Name: exploring the two herb combination strategy to treat injured pc12 cells
Uploaded: 2022-11-18T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells at JoVE.com

Denne forskning blev finansieret af centrale FoU-projekter fra Sichuan Provincial Department of Science and Technology (2020YFS0325).

1. Fremstilling af reagens
<ol><li>Forbered det komplette substrat ved at tilsætte 90 ml DMEM-medium med højt sukkerindhold, 10 ml føtalt bovint serum (FBS) og 1 ml penicillin-streptomycinopløsning i en 125 ml steril dyrkningskolbe. Hele substratet blandes og opbevares ved 4 °C under lukkede forhold.</li>
	<li>Forbered CoCl 2-opløsningen ved at tilsætte 0,02 g CoCl2-pulver (nøjagtigt afvejet) i 10 ml DMEM sukkerfrit medium (opløst fuldstændigt) for at opnå en 8,4 mM stamopløsning...

<ol>
	<li>Mendelevich, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cerebral+ischemia,+and+dizziness.">Chronic cerebral ischemia, and dizziness.</a> Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).</li><li>Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+on+the+diagnosis+and+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+integrated+traditional+Chinese+and+western+medicine.">Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine.</a> Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).</li><li>Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+treatment+of+45+cases+of+cerebral+infarction+with+Astragalus+and+Dengzhan+Xixin+injection.">Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection.</a> Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).</li><li>Bei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+study+of+Dengzhanxixin+injection+combined+with+Astragalus+injection+in+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke.">Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke.</a> Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).</li><li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+ratio+of+Astragalus+injection+combined+with+Dengzhan+Xixin+injection+against+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+rats+by+baseline+equal-ratio+increase-decrease+design+method.">Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method.</a> China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+and+mechanism+of+Astragalus+combined+with+Erigeron+breviscapusin+the+best+proportion+on+cerebral+ischemia+rats.">Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+oxidative+damage+of+PC12+cells+with+hypoxia+and+hypoglycemia+based+on+the+combination+of+Astragalus+and+Dengzhan+Asarum+based+on+the+Nrf2/HO-1+pathway.">Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).</li><li>. Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I Available from: <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69</a> (2020)</li><li>. Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I Available from: <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8</a> (2020)</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linoleyltyrosine+protects+PC12+cells+against+oxidative+damage+via+autophagy:+Possible+involvement+of+CB1+receptor+regulation.">N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gab1+regulates+SDF-1-induced+progression+via+inhibition+of+apoptosis+pathway+induced+by+PI3K/AKT/Bcl-2/BAX+pathway+in+human+chondrosarcoma.">Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma.</a> Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).</li><li>Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Asarone+ameliorates+&#946;-Amyloid-induced+neurotoxicity+in+PC12+cells+by+activating+P13K/Akt/Nrf2+signaling+pathway.">&#946;-Asarone ameliorates &#946;-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).</li><li>Li, J., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+traditional+Chinese+and+western+medicine.">Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine.</a> Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).</li><li>Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discussion+on+the+therapeutic+value+of+traditional+Chinese+medicine+on+cognitive+dysfunction+caused+by+chronic+cerebral+ischemia.">Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia.</a> Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).</li><li>Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+research+on+pharmacological+and+neuroprotective+effects+of+traditional+Chinese+medicine+after+cerebral+ischemia.">Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia.</a> China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).</li><li>Wang, N., Sun, H., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+doses+of+astragalus+injection+on+neurological+rehabilitation+of+stroke+patients.">Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients.</a> Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).</li><li>Sun, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+astragalus+injection+on+apoptosis+after+cerebral+ischemia-reperfusion+in+rats.">Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats.</a> Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengzhan+Xixin+injection+derived+from+a+traditional+Chinese+herb+Erigeron+breviscapusameliorates+cerebral+ischemia/reperfusion+injury+in+rats+via+modulation+of+mitophagy+and+mitochondrial+apoptosis.">Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).</li><li>Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+research+progress+of+Dengzhanhua+preparation+in+prevention+and+treatment+of+ischemic+stroke+and+transient+ischemic+attack.">Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack.</a> Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).</li><li>Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+chronic+ethanol+consumption+on+apoptosis+and+autophagy+following+transient+focal+cerebral+ischemia+in+male+mice.">Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).</li><li>El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chrysin+attenuates+global+cerebral+ischemic+reperfusion+injury+via+suppression+of+oxidative+stress,+inflammation+and+apoptosis.">Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis.</a> Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).</li><li>Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+breviscapine+aglycone+on+PI+3+K/Akt+conduction+pathway+in+neonatal+rats+with+hypoxic-ischemic+brain+injury.">Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury.</a> Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).</li><li>Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-22+exerts+its+neuroprotective+and+angiogenic+functions+via+regulating+PI3K/Akt+signaling+pathway+in+cerebral+ischemia-reperfusion+rats).">MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats).</a> Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).</li><li>Luca, M., Luca, A., Calandra, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+damage+in+the+pathogenesis+and+progression+of+alzheimer's+disease+and+vascular+dementia.">The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupeol+alleviates+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+correlation+with+modulation+of+PI3K/Akt+pathway.">Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+phosphocreatine+on+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+induced+apoptosis+in+vitro+and+in+vivo:+Involvement+of+dual+PI3K/Akt+and+Nrf2/HO-1+pathways.">Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways.</a> Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).</li><li>Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J., Ch&#225;nez-C&#225;rdenas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cobalt+chloride+as+a+chemical+hypoxia+model.">The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).</li><li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside+attenuates+CoCl2-simulated+hypoxia+injury+in+PC12+cells+partly+by+mitochondrial+protection.">Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection.</a> European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).</li><li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+potency+of+Tofu+bio-processed+using+Actinomucor+elegans+against+hypoxic+injury+induced+by+cobalt+chloride+in+PC12+cells.">Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells.</a> Molecules. 26 (10), 2983 (2021).</li></ol>

