Name: exploring the two herb combination strategy to treat injured pc12 cells
Uploaded: 2022-11-18T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells at JoVE.com

Cette recherche a été financée par des projets clés de R & D du Département provincial de la science et de la technologie du Sichuan (2020YFS0325).

1. Préparation du réactif
<ol><li>Préparer le milieu complet en ajoutant 90 mL de DMEM à teneur élevée en sucre, 10 mL de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 mL de solution de pénicilline-streptomycine dans une fiole de culture stérile de 125 mL. Mélanger le milieu complet et conserver à 4 °C dans des conditions fermées.</li>
	<li>Préparer la solution de CoCl 2 en ajoutant 0,02 g de poudre de CoCl2 (pesée avec précision) dans 10 mL de milieu sans sucre DMEM (complètement dissous) ...

<ol>
	<li>Mendelevich, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cerebral+ischemia,+and+dizziness.">Chronic cerebral ischemia, and dizziness.</a> Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).</li><li>Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+on+the+diagnosis+and+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+integrated+traditional+Chinese+and+western+medicine.">Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine.</a> Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).</li><li>Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+treatment+of+45+cases+of+cerebral+infarction+with+Astragalus+and+Dengzhan+Xixin+injection.">Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection.</a> Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).</li><li>Bei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+study+of+Dengzhanxixin+injection+combined+with+Astragalus+injection+in+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke.">Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke.</a> Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).</li><li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+ratio+of+Astragalus+injection+combined+with+Dengzhan+Xixin+injection+against+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+rats+by+baseline+equal-ratio+increase-decrease+design+method.">Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method.</a> China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+and+mechanism+of+Astragalus+combined+with+Erigeron+breviscapusin+the+best+proportion+on+cerebral+ischemia+rats.">Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+oxidative+damage+of+PC12+cells+with+hypoxia+and+hypoglycemia+based+on+the+combination+of+Astragalus+and+Dengzhan+Asarum+based+on+the+Nrf2/HO-1+pathway.">Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).</li><li>. Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I Available from: <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69</a> (2020)</li><li>. Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I Available from: <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8</a> (2020)</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linoleyltyrosine+protects+PC12+cells+against+oxidative+damage+via+autophagy:+Possible+involvement+of+CB1+receptor+regulation.">N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gab1+regulates+SDF-1-induced+progression+via+inhibition+of+apoptosis+pathway+induced+by+PI3K/AKT/Bcl-2/BAX+pathway+in+human+chondrosarcoma.">Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma.</a> Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).</li><li>Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Asarone+ameliorates+&#946;-Amyloid-induced+neurotoxicity+in+PC12+cells+by+activating+P13K/Akt/Nrf2+signaling+pathway.">&#946;-Asarone ameliorates &#946;-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).</li><li>Li, J., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+traditional+Chinese+and+western+medicine.">Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine.</a> Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).</li><li>Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discussion+on+the+therapeutic+value+of+traditional+Chinese+medicine+on+cognitive+dysfunction+caused+by+chronic+cerebral+ischemia.">Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia.