Name: exploring the two herb combination strategy to treat injured pc12 cells
Uploaded: 2022-11-18T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells at JoVE.com

تم تمويل هذا البحث من خلال مشاريع البحث والتطوير الرئيسية التابعة لإدارة العلوم والتكنولوجيا بمقاطعة سيتشوان (2020YFS0325).

1. إعداد الكاشف
<ol><li>تحضير الوسط الكامل بإضافة 90 مل من وسط السكر العالي DMEM ، و 10 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، و 1 مل من محلول البنسلين والستربتومايسين في دورق مزرعة معقم سعة 125 مل. تخلط الوسط بالكامل وتخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية في ظروف مغلقة.</li>
	<li>قم بإعداد محلول CoCl 2 بإضافة 0.0...

<ol>
	<li>Mendelevich, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cerebral+ischemia,+and+dizziness.">Chronic cerebral ischemia, and dizziness.</a> Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).</li><li>Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+on+the+diagnosis+and+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+integrated+traditional+Chinese+and+western+medicine.">Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine.</a> Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).</li><li>Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+treatment+of+45+cases+of+cerebral+infarction+with+Astragalus+and+Dengzhan+Xixin+injection.">Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection.</a> Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).</li><li>Bei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+study+of+Dengzhanxixin+injection+combined+with+Astragalus+injection+in+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke.">Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke.</a> Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).</li><li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+ratio+of+Astragalus+injection+combined+with+Dengzhan+Xixin+injection+against+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+rats+by+baseline+equal-ratio+increase-decrease+design+method.">Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method.</a> China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+and+mechanism+of+Astragalus+combined+with+Erigeron+breviscapusin+the+best+proportion+on+cerebral+ischemia+rats.">Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+oxidative+damage+of+PC12+cells+with+hypoxia+and+hypoglycemia+based+on+the+combination+of+Astragalus+and+Dengzhan+Asarum+based+on+the+Nrf2/HO-1+pathway.">Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).</li><li>. Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I Available from: <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69</a> (2020)</li><li>. Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I Available from: <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8</a> (2020)</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linoleyltyrosine+protects+PC12+cells+against+oxidative+damage+via+autophagy:+Possible+involvement+of+CB1+receptor+regulation.">N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gab1+regulates+SDF-1-induced+progression+via+inhibition+of+apoptosis+pathway+induced+by+PI3K/AKT/Bcl-2/BAX+pathway+in+human+chondrosarcoma.">Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma.</a> Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).</li><li>Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Asarone+ameliorates+&#946;-Amyloid-induced+neurotoxicity+in+PC12+cells+by+activating+P13K/Akt/Nrf2+signaling+pathway.">&#946;-Asarone ameliorates &#946;-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).</li><li>Li, J., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+traditional+Chinese+and+western+medicine.">Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine.</a> Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).</li><li>Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discussion+on+the+therapeutic+value+of+traditional+Chinese+medicine+on+cognitive+dysfunction+caused+by+chronic+cerebral+ischemia.">Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia.</a> Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).</li><li>Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+research+on+pharmacological+and+neuroprotective+effects+of+traditional+Chinese+medicine+after+cerebral+ischemia.">Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia.</a> China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).</li><li>Wang, N., Sun, H., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+doses+of+astragalus+injection+on+neurological+rehabilitation+of+stroke+patients.">Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients.</a> Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).</li><li>Sun, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+astragalus+injection+on+apoptosis+after+cerebral+ischemia-reperfusion+in+rats.">Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats.</a> Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengzhan+Xixin+injection+derived+from+a+traditional+Chinese+herb+Erigeron+breviscapusameliorates+cerebral+ischemia/reperfusion+injury+in+rats+via+modulation+of+mitophagy+and+mitochondrial+apoptosis.">Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).</li><li>Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+research+progress+of+Dengzhanhua+preparation+in+prevention+and+treatment+of+ischemic+stroke+and+transient+ischemic+attack.">Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack.</a> Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).</li><li>Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+chronic+ethanol+consumption+on+apoptosis+and+autophagy+following+transient+focal+cerebral+ischemia+in+male+mice.">Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).</li><li>El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chrysin+attenuates+global+cerebral+ischemic+reperfusion+injury+via+suppression+of+oxidative+stress,+inflammation+and+apoptosis.">Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis.</a> Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).</li><li>Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+breviscapine+aglycone+on+PI+3+K/Akt+conduction+pathway+in+neonatal+rats+with+hypoxic-ischemic+brain+injury.">Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury.</a> Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).</li><li>Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-22+exerts+its+neuroprotective+and+angiogenic+functions+via+regulating+PI3K/Akt+signaling+pathway+in+cerebral+ischemia-reperfusion+rats).">MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats).</a> Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).</li><li>Luca, M., Luca, A., Calandra, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+damage+in+the+pathogenesis+and+progression+of+alzheimer's+disease+and+vascular+dementia.">The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupeol+alleviates+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+correlation+with+modulation+of+PI3K/Akt+pathway.">Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+phosphocreatine+on+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+induced+apoptosis+in+vitro+and+in+vivo:+Involvement+of+dual+PI3K/Akt+and+Nrf2/HO-1+pathways.">Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways.</a> Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).</li><li>Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J., Ch&#225;nez-C&#225;rdenas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cobalt+chloride+as+a+chemical+hypoxia+model.">The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).</li><li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside+attenuates+CoCl2-simulated+hypoxia+injury+in+PC12+cells+partly+by+mitochondrial+protection.">Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection.</a> European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).</li><li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+potency+of+Tofu+bio-processed+using+Actinomucor+elegans+against+hypoxic+injury+induced+by+cobalt+chloride+in+PC12+cells.">Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells.</a> Molecules. 26 (10), 2983 (2021).</li></ol>