Der mangler stadig ideelle lægemidler til behandling af cerebral iskæmi i moderne klinisk praksis2. Under vejledning af supplering af qi og aktivering af blodcirkulationsmetoden er Ast, Eri og andre præparater blevet anvendt i kombination i den kliniske praksis med TCM og har opnået gode omfattende fordele13,14,15. Et stort antal undersøgelser har vist, at Ast kan forbedre permeabiliteten af blod-hje...

Kronisk cerebral iskæmi, forårsaget af cerebral hypoperfusion, er en almindelig sygdom hos midaldrende og ældre mennesker1. Som en langsigtet okkult iskæmi sygdom, kan det føre til progressiv eller vedvarende neurologisk dysfunktion. De vigtigste patologiske mekanismer omfatter celleapoptose og oxidativ skade, hvilket fører til progressiv eller vedvarende neurologisk dysfunktion; Dette er det patologiske grundlag for Alzheimers sygdom, vaskulær demens og andre sygdomme og påvirker patienternes livskvalitet alvorligt. Der er dog stadig mangel på ideelle lægemidler i moderne medicin til behandling af kronisk cerebral iskæmi2. Samtidig er kombinationen af Astragalus mongholicus (Ast) og Erigeron breviscapus (Eri ) blevet anvendt i vid udstrækning i den kliniske praksis med traditionel kinesisk medicin (TCM)4. Kombinationsstrategien er bemærkelsesværdigt forbedret med hensyn til at fremme genopretningen af nervefunktionen efter cerebral iskæmi, hvilket er bedre end for et enkelt lægemiddel; Der er imidlertid store forskelle i doseringsforholdet i kombinationen af de to lægemidler4. De effektive komponenter og virkningsmekanismer er ikke veldefinerede, hvilket er det centrale spørgsmål, der begrænser dets kliniske anvendelse.
Tidligere undersøgelser har vist den synergistiske virkning af præparatkombinationen af Ast-injektion og Eri-injektion til behandling af cerebral iskæmi hos rotter. Det kan opregulere ekspressionen af p-Akt-protein og nedregulere ekspressionen af Bcl-2-associeret dødspromotor (BAD) protein5,6, som er et af B-lymfoblastoma 2 (Bcl-2) familieproteinerne og har den virkning at fremme apoptose. Det materielle grundlag og mekanismen for dets synergistiske virkning er imidlertid ikke klart. Endvidere blev skadesmodellen af PC12-celler etableret medCoCl2 kombineret glukosefrit medium, og den optimale komponentkombination i Ast og Eri er blevet screenet og defineret7.
I denne undersøgelse screenes de effektive doser af Ast og Eri ved hjælp af den skadede PC12-cellemodel. Den optimale kombination af de to lægemidler screenes ved hjælp af denne model kombineret med den homogene designmetode. Cellemodellen bruges til yderligere at evaluere forskellen i virkningerne og mekanismerne af præparatkombinationen og komponentkombinationen i skadede PC12-celler. Denne strategi sigter mod at undersøge beskyttelseseffekten og reguleringsmekanismen for de to typer kombinationer på skadede PC12-celler gennem PI3K / Akt / Nrf2-signalvejen for at bestemme den bedste kombinationstilstand. Denne undersøgelse giver en reference til optimering af den bedste applikationstilstand for TCM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1300 series class II biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>1374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>1334GR001</td>
			<td>MTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACEA NovoExpress&#160;1.4.0</td>
			<td>ACEA Biosciences, Inc</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>10176-2-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical flow cytometry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>62-2-1810-1027-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC apoptosis detection kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>C1062L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astragalus injection</td>
			<td>Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company</td>
			<td>A03190612144</td>
			<td>Ast injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astragaloside A</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>84687-43-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bax</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>60267-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl-2</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>26593-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>0816-2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-3</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>19677-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorogenic acid</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>327-97-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck Biotechnology, Inc.</td>
			<td>7791-13-1</td>
			<td>CoCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>2020112701</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2020090101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high sugar medium</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>2110050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM sugar free medium</td>