</a> Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).</li><li>Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+research+on+pharmacological+and+neuroprotective+effects+of+traditional+Chinese+medicine+after+cerebral+ischemia.">Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia.</a> China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).</li><li>Wang, N., Sun, H., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+doses+of+astragalus+injection+on+neurological+rehabilitation+of+stroke+patients.">Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients.</a> Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).</li><li>Sun, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+astragalus+injection+on+apoptosis+after+cerebral+ischemia-reperfusion+in+rats.">Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats.</a> Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengzhan+Xixin+injection+derived+from+a+traditional+Chinese+herb+Erigeron+breviscapusameliorates+cerebral+ischemia/reperfusion+injury+in+rats+via+modulation+of+mitophagy+and+mitochondrial+apoptosis.">Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).</li><li>Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+research+progress+of+Dengzhanhua+preparation+in+prevention+and+treatment+of+ischemic+stroke+and+transient+ischemic+attack.">Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack.</a> Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).</li><li>Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+chronic+ethanol+consumption+on+apoptosis+and+autophagy+following+transient+focal+cerebral+ischemia+in+male+mice.">Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).</li><li>El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chrysin+attenuates+global+cerebral+ischemic+reperfusion+injury+via+suppression+of+oxidative+stress,+inflammation+and+apoptosis.">Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis.</a> Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).</li><li>Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+breviscapine+aglycone+on+PI+3+K/Akt+conduction+pathway+in+neonatal+rats+with+hypoxic-ischemic+brain+injury.">Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury.</a> Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).</li><li>Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-22+exerts+its+neuroprotective+and+angiogenic+functions+via+regulating+PI3K/Akt+signaling+pathway+in+cerebral+ischemia-reperfusion+rats).">MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats).</a> Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).</li><li>Luca, M., Luca, A., Calandra, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+damage+in+the+pathogenesis+and+progression+of+alzheimer's+disease+and+vascular+dementia.">The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupeol+alleviates+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+correlation+with+modulation+of+PI3K/Akt+pathway.">Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+phosphocreatine+on+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+induced+apoptosis+in+vitro+and+in+vivo:+Involvement+of+dual+PI3K/Akt+and+Nrf2/HO-1+pathways.">Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways.</a> Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).</li><li>Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J., Ch&#225;nez-C&#225;rdenas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cobalt+chloride+as+a+chemical+hypoxia+model.">The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).</li><li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside+attenuates+CoCl2-simulated+hypoxia+injury+in+PC12+cells+partly+by+mitochondrial+protection.">Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection.</a> European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).</li><li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+potency+of+Tofu+bio-processed+using+Actinomucor+elegans+against+hypoxic+injury+induced+by+cobalt+chloride+in+PC12+cells.">Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells.</a> Molecules. 26 (10), 2983 (2021).</li></ol>