لا يزال هناك نقص في الأدوية المثالية لعلاج نقص التروية الدماغية في الممارسة السريرية الحديثة2. بتوجيه من تكملة qi وتفعيل طريقة الدورة الدموية ، تم استخدام Ast و Eri والمستحضرات الأخرى معا في الممارسة السريرية للطب الصيني التقليدي وحققت مزايا شاملة جيدة13،14<...

نقص التروية الدماغية المزمن ، الناجم عن نقص التروية الدماغية ، هو مرض شائع في منتصف العمر وكبار السن1. كمرض إقفاري خفي طويل الأمد ، يمكن أن يؤدي إلى خلل وظيفي عصبي تدريجي أو مستمر. وتشمل الآليات المرضية الرئيسية موت الخلايا المبرمج والضرر التأكسدي ، مما يؤدي إلى خلل وظيفي عصبي تدريجي أو مستمر. هذا هو الأساس المرضي لمرض الزهايمر ، والخرف الوعائي ، وأمراض أخرى ، ويؤثر بشكل خطير على نوعية حياة المرضى. ومع ذلك ، لا يزال هناك نقص في الأدوية المثالية في الطب الحديث لعلاج نقص التروية الدماغية المزمن2. في الوقت نفسه ، تم استخدام مزيج من Astragalus mongholicus (Ast) و Erigeron breviscapus (Eri) على نطاق واسع في الممارسة السريرية للطب الصيني التقليدي (TCM)4. تحسنت استراتيجية الجمع بشكل ملحوظ في تعزيز استعادة وظيفة الأعصاب بعد نقص التروية الدماغية ، وهو أفضل من دواء واحد. ومع ذلك ، هناك اختلافات كبيرة في نسبة الجرعة في الجمع بين العقارين4. المكونات الفعالة وآلية العمل ليست محددة بشكل جيد ، وهي القضية الرئيسية التي تقيد تطبيقها السريري.
أظهرت الدراسات السابقة التأثير التآزري لمزيج التحضير لحقن Ast وحقن Eri في علاج نقص التروية الدماغية في الفئران. يمكن أن ينظم التعبير عن بروتين p-Akt ويقلل من تنظيم التعبير عن بروتين Bcl-2 المرتبط بالموت (BAD) 5,6 ، وهو أحد بروتينات عائلة B-lymphoblastoma 2 (Bcl-2) وله تأثير في تعزيز موت الخلايا المبرمج. ومع ذلك ، فإن الأساس المادي وآلية تأثيره التآزري غير واضحين. علاوة على ذلك ، تم إنشاء نموذج إصابة خلايا PC12 باستخدام CoCl2 مجتمعة وسط خال من الجلوكوز ، وتم فحص تركيبة المكونات المثلى في Ast و Eriوتعريفها 7.
في هذه الدراسة ، يتم فحص الجرعات الفعالة من Ast و Eri باستخدام نموذج خلية PC12 المصاب. يتم فحص المزيج الأمثل من العقارين باستخدام هذا النموذج جنبا إلى جنب مع طريقة التصميم المتجانسة. يستخدم نموذج الخلية لإجراء مزيد من التقييم للاختلاف في تأثيرات وآليات تركيبة التحضير ومجموعة المكونات في خلايا PC12 المصابة. تهدف هذه الاستراتيجية إلى استكشاف التأثير الوقائي والآلية التنظيمية لنوعي المجموعات على خلايا PC12 المصابة من خلال مسار إشارة PI3K / Akt / Nrf2 لتحديد أفضل وضع توليفة. توفر هذه الدراسة مرجعا لتحسين أفضل وضع تطبيق للطب الصيني التقليدي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1300 series class II biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>1374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>1334GR001</td>
			<td>MTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACEA NovoExpress&#160;1.4.0</td>
			<td>ACEA Biosciences, Inc</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>10176-2-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical flow cytometry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>62-2-1810-1027-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC apoptosis detection kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>C1062L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astragalus injection</td>
			<td>Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company</td>
			<td>A03190612144</td>
			<td>Ast injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astragaloside A</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>84687-43-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bax</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>60267-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl-2</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>26593-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>0816-2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-3</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>19677-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorogenic acid</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>327-97-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck Biotechnology, Inc.</td>
			<td>7791-13-1</td>
			<td>CoCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>2020112701</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2020090101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high sugar medium</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>2110050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM sugar free medium</td>
			<td>Beijing Solarbio life sciences Company</td>
			<td>2029548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL luminous fluid</td>
			<td>Lianshuo Biological Company</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>FA1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis instrument</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>1658026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erigeron breviscapus capsule</td>
			<td>Yunnan Biogu Pharmaceutical Company</td>
			<td>Z53021671</td>
			<td>Eri capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Four Seasons Institute of Biological Engineering</td>
			<td>20210402</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympms Corporation</td>
			<td>IX71-F32PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>SA00001- 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBM SPSS Statistics version 26.0</td>
			<td>International Business Machines Corporation, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ 1.8.0</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunol&#160;fluorescence&#160;staining kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2021070901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.</td>
			<td>HH35L2018296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motic Inverted microscope</td>
			<td>Nanda Scientific Instruments Co.</td>
			<td>AE2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2014081301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat milk</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>16396-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-Akt</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>66444-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC12 cells</td>
			<td>Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>CBP60430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase protease inhibitor mixture</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2015082901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive oxygen species assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RI-PA lysis solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scutellarin</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>27740-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample loading buffer, 5x</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter tips (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Merck Biotechnology, Inc.</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>1115GR500&#160;</td>
			<td>TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>J190013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2021051301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex oscillator</td>
			<td>OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>VXMNAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>66009-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the two herb combination strategy to treat injured pc12 cells