			<td>Beijing Solarbio life sciences Company</td>
			<td>2029548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL luminous fluid</td>
			<td>Lianshuo Biological Company</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>FA1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis instrument</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>1658026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erigeron breviscapus capsule</td>
			<td>Yunnan Biogu Pharmaceutical Company</td>
			<td>Z53021671</td>
			<td>Eri capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Four Seasons Institute of Biological Engineering</td>
			<td>20210402</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympms Corporation</td>
			<td>IX71-F32PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>SA00001- 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBM SPSS Statistics version 26.0</td>
			<td>International Business Machines Corporation, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ 1.8.0</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunol&#160;fluorescence&#160;staining kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2021070901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.</td>
			<td>HH35L2018296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motic Inverted microscope</td>
			<td>Nanda Scientific Instruments Co.</td>
			<td>AE2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2014081301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat milk</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>16396-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-Akt</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>66444-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC12 cells</td>
			<td>Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>CBP60430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase protease inhibitor mixture</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2015082901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive oxygen species assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RI-PA lysis solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scutellarin</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>27740-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample loading buffer, 5x</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter tips (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Merck Biotechnology, Inc.</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>1115GR500&#160;</td>
			<td>TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>J190013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2021051301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex oscillator</td>
			<td>OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>VXMNAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>66009-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the two herb combination strategy to treat injured pc12 cells

I lyset af fordelene ved kombinationen af traditionel kinesisk medicin (TCM) til behandling af cerebral iskæmi undersøgte vi forskellene i effekt og mekanisme mellem præparatkombinationen og komponentkombinationen for at udforske de to urtekombinationsstrategier til behandling af skadede PC12-celler. Koboltchlorid (CoCl2) kombineret med et glukosefrit medium blev anvendt til at inducere oxidativ skade på PC12-celler. Derefter blev den optimale kombination af Astragalus mongholicus (Ast) og Erigeron breviscapus (Eri ) injektion valgt og kombineret efter ensartede designmetoder efter screening af deres sikre og effektive koncentration på PC12-celler. Endvidere omfatter den screenede komponentkombination 10 μM astragalosid A, 40 μM scutellarin og 75 μM chlorogen syre i to urter. Derefter blev MTT, Annexin V-FITC / PI, immunofluorescens og Western blot-analyse brugt til at evaluere effektiviteten og mekanismen af præparatkombinationen og komponentkombinationen på skadede PC12-celler. Resultaterne viste, at den optimale præparationskombination til cellepro-overlevelse var Ast-injektion og Eri-kapsel med en koncentration på 6:1,8 (μM). Komponentkombinationen (10 μM astragalosid A, 40 μM scutellarin og 75 μM chlorogen syre) var mere effektiv end præparatkombinationen. Begge kombinationer reducerede bemærkelsesværdigt apoptotisk hastighed, fluorescensintensiteten af caspase-3 og intracellulære reaktive iltarter (ROS) niveau; i mellemtiden opregulerede de ekspressionsniveauerne for p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax og Nrf2. Disse virkninger var mere tydelige i komponentkombinationen. Afslutningsvis kan begge kombinationer hæmme skaden induceret af CoCl2 kombineret med et glukosefrit medium på PC12-celler og dermed fremme celleoverlevelse. Imidlertid kan effektiviteten af komponentkombinationen i forhold til præparatkombinationen skyldes dens stærkere regulering af PI3K / Akt / Nrf2-signalvejen relateret til oxidativ stress og apoptose.