Il y a encore un manque de médicaments idéaux pour le traitement de l’ischémie cérébrale dans la pratique clinique moderne2. Sous la direction de la supplémentation en qi et de l’activation de la méthode de circulation sanguine, Ast, Eri et d’autres préparations ont été utilisés en combinaison dans la pratique clinique de la MTC et ont obtenu de bons avantages complets13,14,15. Un grand n...

L’ischémie cérébrale chronique, causée par l’hypoperfusion cérébrale, est une maladie fréquente chez les personnes d’âge moyen et les personnes âgées1. En tant que maladie d’ischémie occulte à long terme, elle peut entraîner un dysfonctionnement neurologique progressif ou persistant. Les principaux mécanismes pathologiques comprennent l’apoptose cellulaire et les dommages oxydatifs, conduisant à un dysfonctionnement neurologique progressif ou persistant; c’est la base pathologique de la maladie d’Alzheimer, de la démence vasculaire et d’autres maladies, et affecte gravement la qualité de vie des patients. Cependant, il y a encore un manque de médicaments idéaux dans la médecine moderne pour traiter l’ischémie cérébrale chronique2. Dans le même temps, la combinaison d’Astragalus mongholicus (Ast) et d’Erigeron breviscapus (Eri) a été largement utilisée dans la pratique clinique de la médecine traditionnelle chinoise (MTC)4. La stratégie de combinaison s’est remarquablement améliorée pour favoriser la récupération de la fonction nerveuse après une ischémie cérébrale, ce qui est meilleur que celui d’un seul médicament; Cependant, il existe de grandes différences dans le rapport posologique dans la combinaison des deux médicaments4. Les composants efficaces et le mécanisme d’action ne sont pas bien définis, ce qui est la question clé limitant son application clinique.
Des études antérieures ont démontré l’effet synergique de la combinaison de préparation d’Ast injection et d’Eri injection dans le traitement de l’ischémie cérébrale chez le rat. Il peut réguler positivement l’expression de la protéine p-Akt et réguler à la baisse l’expression dela protéine 5,6 promotrice de la mort associée à Bcl-2 (BAD), qui est l’une des protéines de la famille B-lymphoblastome 2 (Bcl-2) et a pour effet de favoriser l’apoptose. Cependant, la base matérielle et le mécanisme de son effet synergique ne sont pas clairs. En outre, le modèle de lésion des cellules PC12 a été établi avec un milieu sans glucose combiné CoCl2, et la combinaison optimale de composants dans Ast et Eri a été examinée et définie7.
Dans cette étude, les doses efficaces d’Ast et d’Eri sont examinées à l’aide du modèle de cellules PC12 blessées. La combinaison optimale des deux médicaments est examinée à l’aide de ce modèle combiné à la méthode de conception homogène. Le modèle cellulaire est utilisé pour évaluer davantage la différence dans les effets et les mécanismes de la combinaison de préparation et de la combinaison de composants dans les cellules PC12 lésées. Cette stratégie vise à explorer l’effet protecteur et le mécanisme de régulation des deux types de combinaisons sur les cellules PC12 lésées par la voie du signal PI3K / Akt / Nrf2 afin de déterminer le meilleur mode de combinaison. Cette étude fournit une référence pour optimiser le meilleur mode d’application de la MTC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1300 series class II biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>1374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>1334GR001</td>
			<td>MTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACEA NovoExpress&#160;1.4.0</td>
			<td>ACEA Biosciences, Inc</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>10176-2-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical flow cytometry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>62-2-1810-1027-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC apoptosis detection kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>C1062L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astragalus injection</td>
			<td>Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company</td>
			<td>A03190612144</td>
			<td>Ast injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astragaloside A</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>84687-43-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bax</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>60267-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl-2</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>26593-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>0816-2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-3</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>19677-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorogenic acid</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>327-97-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck Biotechnology, Inc.</td>
			<td>7791-13-1</td>
			<td>CoCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>2020112701</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2020090101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high sugar medium</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>2110050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM sugar free medium</td>
			<td>Beijing Solarbio life sciences Company</td>
			<td>2029548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL luminous fluid</td>
			<td>Lianshuo Biological Company</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>FA1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis instrument</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>1658026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erigeron breviscapus capsule</td>
			<td>Yunnan Biogu Pharmaceutical Company</td>
			<td>Z53021671</td>
			<td>Eri capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Four Seasons Institute of Biological Engineering</td>
			<td>20210402</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympms Corporation</td>
			<td>IX71-F32PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>SA00001- 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBM SPSS Statistics version 26.0</td>
			<td>International Business Machines Corporation, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ 1.8.0</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunol&#160;fluorescence&#160;staining kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2021070901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.</td>
			<td>HH35L2018296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motic Inverted microscope</td>
			<td>Nanda Scientific Instruments Co.</td>
			<td>AE2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2014081301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat milk</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>16396-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-Akt</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>66444-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC12 cells</td>
			<td>Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>CBP60430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase protease inhibitor mixture</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2015082901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive oxygen species assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RI-PA lysis solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scutellarin</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>27740-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample loading buffer, 5x</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter tips (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Merck Biotechnology, Inc.</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>1115GR500&#160;</td>
			<td>TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>J190013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2021051301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex oscillator</td>
			<td>OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>VXMNAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>66009-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the two herb combination strategy to treat injured pc12 cells

