Name: generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells
Uploaded: 2023-01-20T13:35:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Agradecemos a todos los miembros de nuestros laboratorios por sus aportes y discusiones críticas. JMP recibió fondos de la fundación T. von Zastrow, el premio FWF Wittgenstein (Z 271-B19), la Academia Austriaca de Ciencias, la Empresa Común (JU) de la Iniciativa de Medicamentos Innovadores 2 (JU) en virtud del acuerdo de subvención No 101005026, Leducq Transatlantic Networks of Excellence in Cardiovascular Research, Allen Institute Distinguished Investigator Program y Canada 150 Research Chairs Program F18-01336, así como las subvenciones COVID-19 de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud F20-02343 y F20-02015.

<ol>
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No existe relación entre los intereses financieros de los autores y la investigación presentada. La tecnología de organoides de vasos sanguíneos ha sido licenciada a Stemcell Technologies. J.M.P. es fundador y accionista de Angios Biotech que desarrolla organoides de vasos sanguíneos como terapia de trasplante vascular. Se ha presentado una solicitud de patente relacionada con este trabajo bajo el número de Pat. US20200199541A1, enumerando a Reiner A. Wimmer, Josef M. Penninger y Dontscho Kerjaschki como inventores.

Los avances recientes en cultivos de organoides derivados de células madre han proporcionado el marco para modelos más avanzados y fisiológicamente relevantes de vasculatura humana. El modelo de organoide de vasos sanguíneos humanos (hBVO) presentado aquí, desarrollado en nuestro laboratorio 8,10, proporciona un medio poderoso para explorar no solo otros aspectos de la vasculogénesis humana, sino también nuevas vías de modelado de enfermedades y terapia regenerativa 8,10,11. Se han empleado múltiples modelos in vivo para explorar el desarrollo y la maduración de los vasos sanguíneos, la enfermedad vascular y la disfunción endotelial 3,4. Diversos enfoques combinan células definidas por linaje único y múltiple, ya sea derivadas de células madre o aisladas de tejidos adultos in vivo para crear redes vasculares humanas replicativas 5,6. El protocolo presentado aquí aprovecha el principio de la biología del desarrollo y la autoorganización para producir las primeras redes de vasos sanguíneos humanos de linaje multicelular que se pueden generar, en esencia, a partir de un solo hPSC 8,10.
Cada línea de células madre tiene una composición genética única y difiere de otras en términos de su origen, función y capacidad de respuesta15. Por lo tanto, el protocolo para organoides de vasos sanguíneos humanos (hBVO) se desarrolló y optimizó para garantizar una compatibilidad de protocolo robusta y reproducible con múltiples (>12) líneas diferentes de hPSC 8,10. El método descrito aquí genera organoides de vasos sanguíneos derivados de hPSC durante 2 semanas. Sin embargo, los cambios en la composición de los medios y/o las técnicas en la generación de hBVO pueden conducir a una red de vasos y generación de organoides ineficaces. Las diferentes tasas de proliferación de líneas individuales de células madre también afectan notablemente la reproducibilidad de la experimentación con células madre15 y, por lo tanto, de los cultivos de organoides. Por ejemplo, al generar los BVO, las células más proliferativas o un mayor número de agregados grandes del día 1 están inherentemente sujetos a diferentes entornos metabólicos y parámetros de difusión de gases y nutrientes. Esto, a su vez, cambia los tiempos de exposición y las eficiencias del factor de crecimiento, el grado de diferenciación y cebado vascular y, lo más importante, la capacidad de formar redes de vasos al incrustar los agregados en el colágeno 1 y la matriz de membrana basal solubilizada.