في ضوء مزايا الجمع بين الطب الصيني التقليدي (TCM) في علاج نقص التروية الدماغية ، درسنا الاختلافات في الفعالية والآلية بين تركيبة التحضير ومجموعة المكونات من أجل استكشاف استراتيجية الجمع بين الأعشاب لعلاج خلايا PC12 المصابة. تم استخدام كلوريد الكوبالت (CoCl2) جنبا إلى جنب مع وسط خال من الجلوكوز للحث على الضرر التأكسدي لخلايا PC12. بعد ذلك ، تم اختيار المزيج الأمثل من حقن Astragalus mongholicus (Ast) وحقن Erigeron breviscapus (Eri) ودمجهما باتباع طرق تصميم موحدة بعد فحص تركيزهما الآمن والفعال على خلايا PC12. علاوة على ذلك ، تتكون تركيبة المكونات التي تم فحصها من 10 ميكرومتر أستراغالوسيد A ، و 40 ميكرومتر سكوتيلارين ، و 75 ميكرومتر حمض الكلوروجينيك في عشبين. بعد ذلك ، تم استخدام MTT و Annexin V-FITC / PI والتألق المناعي وتحليل اللطخة الغربية لتقييم فعالية وآلية تركيبة التحضير ومجموعة المكونات على خلايا PC12 المصابة. أظهرت النتائج أن تركيبة التحضير المثلى لبقاء الخلية كانت حقن Ast وكبسولة Eri بتركيز 6: 1.8 (ميكرومتر). كانت تركيبة المكونات (10 ميكرومتر أستراغالوسيد A ، 40 ميكرومتر سكوتيلارين ، و 75 ميكرومتر حمض الكلوروجينيك) أكثر فعالية من تركيبة التحضير. كلا المجموعتين خفضت بشكل ملحوظ معدل موت الخلايا المبرمج ، وكثافة مضان caspase-3 ، ومستوى أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS). وفي الوقت نفسه ، قاموا بتنظيم مستويات التعبير من p-Akt / Akt و Bcl-2 / Bax و Nrf2. كانت هذه التأثيرات أكثر وضوحا في تركيبة المكونات. في الختام ، يمكن لكلا المجموعتين أن تمنع الإصابة التي يسببها CoCl2 جنبا إلى جنب مع وسيط خال من الجلوكوز على خلايا PC12 ، وبالتالي تعزيز بقاء الخلية. ومع ذلك ، قد تكون كفاءة تركيبة المكونات على تركيبة التحضير بسبب تنظيمها الأقوى لمسار إشارات PI3K / Akt / Nrf2 المتعلق بالإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج.