Screeningen af den optimale kombination af Ast-injektion og Eri-kapsel er vist i figur 1. Celleoverlevelsesraten for Ast-injektion og Eri-kapsel på de normale PC12-celler er vist i figur 1A. Cellelevedygtigheden var lavere end 95 % ved Ast-injektion ved koncentrationer større end 12 μM (figur 1A) og Eri-kapsel ved koncentrationer større end 5 μM (figur 1A), hvilket indikerer, at den maksimale ikke-toksiske koncentration var he...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells at JoVE.com

Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells

Denne protokol giver en kombinationsstrategi af to urter til behandling af skadede PC12-celler. Protokollen giver en reference til optimering af den bedste applikationstilstand for traditionel kinesisk medicin (TCM).

Udforskning af de to urter kombination strategi til behandling af skadede PC12 celler

In view of the advantages of the combination of traditional Chinese medicine (TCM) in the treatment of cerebral ischemia, we studied the differences in ...

Protokollen i denne undersøgelse giver en kombinationsstrategi af to urter til behandling af hypoxi-beskadigede PC12-celler og en reference til optimering af den bedste kombinationstilstand af urter. Denne teknik kan give en enkel, pålidelig og effektiv in vitro eksperimentel metode til screening af den effektive ingredienskombination fra urter mod hypoxialceller. Denne strategi kan også anvendes til at screene komponentkombinationerne mod hypoxialceller fra andre urtepræparatkombinationer og illustrere deres beskyttelsesmekanisme.Til at begynde med subkultureres PC12-cellerne hver anden til tredje dag ved 37 grader Celsius i en inkubator suppleret med 5% kuldioxid for at få en passage på 4 til 8 for alle efterfølgende eksperimenter. Behandl 70 til 80% sammenflydende PC12-celler med en milliliter 0.25%trypsin, og observer cellerne under et mikroskop for celleløsrivelse. Stop derefter trypsinfordøjelsen ved at tilsætte tre ml af det komplette medium.Drej de overførte celler ned i et 15 ml centrifugerør ved 840 x g i fem minutter. Efter at supernatanten er kasseret, resuspenderes cellepellet med hele substratet, og cellesuspensionen overføres til et 1,5 ml mikrocentrifugeglas. For at tælle cellerne skal du starte flowcytometrisoftwaren og vælge det tilsvarende fortyndingsmultiplum af celleopløsningen i tælleindstillingen.Klik på densitetsdiagram efter indlæsning af celleprøven. Cirkel cellepopulationen væk fra x-aksen og y-aksen. Højreklik på datatabellen under figuren, og vælg X, Y, Antal og Abs.Tæl for at få celletællingsresultaterne under datatabellen i Abs.Count. Efter justering af cellekoncentrationen ca. til 1 gange 10 til de 5. celler pr. milliliter med det komplette medium, tilsættes 100 mikroliter af cellesuspensionen pr. brønd til en 96-brøndplade og inkuberes ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 24 timer. Den næste dag tilsættes 120 mikroliter af et milligram pr. milliliter MTT-opløsning i hvert hul til den supernatantkasserede plade og inkuberes i fire timer ved 37 grader Celsius.Efter inkubationen tilsættes 150 mikroliter DMSO til hvert hul, når supernatanten er kasseret. Hold pladen under omrystning i en hvirveloscillator i 10 minutter med en hastighed på 240 gange pr. Minut. Derefter måles absorbansen ved 490 nanometer i en mikropladelæser.For at screene den optimale kombination af lægemidler ved homogen designmetode skal du dyrke cellerne som demonstreret tidligere og behandle de skadede PC12-celler med seks forskellige proportioner af Astragalus-injektion og breviscapus-kapsel. For at evaluere den beskyttende virkning af to optimale kombinationer skal du behandle de skadede PC12-celler med de to typer kombinationer af lægemidler. Inkuber cellerne i 24 timer og beregn cellelevedygtigheden som vist tidligere.Frø PC12-cellerne i en plade med 12 brønde og inkuber ved 37 grader Celsius i 24 timer. Efter lægemiddelbehandling behandles cellerne med 250 mikroliter trypsin pr. Brønd og centrifugeres cellerne ved 840 x g i fem minutter ved stuetemperatur. Derefter resuspenderes cellepillen med 500 mikroliter bindingsbuffer.Tilsæt 5 mikroliter Annexin V-FITC, 10 mikroliter propidiumiodid i tre eksemplarer for hver gruppe, og inkuber cellerne i mørke i 15 minutter ved stuetemperatur for at kontrollere for apoptose ved hjælp af flowcytometri. I flowcytometersoftwaren skal du klikke på Automatisk kompensation i menuen Start, vælge FITC, PE, PerCP og APC i Vælg kanal og vælge Kompensation i højden. Klik derefter på OK i det statistiske element:Median.Klik på Tæthedskort, og sæt en cirkel om den