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Трансплантация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных Мезоангиобласт-как миогенные прогениторы в мышиных моделях мышечной регенерации

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Эффективное создание и редактирование фидер свободный IPSCs от человеческих клеток поджелудочной железы, с использованием системы ТРИФОСФАТЫ Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Изоляция взрослых человека дермальных фибробластов от кожи брюшной полости и поколение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием неинтегрирующего метода

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Масштабируемое поколение зрелых мозжечковых органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека и характеристика иммуностимулированием

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Управляемая дифференцировка зрелых почечных подоцитов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток в химически определенных условиях

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Измерение потенциала оптического действия одной клетки в кардиомиоцитах, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Фибробласт, полученный из искусственной соединительной ткани человека для скрининга

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...