يوضح الشكل 1 فحص المزيج الأمثل من حقن Ast وكبسولة Eri. يوضح الشكل 1 أ معدل بقاء الخلية لحقن Ast وكبسولة Eri على خلايا PC12 العادية. كانت صلاحية الخلية أقل من 95٪ مع حقن Ast بتركيزات أكبر من 12 ميكرومتر (الشكل 1 أ) وكبسولة إيري بتركيزات أكبر من 5 ميكرومتر (الشكل 1 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells at JoVE.com

Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells

يوفر هذا البروتوكول استراتيجية الجمع بين اثنين من الأعشاب لعلاج خلايا PC12 المصابة. يوفر البروتوكول مرجعا لتحسين أفضل طريقة تطبيق للطب الصيني التقليدي (TCM).

استكشاف استراتيجية الجمع بين الأعشاب لعلاج خلايا PC12 المصابة

In view of the advantages of the combination of traditional Chinese medicine (TCM) in the treatment of cerebral ischemia, we studied the differences in ...

يوفر البروتوكول في هذه الدراسة استراتيجية الجمع بين اثنين من الأعشاب لعلاج خلايا PC12 التالفة من نقص الأكسجة ، ومرجع لتحسين أفضل وضع مزيج من الأعشاب. يمكن أن توفر هذه التقنية طريقة تجريبية بسيطة وموثوقة وفعالة في المختبر لفحص تركيبة المكونات الفعالة من الأعشاب ، ضد الخلايا الناقصة. يمكن أيضا تطبيق هذه الاستراتيجية لفحص مجموعات المكونات ضد خلايا نقص الأكسجين من مجموعات تحضير الأعشاب الأخرى ، وتوضيح آلية الحماية الخاصة بها.للبدء ، قم بزراعة خلايا PC12 الفرعية كل يومين إلى ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية في حاضنة مكملة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ للحصول على ممر من 4 إلى 8 لجميع التجارب اللاحقة. عالج 70 إلى 80٪ من خلايا PC12 المتقاربة بملليلتر واحد من 0.25٪ تربسين ، وراقب الخلايا تحت المجهر لانفصال الخلايا. ثم أوقف هضم التربسين بإضافة ثلاثة ملليلتر من الوسط الكامل.قم بتدوير الخلايا المنقولة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر بسرعة 840 × جم لمدة خمس دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية بالوسط الكامل وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. لحساب الخلايا ، ابدأ برنامج قياس التدفق الخلوي وحدد مضاعف التخفيف المقابل لمحلول الخلية في إعداد العد.انقر فوق مخطط الكثافة بعد تحميل عينة الخلية. ضع دائرة حول عدد الخلايا بعيدا عن المحور السيني والمحور الصادي. انقر بزر الماوس الأيمن فوق جدول البيانات أسفل الشكل، وحدد X وY وCount وAbs.عد للحصول على نتائج عد الخلايا ضمن جدول بيانات Abs.Count. بعد ضبط تركيز الخلية تقريبا إلى 1 مرة 10 إلى 5 خلايا لكل مليلتر مع الوسط الكامل ، أضف 100 ميكرولتر من معلق الخلية لكل بئر إلى لوحة 96 بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، أضف إلى اللوحة المهملة الطاف 120 ميكرولترا من ملليغرام واحد لكل ملليلتر من محلول MTT في كل بئر ، واحتضانها لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية.بعد الحضانة ، بمجرد التخلص من المادة الطافية ، أضف 150 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر. حافظ على اللوحة تحت الاهتزاز في مذبذب دوامة لمدة 10 دقائق بسرعة 240 مرة في الدقيقة. ثم قم بقياس الامتصاص عند 490 نانومتر في قارئ الصفيحة الدقيقة.لفحص التركيبة المثلى من الأدوية بطريقة تصميم متجانسة ، قم بزراعة الخلايا كما هو موضح سابقا وعلاج خلايا PC12 المصابة بستة تركيزات مختلفة من حقن استراغالوس وكبسولة breviscapus. لتقييم التأثير الوقائي لمجموعتين مثاليتين ، عالج خلايا PC12 المصابة بنوعين من الأدوية. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة وحساب صلاحية الخلية كما هو موضح سابقا.بذر خلايا PC12 في صفيحة من 12 بئرا واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد العلاج بالعقاقير ، عالج الخلايا ب 250 ميكرولتر من التربسين لكل بئر وطرد الخلايا بالطرد المركزي عند 840 × جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أعد تعليق حبيبات الخلية ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط.أضف 5 ميكرولتر من Annexin V-FITC ، و 10 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم في ثلاث نسخ لكل مجموعة ، واحتضان الخلايا في الظلام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للتحقق من موت الخلايا المبرمج باستخدام قياس التدفق الخلوي. في برنامج مقياس التدفق الخلوي، انقر فوق التعويض التلقائي في قائمة ابدأ، وحدد FITC وPE وPerCP وAPC في القناة تحديد، وحدد التعويض عند الارتفاع. ثم اضغط OK في العنصر الإحصائي: متوسط.انقر فوق خريطة الكثافة وقم بوضع دائرة حول عدد الخلايا الفعال باستخدام طريقة عد الخلايا الموضحة سابقا. باستخدام مضان FITC كمعلمة المحور السيني والتألق الآخر كمعلمة المحور الصادي ، قم بإنشاء خريطة كثافة. انقر فوق مصفوفة التعويض في قائمة ابدأ والمعامل في مصفوفة الفائض.