effektive cellepopulation med celletællingsmetoden, der blev vist tidligere. Med FITC-fluorescens som x-akseparameter og anden fluorescens som y-akseparameter skal du oprette et densitetskort. Klik på kompensationsmatrix i Start-menuen og koefficient i overløbsmatrixen.Frø PC12-cellerne til dæksedlerne placeret på en 24-brønds pladebrønd i tre eksemplarer, og inkuber ved 37 grader Celsius i 24 timer. Efter lægemiddelbehandling skylles dækslerne to gange med PBS i fem minutter hver, fastgøres med 4% paraformaldehyd i 15 minutter og permeabiliseres med 0,5% Triton X-100 i 20 minutter ved stuetemperatur. Efter skylning af cellerne skal du blokere dem med 10% gedeserum i en time ved stuetemperatur.Tilsæt 200 mikroliter fortyndet primært antistof caspase-3 til hver dæksel og inkuber natten over ved 4 grader Celsius. Den følgende dag vaskes tre gange med TBST-buffer i tre minutter hver og inkuberes med 200 mikroliter sekundært antistof i en time ved stuetemperatur i mørke. Efter inkubation inkuberes dæksedlerne med 300 mikroliter 0,5 mikrogram pr. Milliliter DAPI i 10 minutter, og vask cellerne tre gange med TBST i fem minutter hver.Tag coverslip-billederne under et fluorescensmikroskop, og analysér fluorescensintensiteten statistisk med billedbehandlingssoftwaren. Vask det lægemiddelbehandlede PC12-celledæksel tre gange med PBS i tre minutter hver og inkuber med 400 mikroliter 10 mikromolært dichlordihydrofluoresceindiacetat ved 37 grader Celsius i 20 minutter. Vask cellerne igen med serumfri DMEM to gange i tre minutter hver.Tilføj fluorescensdæmpningsmidlet, og tag straks dækselbillederne under et fluorescensmikroskop for at beregne den relative fluorescensintensitet med billedbehandlingssoftwaren. Vask de lægemiddelbehandlede PC12-celler i en 6-brøndplade tre gange med PBS i fem minutter hver, og inkuber på is i 30 minutter i den fremstillede lysisbuffer på 100 mikroliter pr. Brønd. Efter lysis centrifugeres cellerne ved 16.000 x g i 20 minutter ved 4 grader Celsius for at opsamle supernatanten.Efter påvisning af proteinkoncentrationen ved Bradford-analyse køres en 12% SDS-PAGE elektroforese med 25 mikrogram protein i hver bane og overføres gelen til PVDF-membranen. Bloker membranerne med 5% fedtfri mælk i 1,5 timer ved stuetemperatur, og inkuber med fem ml af de tilsvarende primære antistoffer i 24 timer ved 4 grader Celsius. Efter inkubation og vask af membranen med TBST tre gange i 10 minutter hver, inkuberes med fem ml sekundære HRP-konjugerede antistoffer ved stuetemperatur i to timer.Endelig tilsættes kemiluminescerende HRP-substrat til detektering af proteinbånd i henhold til producentens anvisninger til den TBST-vaskede membran. Tag derefter billederne ved hjælp af kemiluminescensbilleddannelsessystemet til at kvantificere proteinernes grå værdier med beta-actin som en intern kontrol. Cellelevedygtigheden på de normale PC12-celler var lavere end 95% med Astragalus-injektion i koncentrationer større end 12 mikromolære og større end 5 mikromolære for breviscapus-kapslen.Astragalusinjektion kunne forbedre overlevelsesraten for de skadede PC12-celler i koncentrationsområdet 6 til 12 mikromolar, og breviscapus kapsel ved 2 til 5 mikromolar. Mens lægemiddelkombinationen i et forhold på 6 til 1,8 mikromolær udviste den højeste cellelevedygtighed. Cellelevedygtigheden af de to kombinationer på de skadede PC12-celler blev signifikant fremmet, og komponentkombinationen var bedre end præparatkombinationen.Apoptosehastigheden viste, at procentdelene af tidlige, sene og totale apoptotiske celler var signifikant højere i modelgruppen end i den normale gruppe. Sammenlignet med modelgruppen var procentdelene af apoptotiske celler på hvert trin signifikant lavere i behandlingsgruppen. Fluorescensintensiteten af caspase-3 var signifikant lavere i hver behandlingsgruppe sammenlignet med modelgruppen og var relativt lavere i komponentkombinationsgruppen.Relativ ekspression af generne Akt, Bcl-2 og Bax afslørede, at komponentkombinationen er bedre end præparatkombinationen til at fremme celleoverlevelse, hvilket er relateret til den stærkere anti-apoptose effekt. Komponentkombinationen udviste en bedre antioxidativ skadevirkning end præparatkombinationen og signifikant højere ekspression af Nrf2-proteinet. Denne metode kan bruges til at screene og evaluere komponentkombinationen med andre potentielle farmakologiske aktiviteter fra urtekombinationen, såsom antiinflammatorisk, antibakteriel og mere.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Catheter Ablation in Combination With Left Atrial Appendage Closure for Atrial Fibrillation