La difusión pasiva de oxígeno y la administración de nutrientes esenciales de un ambiente externo no es ideal para el crecimiento celular a largo plazo de organoides 3D y la morfogénesis tisular in vitro16. Aunque depende de varios factores (es decir, la tasa metabólica tisular, la biodisponibilidad de nutrientes y gases, un ambiente estático o dinámico), se ha establecido un límite general de 150 μm O2 y difusión de nutrientes para tejidos cultivados in vitro, considerando que, fisiológicamente, los tejidos humanos presentan cordones de células vivas dentro de los 150 μm de los vasos sanguíneos perfundidos17. Aunque también se han propuesto distancias efectivas de difusión de gases y nutrientes de 70-200 μm18,19,20,21, la densidad de constructo, la temperatura, el pH y la composición del medio afectan significativamente la eficacia de la difusión. Debido a la optimización del área superficial y la comunicación del receptor de integrina-beta después de la incrustación del día 6, los agregados de 250-300 μm de diámetro funcionan mejor que los de >500-600 μm de diámetro, lo que resulta en un proceso completo de brotación del vaso y un núcleo organoide mínimamente condensado. Por lo tanto, el tamaño del agregado es crucial y puede verse afectado tanto por el número de celdas utilizadas durante la siembra inicial como por el tiempo asignado para la formación del agregado. Las placas de micropocillos que permiten el control sobre el tamaño del agregado y el número22 son una alternativa viable a la técnica de formación de agregados estocástica resultante del uso de placas de 6 pocillos de unión ultra baja en este protocolo. La consistencia en el tiempo y la gestión de los tamaños agregados durante los primeros 6 días del protocolo hBVO es uno de, si no el más, indicadores cruciales para desarrollar con éxito organoides de vasos sanguíneos de buena fe.
Los cambios medios en el día 1 (inducción del mesodermo) y el día 4 (inducción vascular) deben completarse en combinación con la sedimentación de los agregados. Aunque la centrifugación es una alternativa tentadora, las fuerzas adicionales aplicadas a los aggerados débilmente ensamblados pueden causar aglutinación, ensamblaje y cizallamiento no deseados, lo que afecta negativamente la diferenciación, la maduración y la eficacia de la brotación en las etapas posteriores del protocolo. Trabajar en hielo durante el proceso de incrustación del día 6 es fundamental para preservar la polimerización adecuada de ECM y la formación de capas. Durante la inducción de incrustación y germinación de agregados, la exposición de la ECM a temperaturas superiores a 4 °C y/o un pH de la ECM distinto de 7,4 afectará no solo a las tasas de polimerización y la integridad de la capa de ECM, sino también a la eficiencia de la brotación de los agregados incorporados. La naturaleza elástica de la matriz de germinación ECM permite un fácil desprendimiento y transporte desde la placa de cultivo de 12 pocillos hasta la superficie de corte estéril. Los organoides individuales retirados de la matriz y transferidos a placas de 96 pocillos de fijación ultra baja consumirán la ECM circundante restante y retendrán redes de microvasos endoteliales recubiertos de células murales autoorganizadas con una membrana basal continua.
Aunque no cubiertas en esta propuesta, las alteraciones en las composiciones de los medios pueden replicar enfermedades que, a su vez, provocan respuestas patológicas en hBVOs 8,11. Los límites del modelado de enfermedades utilizando el sistema hBVO están lejos de ser bien conocidos, y esta es ciertamente un área que necesita exploración. La aplicación de nuestra tecnología de organoides de vasos sanguíneos en la vascularización de construcciones de organoides previamente avasculares23 también es de gran impacto e interés.