Compte tenu des avantages de la combinaison de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) dans le traitement de l’ischémie cérébrale, nous avons étudié les différences d’efficacité et de mécanisme entre la combinaison de préparation et la combinaison de composants afin d’explorer la stratégie de combinaison à deux herbes pour traiter les cellules PC12 blessées. Le chlorure de cobalt (CoCl2) combiné à un milieu sans glucose a été utilisé pour induire des dommages oxydatifs des cellules PC12. Ensuite, la combinaison optimale d’Astragalus mongholicus (Ast) et d’Erigeron breviscapus (Eri) injection a été sélectionnée et combinée selon des méthodes de conception uniformes après criblage de leur concentration sûre et efficace sur les cellules PC12. En outre, la combinaison de composants criblés comprend 10 μM d’astragaloside A, 40 μM de scutellarine et 75 μM d’acide chlorogénique dans deux herbes. Ensuite, le MTT, l’annexine V-FITC/PI, l’immunofluorescence et l’analyse par transfert Western ont été utilisés pour évaluer l’efficacité et le mécanisme de la combinaison de préparations et de la combinaison de composants sur les cellules PC12 lésées. Les résultats ont montré que la combinaison de préparation optimale pour la survie cellulaire pro-était l’injection d’Ast et la capsule d’Eri avec une concentration de 6: 1,8 (μM). La combinaison de composants (10 μM d’astragaloside A, 40 μM de scutellarin, et 75 μM d’acide chlorogénique) était plus efficace que la combinaison de préparation. Les deux combinaisons ont remarquablement réduit le taux apoptotique, l’intensité de fluorescence de la caspase-3 et le niveau intracellulaire d’espèces réactives de l’oxygène (ROS); pendant ce temps, ils ont régulé à la hausse les niveaux d’expression de p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax et Nrf2. Ces effets étaient plus évidents dans la combinaison de composants. En conclusion, les deux combinaisons peuvent inhiber la lésion induite par CoCl2 combiné avec un milieu sans glucose sur les cellules PC12, favorisant ainsi la survie cellulaire. Cependant, l’efficacité de la combinaison de composants par rapport à la combinaison de préparation peut être due à sa régulation plus forte de la voie de signalisation PI3K / Akt / Nrf2 liée au stress oxydatif et à l’apoptose.

Le dépistage de la combinaison optimale d’Ast injection et de capsule Eri est illustré à la figure 1. Le taux de survie cellulaire de l’injection d’Ast et de la capsule Eri sur les cellules PC12 normales est illustré à la figure 1A. La viabilité cellulaire était inférieure à 95 % avec l’injection d’Ast à des concentrations supérieures à 12 μM (figure 1A) et la capsule Eri à des concentrations supérieures à 5 μM (f...

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Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells

Ce protocole fournit une stratégie de combinaison de deux herbes pour traiter les cellules PC12 blessées. Le protocole fournit une référence pour optimiser le meilleur mode d’application de la médecine traditionnelle chinoise (MTC).

Explorer la stratégie de combinaison de deux herbes pour traiter les cellules PC12 blessées

In view of the advantages of the combination of traditional Chinese medicine (TCM) in the treatment of cerebral ischemia, we studied the differences in ...