Kateter ablation I kombination med venstre forkammer vedhæng Lukning for atrieflimren

Atrial fibrillation (AF) is the most common sustained cardiac arrhythmia, affecting millions of individuals worldwide 1-3. The rapid, irregular, and ...

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Måling og behandling af Suppression i Amblyopi

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, karakterisering og sammenlignende differentiering af humane Dental Pulp stamceller fra blivende tænder ved hjælp af to forskellige metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Dual-phase Cone-beam Computed Tomography to See, Reach, and Treat Hepatocellular Carcinoma during Drug-eluting Beads Transarterial Chemo-embolization

The advent of cone-beam computed tomography (CBCT) in the angiography suite has been revolutionary in interventional radiology. CBCT offers 3 ...

Tumor Treating Field Therapy in Combination with Bevacizumab for the Treatment of Recurrent Glioblastoma

Tumor Behandling Field Therapy sammen med bevacizumab til behandling af recidiverende glioblastoma

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studere i bugspytkirtlen Kræft stamceller Karakteristik for udvikling af nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Development of Recombinant Proteins to Treat Chronic Pain

Udvikling af rekombinante proteiner til behandling af kroniske smerter

Chronic pain is difficult to treat and new approaches to resolve persistent pain are urgently needed. Anti-inflammatory cytokines are promising candidates ...

Three-Dimensional Collagen Matrix Scaffold Implantation as a Liver Regeneration Strategy

Tre-dimensionelle kollagen Matrix Stillads implantation som en lever regenerering strategi

Liver diseases are the leading cause of death worldwide. Excessive alcohol consumption, a high-fat diet, and hepatitis C virus infection promote fibrosis, ...

Vessel-Sparing Microsurgical Longitudinal Intussusception Vasoepididymostomy to Treat Epididymal Obstructive Azoospermia

Fartøjsbesparende mikrokirurgisk langsgående intussusception vasoepididymostomi til behandling af epididymal obstruktiv azoospermi

The epididymis is a common site of obstruction in obstructive azoospermia (OA). Vasoepididymostomy has become an important method for the treatment of ...