La disfunción vascular y las enfermedades de los vasos sanguíneos se presentan con complicaciones marcadas en las funciones de los órganos. La enfermedad cardiovascular (ECV) es la principal causa de muerte en todo el mundo1 y también es el principal factor que contribuye al aumento de los costos de atención médica en los Estados Unidos. El número de casos de ECV aumenta anualmente, y el número creciente de estos casos se produce en grupos de edad más jóvenes (20-45 años)2. Se han desarrollado múltiples modelos in vivo para explorar el desarrollo y la maduración de los vasos sanguíneos, la enfermedad vascular y la disfunción endotelial 3,4. Actualmente, los métodos que combinan células definidas por linaje único y múltiple, ya sea derivado de células madre o aisladas de tejidos adultos in vivo, pueden crear redes vasculares que replican aspectos de la función vascular humana y la anatomía 5,6. Los vasos sanguíneos han surgido como uno de los primeros sistemas funcionales durante el desarrollo del mesodermo, y se organizan ya sea a través de un proceso de ensamblaje llamado "vasculogénesis" o por expansión y ramificación de vasos preexistentes, lo que se denomina "angiogénesis"7.
Aprovechando el poder de la biología del desarrollo y el ensamblaje autodirigido, Wimmer et al. reportaron los primeros organoides de vasos sanguíneos humanos 3D autoorganizados a partir de hPSCs que exhiben las características funcionales, morfológicas y moleculares de la microvasculatura humana8. Similar a la vasculatura humana9, estos hBVOs son generados y se presentan con un endotelio, una membrana basal continua y células murales circundantes 8,10. Los hBVOs pueden ser trasplantados in vivo y anastomosados con la circulación endógena. También pueden madurar in vitro y servir como modelos para enfermedades cardiovasculares (es decir, diabetes)8 o tropismo tisular en infecciones virales como el SARS-CoV-211. Si bien anteriormente publicamos un protocolo escrito10, no existe un protocolo de video disponible para esta técnica compleja.
A través de una progresión concisa y gradual, la formación de hBVO se logra a través de la formación de agregados, la inducción del mesodermo utilizando un agonista WNT, quirón (CHIR99021) y proteína morfogénica ósea - 4 (BMP4)12,13, la inducción vascular a través del factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGFA) y la forskoline (Fors)12, y la incrustación en una matriz de germinación personalizada 8,10. La maduración vascular y la formación de redes siguen la incrustación de los agregados en la matriz de brotación. Estas redes de vasos humanos se forman en 2-3 semanas y pueden eliminarse de la matriz de germinación y crecer aún más en sistemas de cultivo escalables durante un máximo de 6 meses. Aquí, se proporcionan procedimientos guiados ópticamente para la formación y aplicación de vasculatura derivada de células madre humanas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M HEPES&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% sodium bicarbonate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>cell dissociation reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin fraction V (BSA)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1391, 0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-rabbit IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-546-152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211;anti-sheep IgG</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647&#8211;anti-goat IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-606-147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Countess II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet&#160;</td>
			<td>Faster</td>
			<td></td>
			<td>SafeFAST Premium 212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-111-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Endothelial cell</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF806</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td>Multifuge 4 KR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td></td>
			<td>Galaxy 170S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Basement membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives)</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SP8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (22 x 50 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3&#8211;anti-mouse IgG (Fab&#8242;)2&#160;fragment</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-166-150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modefied Eagle&#39;s Medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648-10L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovien Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Miltenyi BioTec</td>
			<td>130-093-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Heraguard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted contrasting tissue culture microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Vert.A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacer&#160;</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>IS009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-essential amino acids (NEAAs)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (4%) in PBS</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BM-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFR-&#946;</td>
			<td>Pericyte</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3169S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips (6.5-10)</td>
			<td>Mquant, Millipore</td>
			<td>109543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (P1000, P200 and P20)</td>
			<td>Gilson, Integra Pipetboy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime Surface-U 96-well plates&#160;</td>
			<td>Sumilon</td>
			<td>MS9096-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PurCol&#160;</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS gel</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear CS mounting solution</td>
			<td>SunJinLab</td>
			<td>RCCS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5, 10 and 25 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357529, 357530, 357515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>vSMC/Pericyte</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2547</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel micro spatula (rounded end)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel spoon (double-ended)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BelArt H367290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemflex medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>stem cell culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro-34 SFM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10639011</td>
			<td>flexible serum-free medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 &#956;L)</td>
			<td>Biozym, Surphob</td>
			<td>VT0270, VT0250, VT0220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 12-well plates TC&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 6-well plates&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30720113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td>mammalian cell dissociating enzyme&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low-attachment 6-well plates</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath (37 &#176;C)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Isotemp 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>688000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human blood vessel organoids from pluripotent stem cells