قم بزرع خلايا PC12 على أغطية موضوعة على بئر مكون من 24 بئرا في ثلاث نسخ ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد العلاج بالعقاقير ، اشطف الأغطية مرتين باستخدام PBS لمدة خمس دقائق لكل منهما ، وقم بإصلاحها بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة ، ونفاذها باستخدام 0.5٪ Triton X-100 لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد شطف الخلايا ، قم بحظرها بمصل الماعز بنسبة 10٪ لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.أضف 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف caspase-3 إلى كل غطاء واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت TBST لمدة ثلاث دقائق لكل منهما ، واحتضان 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد الحضانة ، احتضن أغطية الأغطية ب 300 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من DAPI لمدة 10 دقائق ، واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة خمس دقائق لكل منهما.التقط صور الغطاء تحت مجهر مضان وحلل إحصائيا شدة التألق باستخدام برنامج التصوير. اغسل غطاء خلية PC12 المعالج بالعقاقير ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة ثلاث دقائق لكل منها واحتضانه ب 400 ميكرولتر من 10 ميكرومولار ثنائي كلورو ثنائي هيدرو فلوريسئين عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام DMEM الخالي من المصل مرتين لمدة ثلاث دقائق لكل منهما.أضف عامل التبريد الفلوري والتقط على الفور صور الغطاء تحت مجهر مضان لحساب شدة التألق النسبية باستخدام برنامج التصوير. اغسل خلايا PC12 المعالجة بالعقاقير في صفيحة من 6 آبار ثلاث مرات مع PBS لمدة خمس دقائق لكل منها ، واحتضانها على الثلج لمدة 30 دقيقة في محلول التحلل المحضر البالغ 100 ميكرولتر لكل بئر. بعد التحلل ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 16،000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لجمع المادة الطافية.بعد اكتشاف تركيز البروتين بواسطة مقايسة برادفورد ، قم بتشغيل رحلان كهربائي SDS-PAGE بنسبة 12٪ مع 25 ميكروغرام من البروتين في كل حارة ونقل الجل إلى غشاء PVDF. سد الأغشية مع الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5 ٪ لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، واحتضان مع خمسة ملليلتر من الأجسام المضادة الأولية المقابلة لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية. بعد الحضانة وغسل الغشاء مع TBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما ، احتضان مع خمسة ملليلتر من الأجسام المضادة الثانوية HRP المترافقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.أخيرا ، إلى الغشاء المغسول TBST ، أضف ركيزة HRP كيميائية مضيئة للكشف عن نطاق البروتين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم التقط الصور باستخدام نظام التصوير الكيميائي لتحديد القيم الرمادية للبروتينات ، مع بيتا أكتين كعنصر تحكم داخلي. كانت صلاحية الخلية على خلايا PC12 العادية أقل من 95٪ مع حقن استراغالوس بتركيزات أكبر من 12 ميكرومولار ، وأكبر من 5 ميكرومولار لكبسولة بريفيسكابوس.يمكن أن يؤدي حقن استراغالوس إلى تحسين معدل بقاء خلايا PC12 المصابة في نطاق تركيز من 6 إلى 12 ميكرومولار ، وكبسولة breviscapus من 2 إلى 5 ميكرومولار. في حين أن تركيبة الدواء بنسبة 6 إلى 1.8 ميكرومولار أظهرت أعلى قابلية للخلية. تم تعزيز صلاحية الخلية للمجموعتين على خلايا PC12 المصابة بشكل كبير ، وكانت تركيبة المكونات متفوقة على مجموعة التحضير.أظهر معدل موت الخلايا المبرمج أن النسب المئوية للخلايا المبرمج المبكرة والمتأخرة والكلية كانت أعلى بكثير في المجموعة النموذجية منها في المجموعة الطبيعية. بالمقارنة مع المجموعة النموذجية ، كانت النسب المئوية للخلايا المبرمج في كل مرحلة أقل بكثير في مجموعة العلاج. كانت شدة التألق ل caspase-3 أقل بكثير في كل مجموعة علاج مقارنة بمجموعة النموذج ، وكانت أقل نسبيا في مجموعة تركيبة المكونات.كشف التعبير النسبي للجينات Akt و Bcl-2 و Bax أن تركيبة المكونات متفوقة على تركيبة التحضير في تعزيز بقاء الخلية ، والتي ترتبط بالتأثير الأقوى المضاد لموت الخلايا المبرمج. أظهرت تركيبة المكونات تأثيرا أفضل للضرر المضاد للأكسدة من تركيبة المستحضر ، وتعبيرا أعلى بكثير عن بروتين Nrf2. يمكن استخدام هذه الطريقة لفحص وتقييم تركيبة المكونات مع الأنشطة الدوائية المحتملة الأخرى من تركيبة الأعشاب ، مثل مضادات الالتهاب والمضادة للبكتيريا والمزيد.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