Le protocole de cette étude fournit une stratégie de combinaison de deux herbes pour traiter les cellules PC12 endommagées par l’hypoxie, et une référence pour optimiser le meilleur mode de combinaison d’herbes. Cette technique peut fournir une méthode expérimentale in vitro simple, fiable et efficace pour cribler la combinaison d’ingrédients efficaces à partir d’herbes, contre les cellules hypoxiales. Cette stratégie peut également être appliquée pour cribler les combinaisons de composants contre les cellules hypoxieuses d’autres combinaisons de préparation d’herbes, et illustrer leur mécanisme de protection.Pour commencer, sous-culture des cellules PC12 tous les deux à trois jours à 37 degrés Celsius dans un incubateur supplémenté en 5% de dioxyde de carbone pour obtenir un passage de 4 à 8 pour toutes les expériences ultérieures. Traiter 70 à 80% de cellules PC12 confluentes avec un millilitre de trypsine 0,25% et observer les cellules au microscope pour le décollement cellulaire. Ensuite, arrêtez la digestion de la trypsine en ajoutant trois millilitres du milieu complet.Faites tourner les cellules transférées dans un tube centrifuge de 15 millilitres à 840 x g pendant cinq minutes. Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension la pastille de cellule avec le milieu complet et transférer la suspension de cellule dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Pour compter les cellules, démarrez le logiciel de cytométrie en flux et sélectionnez le multiple de dilution correspondant de la solution cellulaire dans le paramètre de comptage.Cliquez sur Tableau de densité après avoir chargé l’échantillon de cellule. Encerclez la population cellulaire loin de l’axe des x et de l’axe des y. Cliquez avec le bouton droit sur le tableau de données sous la figure et sélectionnez X, Y, Count et Abs.Count pour obtenir les résultats du comptage de cellules sous le tableau de données de Abs.Count. Après avoir ajusté la concentration cellulaire environ à 1 fois 10 à 5ème cellules par millilitre avec le milieu complet, ajoutez 100 microlitres de suspension cellulaire par puits à une plaque de 96 puits et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Le lendemain, à la plaque jetée par surnageant, ajoutez 120 microlitres d’un milligramme par millilitre de solution de MTT dans chaque puits et incuber pendant quatre heures à 37 degrés Celsius.Après l’incubation, une fois le surnageant jeté, ajoutez 150 microlitres de DMSO à chaque puits. Maintenir la plaque sous agitation dans un oscillateur vortex pendant 10 minutes à une vitesse de 240 fois par minute. Mesurez ensuite l’absorbance à 490 nanomètres dans un lecteur de microplaques.Pour cribler la combinaison optimale de médicaments par une méthode de conception homogène, cultiver les cellules comme démontré précédemment et traiter les cellules PC12 blessées avec six concentrations de proportion différentes d’injection d’astragale et de capsule de breviscapus. Pour évaluer l’effet protecteur de deux combinaisons optimales, traiter les cellules PC12 blessées avec les deux types de combinaison de médicaments. Incuber les cellules pendant 24 heures et calculer la viabilité cellulaire comme démontré précédemment.Ensemencer les cellules PC12 dans une plaque de 12 puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après un traitement médicamenteux, traiter les cellules avec 250 microlitres de trypsine par puits et centrifuger les cellules à 840 x g pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, remettez en suspension la pastille de cellule avec 500 microlitres de tampon de liaison.Ajouter 5 microlitres d’annexine V-FITC, 10 microlitres d’iodure de propidium en triplicates pour chaque groupe, et incuber les cellules dans l’obscurité pendant 15 minutes à température ambiante pour vérifier l’apoptose en utilisant la cytométrie en flux. Dans le logiciel de cytomètre en flux, cliquez sur Compensation automatique dans le menu Démarrer, sélectionnez FITC, PE, PerCP et APC dans le canal Sélectionner, puis sélectionnez Compensation en hauteur. Cliquez ensuite sur OK dans l’élément statistique : médiane.Cliquez sur Carte de densité et encerclez la population cellulaire effective avec la méthode de comptage de cellules illustrée précédemment. Avec la fluorescence FITC comme paramètre de l’axe des x et d’autres fluorescence comme paramètre de l’axe y, créez une carte de densité. Cliquez sur Matrice de compensation dans le menu Démarrer et Coefficient dans la matrice de débordement.Ensemencer les cellules PC12 dans les lames de couverture placées sur une plaque de 24 puits en trois et incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après le traitement médicamenteux, rincer les lamelles de couverture deux fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune, les fixer avec 4% de