Un organoide se define como un tejido in vitro multicelular diseñado que imita su órgano in vivo correspondiente, de modo que pueda usarse para estudiar aspectos definidos de ese órgano en una placa de cultivo de tejidos. La amplitud y la aplicación de la investigación de organoides derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSC) han avanzado significativamente para incluir el cerebro, la retina, el conducto lagrimal, el corazón, los pulmones, el intestino, el páncreas, el riñón y los vasos sanguíneos, entre varios otros tejidos. El desarrollo de métodos para la generación de microvasos humanos, específicamente, ha abierto el camino para modelar el desarrollo de vasos sanguíneos humanos y la enfermedad in vitro y para la prueba y análisis de nuevos medicamentos o tropismo tisular en infecciones por virus, incluido el SARS-CoV-2. Los protocolos complejos y largos que carecen de orientación visual dificultan la reproducibilidad de muchos organoides derivados de células madre. Además, la estocasticidad inherente de los procesos de formación de organoides y la autoorganización requiere la generación de protocolos ópticos para avanzar en la comprensión de la adquisición y programación del destino celular. Aquí, se presenta un protocolo guiado visualmente para la generación de organoides de vasos sanguíneos humanos (BVO) 3D diseñados a partir de hPSC. Presentando una membrana basal continua, células endoteliales vasculares y articulación organizada con células murales, las BVO exhiben las características funcionales, morfológicas y moleculares de la microvasculatura humana. La formación de BVO se inicia a través de la formación de agregados, seguida de mesodermo e inducción vascular. La maduración vascular y la formación de redes se inician y apoyan mediante la incorporación de agregados en una matriz de membrana basal solubilizada y de colágeno 3D. Las redes de buques humanos se forman en 2-3 semanas y se pueden cultivar aún más en sistemas de cultivo escalables. Es importante destacar que los BVO trasplantados en ratones inmunocomprometidos se anastomosan con la circulación endógena del ratón y se especifican en arterias, venas y arteriolas funcionales. El presente protocolo guiado visualmente avanzará en la investigación de organoides humanos, particularmente en relación con los vasos sanguíneos en desarrollo normal, vascularización de tejidos y enfermedad.