استراتيجية لتحديد الطفرات دي نوفو في الاضطرابات الشائعة مثل التوحد والفصام

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Catheter Ablation in Combination With Left Atrial Appendage Closure for Atrial Fibrillation

اجتثاث القثطرة في تركيبة مع الزمن لاختتام أطرافهم الأذيني الرجفان الأذيني

Atrial fibrillation (AF) is the most common sustained cardiac arrhythmia, affecting millions of individuals worldwide 1-3. The rapid, irregular, and ...

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

قياس وعلاج الحول في قمع

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Dual-phase Cone-beam Computed Tomography to See, Reach, and Treat Hepatocellular Carcinoma during Drug-eluting Beads Transarterial Chemo-embolization

The advent of cone-beam computed tomography (CBCT) in the angiography suite has been revolutionary in interventional radiology. CBCT offers 3 ...

Tumor Treating Field Therapy in Combination with Bevacizumab for the Treatment of Recurrent Glioblastoma

علاج الورم العلاج الميداني بالاشتراك مع بيفاسيزوماب لعلاج ورم أرومي دبقي المتكررة

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Development of Recombinant Proteins to Treat Chronic Pain

تنمية بروتينات المؤتلف لعلاج الألم المزمن

Chronic pain is difficult to treat and new approaches to resolve persistent pain are urgently needed. Anti-inflammatory cytokines are promising candidates ...

Three-Dimensional Collagen Matrix Scaffold Implantation as a Liver Regeneration Strategy

ثلاثي الأبعاد الكولاجين مصفوفة زرع سقالة كاستراتيجية تجديد الكبد

Liver diseases are the leading cause of death worldwide. Excessive alcohol consumption, a high-fat diet, and hepatitis C virus infection promote fibrosis, ...

Vessel-Sparing Microsurgical Longitudinal Intussusception Vasoepididymostomy to Treat Epididymal Obstructive Azoospermia

استئصال الأوعية الدموية الخلقي الطولي الجانبي للشرايين لعلاج فقدان النطاف الانسدادي البربخي

The epididymis is a common site of obstruction in obstructive azoospermia (OA). Vasoepididymostomy has become an important method for the treatment of ...