paraformaldéhyde pendant 15 minutes et perméabiliser avec 0,5% Triton X-100 pendant 20 minutes à température ambiante. Après avoir rincé les cellules, bloquez-les avec du sérum de chèvre à 10% pendant une heure à température ambiante.Ajouter 200 microlitres d’anticorps primaire dilué caspase-3 à chaque lamelle de couverture et incuber pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Le lendemain, laver trois fois avec un tampon TBST pendant trois minutes chacun, et incuber avec 200 microlitres d’anticorps secondaire pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Après l’incubation, incuber les lamelles de couverture avec 300 microlitres de 0,5 microgramme par millilitre de DAPI pendant 10 minutes et laver les cellules trois fois avec du TBST pendant cinq minutes chacune.Capturez les images de la feuille de couverture sous un microscope à fluorescence et analysez statistiquement l’intensité de fluorescence avec le logiciel d’imagerie. Lavez la couvercle des cellules PC12 traitées trois fois avec du PBS pendant trois minutes chacune et incuber avec 400 microlitres de diacétate de dichloro-dihydro-fluorescéine micromolaire à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Lavez à nouveau les cellules avec du DMEM sans sérum deux fois pendant trois minutes chacune.Ajoutez l’agent de trempe à fluorescence et capturez immédiatement les images de la lamelle de couverture sous un microscope à fluorescence pour calculer l’intensité relative de fluorescence avec le logiciel d’imagerie. Lavez les cellules PC12 traitées par le médicament dans une plaque de 6 puits trois fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune, et incuber sur de la glace pendant 30 minutes dans le tampon de lyse préparé de 100 microlitres par puits. Après lyse, centrifuger les cellules à 16 000 x g pendant 20 minutes à 4 degrés Celsius pour recueillir le surnageant.Après avoir détecté la concentration de protéines par le test Bradford, exécutez une électrophorèse SDS-PAGE à 12% avec 25 microgrammes de protéines dans chaque voie et transférez le gel sur la membrane PVDF. Bloquer les membranes avec 5% de lait écrémé pendant 1,5 heure à température ambiante et incuber avec cinq millilitres des anticorps primaires correspondants pendant 24 heures à 4 degrés Celsius. Après l’incubation et le lavage de la membrane avec TBST trois fois pendant 10 minutes chacun, incuber avec cinq millilitres d’anticorps secondaires conjugués HRP à température ambiante pendant deux heures.Enfin, à la membrane lavée par TBST, ajoutez un substrat HRP chimiluminescent pour la détection des bandes protéiques selon les instructions du fabricant. Capturez ensuite les images à l’aide du système d’imagerie par chimiluminescence pour quantifier les valeurs de gris des protéines, avec la bêta-actine comme contrôle interne. La viabilité cellulaire sur les cellules PC12 normales était inférieure à 95% avec injection d’astragale à des concentrations supérieures à 12 micromolaires et supérieures à 5 micromolaires pour la capsule breviscapus.L’injection d’astragale pourrait améliorer le taux de survie des cellules PC12 blessées dans la plage de concentration de 6 à 12 micromolaires et de la capsule de breviscapus à 2 à 5 micromolaires. Alors que la combinaison de médicaments à un rapport de 6 à 1,8 micromolaire présentait la viabilité cellulaire la plus élevée. La viabilité cellulaire des deux combinaisons sur les cellules PC12 lésées a été significativement favorisée, et la combinaison de composants était supérieure à la combinaison de préparation.Le taux d’apoptose a montré que les pourcentages de cellules apoptotiques précoces, tardives et totales étaient significativement plus élevés dans le groupe témoin que dans le groupe normal. Par rapport au groupe témoin, les pourcentages de cellules apoptotiques à chaque stade étaient significativement plus faibles dans le groupe de traitement. L’intensité de fluorescence de la caspase-3 était significativement plus faible dans chaque groupe de traitement par rapport au groupe témoin, et était relativement plus faible dans le groupe de combinaison de composants.L’expression relative des gènes Akt, Bcl-2 et Bax a révélé que la combinaison de composants est supérieure à la combinaison de préparation pour favoriser la survie cellulaire, ce qui est lié à l’effet anti-apoptose plus fort. La combinaison de composants a montré un meilleur effet anti-oxydatif que celui de la combinaison de préparation, et une expression significativement plus élevée de la protéine Nrf2. Cette méthode peut être utilisée pour dépister et évaluer la combinaison de composants avec d’autres activités pharmacologiques potentielles de la combinaison d’herbes, telles que les anti-inflammatoires, les antibactériens, etc.

Research

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