Los pasos descritos en este protocolo se desarrollaron específicamente para producir un método controlado y preciso para la generación de organoides de vasos sanguíneos humanos a partir de hPSC. La generación de agregados de 30-100 μm de diámetro a partir de cultivos de hPSC marca el punto de partida del protocolo (Figura 1, Figura 2B). Los agregados se conducen a través de inducciones escalonadas hacia el mesodermo (día 1-día 4) y linajes vasculares (día 4-día 6) antes de la incrustación (día 6) (Figura 2A-D), que es necesaria para la formación de la red de vasos. La brotación de vasos casi radialmente simétricos debe ser visible por d7 o d8 (Figura 2E) y continuar hasta d10 (Figura 2F, G). La explantación de los hBVO de la ECM a las placas de fijación ultra bajas de 96 pocillos reduce la fragilidad de las redes de germinación y permite un mantenimiento continuo en condiciones de cultivo en suspensión (Figura 2H) durante un máximo de 6 meses. Para d15, los hBVO exhiben una red endotelial extensa y conectada (CD31+) rodeada de pericitos (PDGFR-ß+) y actina del músculo liso (SMA+) (Figura 3A-D). Una membrana basal continua de colágeno IV (ColIV+) envuelve las redes de vasos (Figura 3E). Las células endoteliales (CD31+, VE-Cadherin+) y los pericitos (PDGFR-ß+) comprenden aproximadamente el 30%-35% y el 60%-65% de las poblaciones de células organoides, respectivamente8. La brotación activa de los vasos ocurre bajo la dirección de una población de células de punta endógenamente organizadas (CD31+) que se presenta con una morfología típica de células de punta, como filipodios excesivos 8,10. La presentación de las células murales PDGFR-ß+ y SMA+ que encapsulan las redes de vasos endoteliales se puede ver en d15 del proceso de maduración de organoides (Figura 3A,C). Después de la extracción de la ECM y la maduración en cultivo en suspensión (es decir, d15), los hBVO son sostenibles para los respectivos análisis o trasplante bajo la cápsula renal de ratón.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig01.jpg"> Figura 1: Esquema del protocolo hBVO destacando el tiempo y la progresión paso a paso. A partir de cultivos hPSC o hiPSC aparentemente homogéneos, la formación de agregados se produce en presencia del inhibidor de la Rho-quinasa Y27632. El medio suplementado con BMP4 y CHiR se utiliza para instruir a los agregados hacia el destino mesodérmico. El medio de inducción del mesodermo es reemplazado por VEGFA y medio suplementado con forskolina para estimular los agregados hacia un linaje vascular. Las colas mecánicas y químicas logradas a través de la incrustación de los agregados en una matriz de membrana basal solubilizada y de colágeno I y la exposición al medio que contiene VEGFA y FGF2 dan como resultado un brote vascular casi radialmente simétrico del cuerpo agregado. Las redes de vasos generados pueden eliminarse del colágeno I y la membrana basal solubilizada y colocarse en cultivo en suspensión para su posterior maduración, análisis o trasplante in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig02.jpg"> Figura 2: Progresión gradual de la generación hBVO capturada bajo campo claro. (A) Morfología típica de las colonias de hPSC (H9) en el día −1. (B) Generación de agregados hPSC (día 0) en placas de fijación ultra bajas de 6 pocillos en presencia de Y-27632. (C) La inducción mesodérmica de agregados utilizando BMP4 y medio suplementado con ChiR (día 1). También se pueden observar cambios sutiles en el tamaño y la forma del agregado. (D) Agregados del día 4 preparados hacia un linaje vascular utilizando VEGFA y medio suplementado con forskolina. (E) Germinación temprana del vaso el día 7, un día después de incrustar los agregados en la matriz de germinación y exposición al medio de germinación suplementado con VEGFA y FGF2 (día 7). (F) Morfología organoide saludable y brotación continua de los vasos el día 9. (G) Brote de buques en etapa tardía en el día 10. Idealmente, las estructuras celulares densas en el centro organoide han desaparecido en este momento. (H) Morfología típica de organoides de vasos sanguíneos humanos maduros (día 15). La eliminación de la matriz circundante mediante corte y maduración en placas de cultivo de 96 pocillos de fijación ultra baja da forma a los organoides esféricamente, con las redes de vasos alojadas internamente. Barras de escala: (A,B,E,F) 250 μm; (C,D) 500 μm; (G,H) 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64715/64715fig03.jpg"> Figura 3: Tinción de montaje completo de organoides de vasos sanguíneos humanos maduros (día 15). (A) Presentación de organoides de vasos sanguíneos humanos maduros (día 15) con redes endoteliales autoorganizadas (CD31+, magenta) y pericito circundante (PDGFR-β+, cian) y cobertura de actina del músculo liso alfa (SMA+, amarillo). (B) Mayor aumento de A detallando la expresión SMA+ (amarillo) y PDGFR-β+ (cian) de las redes de buques. (C) Presentación detallada de la interacción endotelial (CD31+, magenta), pericito (PDGFR-β+, cian) y actina del músculo liso alfa (SMA+, amarillo). (D) Tinción de montaje completo de la interacción vaso-músculo liso endotelial (CD31+, magenta)-músculo liso (SMA+, amarillo) en una sección transversal (izquierda) y un mayor aumento (derecha) de organoides de vasos sanguíneos maduros. (E) Formación autodirigida de una membrana basal vascular (Col IV+, escala de grises) a través de la estrecha asociación de las células murales y los tubos endoteliales. Barras de escala: (A,D[izquierda]) 100 μm; (B,D[derecha],E) 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64715/64715fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Este protocolo describe la generación de vasos sanguíneos autoorganizados a partir de células madre pluripotentes humanas y pluripotentes inducidas. Estas redes de vasos sanguíneos exhiben una red endotelial extensa y conectada rodeada de pericitos, actina del músculo liso y una membrana basal continua.

Generación de organoides de vasos sanguíneos humanos a partir de células madre pluripotentes

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Este protocolo describe nuestra generación de organoides de vasos sanguíneos humanos a partir de células madre pluripotentes. Esta tecnología se puede utilizar para estudiar aspectos de vasculogénesis, angiogénesis, enfermedad vascular, así como patologías vasculares. La reproducibilidad y la naturaleza de alto rendimiento, así como su consistencia en muchas líneas diferentes de células madre, son grandes ventajas de esta técnica.En términos de su aplicación, algunas de nuestras investigaciones anteriores describen el uso de organoides de los vasos sanguíneos para estudiar los cambios morfológicos para la vasculatura del paciente diabético y explora las vías de tratamiento farmacológico para la vasculopatía diabética. Mantener adecuadamente la población inicial de células madre, evitar que los agregados se agrupen y garantizar un diámetro agregado casi homogéneo, estos son factores esenciales para generar buenos organoides de vasos sanguíneos. Comenzar la generación de agregados utilizando células madre pluripotentes humanas cultivadas, o hPSCs, con una confluencia del 70%.Usando una pipeta o un sistema de vacío, aspirar el medio de cultivo y reemplazarlo con un mililitro de reactivo de disociación celular antes de incubar las células durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Mientras tanto, prepare el volumen necesario de medio de agregación en un tubo cónico de 15 mililitros, siguiendo la formulación mencionada en el texto manuscrito. Después de incubar las células, aspire el reactivo de disociación celular antes de suspender las células en un mililitro de medio de agregación.Pipetea suavemente el contenido hacia arriba y hacia abajo para crear una suspensión de una sola celda. Cuente las células utilizando un dispositivo automatizado de conteo de células o bajo un microscopio, y calcule el número total de células necesarias para la formación de agregados. La lectura de viabilidad celular muestra una suspensión de una sola célula con grupos bajos o nulos.Aspire el sobrenadante del tubo y agregue el volumen apropiado de la suspensión celular al medio de agregación en el tubo cónico de polipropileno de alta claridad de 15 mililitros y pipete suavemente la suspensión celular diluida hacia arriba y hacia abajo para garantizar una distribución homogénea de la celda. Pipetear tres mililitros de la suspensión celular diluida en cada pocillo deseado de la placa de cultivo de fijación ultra baja de seis pocillos. Coloque la placa en la incubadora y minimice cualquier perturbación para mantener el tamaño y la forma de los agregados.Prepare los medios del mesodermo como se describe en el texto manuscrito. 24 horas después de la siembra de las células, saque la placa de cultivo de la incubadora. Agite la placa en un movimiento circular para acumular los agregados en el centro de cada pozo.Con una pipeta de un mililitro, transfiera suavemente los agregados con el medio de cada pocillo al tubo cónico correspondiente. Permita que los agregados sedimenten en los tubos cónicos a temperatura ambiente durante una hora. Una vez sedimentado, aspirar el sobrenadante con una pipeta o una bomba aspiradora de alta sensibilidad con precaución, sin alterar los agregados sedimentados.Resuspender los agregados en cada tubo añadiendo dos mililitros de medio de inducción de mesodermo. A continuación, transfiera la suspensión de cada tubo al pocillo respectivo de la placa de cultivo de seis pocillos de fijación ultrabaja. Coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados y déjela hasta el cuarto día.En el cuarto día, saque la placa de cultivo de la incubadora, luego agite la placa con un movimiento circular para recolectar los agregados en el centro de cada pozo. Con una pipeta de un mililitro, transfiera suavemente los agregados con el medio circundante de cada pocillo al tubo cónico correspondiente. Establezca un temporizador durante 30 minutos para permitir que los agregados sedimenten en los tubos.Una vez sedimentados los áridos, preparar las placas de cultivo como se demostró previamente y colocarlas en la incubadora a 37 grados centígrados hasta el sexto día. Para la incrustación de agregados y la inducción de brotes de vasos, prepare el volumen final deseado de la solución de matriz extracelular mientras trabaja en hielo. Pipetear 500 microlitros del ECM en un pocillo de una placa de 12 pocillos para formar la primera capa del sándwich ECM.Para garantizar una polimerización efectiva de la primera capa de ECM, coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante dos horas. Hacia el final de la incubación de dos horas, comience a trabajar con los agregados en la placa de cultivo. Reúna los agregados en el centro de cada pocillo antes de usar una pipeta de un mililitro para transferir suavemente los agregados y el medio de cada pozo a un tubo cónico correspondiente de 15 mililitros.Deje que los agregados se asienten durante 10 a 15 minutos antes de aspirar el sobrenadante. Después de lo cual, mantenga los tubos cónicos que contienen los agregados en hielo durante cinco minutos. Trabajando rápida y cuidadosamente, resuspender los agregados en 500 microlitros de ECM sin formación de burbujas.Usando una pipeta, coloque la suspensión de agregado ECM sobre la primera capa ECM ya polimerizada dentro del pozo en la placa de 12 pocillos. Mientras tanto, prepare el medio de germinación como se describe en el texto manuscrito. Después de dos horas de incubación a 37 grados centígrados, agregue un mililitro de medio germinado precalentado a 37 grados centígrados en el pozo para inducir la diferenciación de los vasos sanguíneos.Trabajando en condiciones estériles, use el extremo redondeado de una espátula estéril para aflojar la matriz de germinación de ECM que contiene las redes vasculares. Luego, usando fórceps estériles y el extremo redondeado de una espátula estéril, transfiera cuidadosamente el disco de gel aflojado a la tapa de una placa de cultivo de 10 centímetros. Coloque el gel en la tapa bajo un microscopio estereoscópico ajustado al aumento y enfoque deseados, y use agujas estériles para cortar las redes de vasos sanguíneos individuales, tratando de limitar la cantidad de ECM no vascularizada obtenida en el proceso.Transfiera suavemente los organoides aislados a un pocillo de una placa de seis pocillos de fijación ultra baja que contenga tres mililitros de medio de brotación. A continuación, utilizando una pipeta de un mililitro, transfiera los organoides individuales al número apropiado de pocillos en una placa de 96 pocillos de fijación ultrabaja. Una vez transferido, agregue 200 microlitros de medio de germinación precalentado en cada pocillo de la placa de 96 pocillos.De cuatro a seis días después del aislamiento en la placa de 96 pocillos, asegúrese de que los organoides posean una morfología redonda y saludable antes de proceder a fijarlos y teñirlos. Las imágenes de la progresión gradual de la generación del organoide de los vasos sanguíneos humanos, o hBVO, a partir de hPSCs se capturaron en campo claro. En el día cero, se generaron agregados de 30 a 100 micras de diámetro a partir del cultivo de hPSC.Se observaron cambios sutiles en el tamaño y la forma de los agregados en la inducción del mesodermo el primer día, que cambió aún más en el cuarto día cuando los agregados se sometieron a cebado vascular. La brotación temprana del vaso casi radialmente simétrica se puede observar el día siete, un día después de incrustar los agregados en la matriz de brotación. La morfología organoide saludable y la continua brotación de vasos se observaron en el día nueve, que progresó a vasos en etapa tardía que brotaron en el día 10 cuando las estructuras celulares densas en el centro organoide casi desaparecieron.La morfología típica de los organoides de los vasos sanguíneos humanos maduros se observó claramente en el día 15. La tinción de montaje completo de los hBVO maduros en el día 15 exhibió una red endotelial extensa y conectada que era CD31 positiva y rodeada de parásitos PDGFR-beta positivos y actina de músculo liso alfa positivo para SMA. Las células murales PDGFR-beta-positivas y SMA-positivas que encapsulan las redes de vasos endoteliales están bien observadas.También se observó una membrana basal continua de colágeno IV positivo que envuelve las redes de vasos. Asegurar una polimerización adecuada de la matriz extracelular durante el paso de incrustación es fundamental para la brotación efectiva de los vasos sanguíneos. Los investigadores han utilizado nuestra tecnología de organoides de vasos sanguíneos para generar compartimentos vasculares tempranos en modelos de organoides ya establecidos, como el cerebro y el riñón, que anteriormente eran avasculares.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Desarrollo, la expansión y<em&gt; En vivo</em&gt; Monitoreo de las células NK humanas a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) y y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Investigación

Bioingeniería

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Eficiente generación y edición de IPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema CRISPR Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos adultos de la piel abdominal y generación de células madre pluripotentes inducidas utilizando un método no integrador

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Generación escalable de organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes humanas y caracterización por inmunosuización

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Diferenciación guiada de podocitos renales maduros de células madre pluripotentes inducidas por humanos en condiciones químicamente definidas

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Tejido conectivo de ingeniería humana derivado de fibroblastos para aplicaciones de detección

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...