Name: exploring the two herb combination strategy to treat injured pc12 cells
Uploaded: 2022-11-18T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי פרויקטי מו"פ מרכזיים של המחלקה למדע וטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן (2020YFS0325).

1. הכנת מגיב
<ol><li>הכן את המדיום המלא על ידי הוספת 90 מ"ל של DMEM מדיום סוכר גבוה, 10 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), ו 1 מ"ל של תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין בבקבוק תרבית סטרילית 125 מ"ל. יש לערבב את המדיום המלא ולאחסן בטמפרטורה של 4°C בתנאים סגורים.</li>
	<li>הכן תמיסת CoCl 2 על ידי הוספת 0.02 גרם אבקת CoCl<...

<ol>
	<li>Mendelevich, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cerebral+ischemia,+and+dizziness.">Chronic cerebral ischemia, and dizziness.</a> Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).</li><li>Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+on+the+diagnosis+and+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+integrated+traditional+Chinese+and+western+medicine.">Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine.</a> Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).</li><li>Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+treatment+of+45+cases+of+cerebral+infarction+with+Astragalus+and+Dengzhan+Xixin+injection.">Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection.</a> Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).</li><li>Bei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+study+of+Dengzhanxixin+injection+combined+with+Astragalus+injection+in+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke.">Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke.</a> Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).</li><li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+ratio+of+Astragalus+injection+combined+with+Dengzhan+Xixin+injection+against+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+rats+by+baseline+equal-ratio+increase-decrease+design+method.">Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method.</a> China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+and+mechanism+of+Astragalus+combined+with+Erigeron+breviscapusin+the+best+proportion+on+cerebral+ischemia+rats.">Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+oxidative+damage+of+PC12+cells+with+hypoxia+and+hypoglycemia+based+on+the+combination+of+Astragalus+and+Dengzhan+Asarum+based+on+the+Nrf2/HO-1+pathway.">Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).</li><li>. Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I Available from: <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69</a> (2020)</li><li>. Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I Available from: <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8</a> (2020)</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linoleyltyrosine+protects+PC12+cells+against+oxidative+damage+via+autophagy:+Possible+involvement+of+CB1+receptor+regulation.">N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gab1+regulates+SDF-1-induced+progression+via+inhibition+of+apoptosis+pathway+induced+by+PI3K/AKT/Bcl-2/BAX+pathway+in+human+chondrosarcoma.">Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma.</a> Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).</li><li>Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Asarone+ameliorates+&#946;-Amyloid-induced+neurotoxicity+in+PC12+cells+by+activating+P13K/Akt/Nrf2+signaling+pathway.">&#946;-Asarone ameliorates &#946;-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).</li><li>Li, J., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+traditional+Chinese+and+western+medicine.">Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine.</a> Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).</li><li>Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discussion+on+the+therapeutic+value+of+traditional+Chinese+medicine+on+cognitive+dysfunction+caused+by+chronic+cerebral+ischemia.">Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia.</a> Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).</li><li>Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+research+on+pharmacological+and+neuroprotective+effects+of+traditional+Chinese+medicine+after+cerebral+ischemia.">Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia.</a> China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).</li><li>Wang, N., Sun, H., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+doses+of+astragalus+injection+on+neurological+rehabilitation+of+stroke+patients.">Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients.</a> Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).</li><li>Sun, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+astragalus+injection+on+apoptosis+after+cerebral+ischemia-reperfusion+in+rats.">Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats.</a> Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengzhan+Xixin+injection+derived+from+a+traditional+Chinese+herb+Erigeron+breviscapusameliorates+cerebral+ischemia/reperfusion+injury+in+rats+via+modulation+of+mitophagy+and+mitochondrial+apoptosis.">Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).</li><li>Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+research+progress+of+Dengzhanhua+preparation+in+prevention+and+treatment+of+ischemic+stroke+and+transient+ischemic+attack.">Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack.</a> Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).</li><li>Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+chronic+ethanol+consumption+on+apoptosis+and+autophagy+following+transient+focal+cerebral+ischemia+in+male+mice.">Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).</li><li>El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chrysin+attenuates+global+cerebral+ischemic+reperfusion+injury+via+suppression+of+oxidative+stress,+inflammation+and+apoptosis.">Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis.</a> Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).</li><li>Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+breviscapine+aglycone+on+PI+3+K/Akt+conduction+pathway+in+neonatal+rats+with+hypoxic-ischemic+brain+injury.">Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury.</a> Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).</li><li>Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-22+exerts+its+neuroprotective+and+angiogenic+functions+via+regulating+PI3K/Akt+signaling+pathway+in+cerebral+ischemia-reperfusion+rats).">MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats).</a> Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).</li><li>Luca, M., Luca, A., Calandra, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+damage+in+the+pathogenesis+and+progression+of+alzheimer's+disease+and+vascular+dementia.">The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupeol+alleviates+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+correlation+with+modulation+of+PI3K/Akt+pathway.">Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+phosphocreatine+on+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+induced+apoptosis+in+vitro+and+in+vivo:+Involvement+of+dual+PI3K/Akt+and+Nrf2/HO-1+pathways.">Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways.</a> Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).</li><li>Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J., Ch&#225;nez-C&#225;rdenas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cobalt+chloride+as+a+chemical+hypoxia+model.">The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).</li><li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside+attenuates+CoCl2-simulated+hypoxia+injury+in+PC12+cells+partly+by+mitochondrial+protection.">Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection.</a> European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).</li><li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+potency+of+Tofu+bio-processed+using+Actinomucor+elegans+against+hypoxic+injury+induced+by+cobalt+chloride+in+PC12+cells.">Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells.</a> Molecules. 26 (10), 2983 (2021).</li></ol>

עדיין חסרות תרופות אידיאליות לטיפול באיסכמיה מוחית בפרקטיקה הקלינית המודרנית2. בהנחיית תוספת צ'י והפעלת שיטת זרימת הדם, אסט, ארי ותכשירים אחרים שימשו בשילוב בפרקטיקה הקלינית של TCM והשיגו יתרונות מקיפים טובים13,14,15. מספר רב של ?...

איסכמיה מוחית כרונית, הנגרמת על ידי היפופרפוזיה מוחית, היא מחלה שכיחה בקרב אנשים בגיל העמידה וקשישים1. כמחלת איסכמיה סמויה ארוכת טווח, היא עלולה להוביל לתפקוד נוירולוגי מתקדם או מתמשך. המנגנונים הפתולוגיים העיקריים כוללים אפופטוזיס של תאים ונזק חמצוני, המוביל לתפקוד נוירולוגי מתקדם או מתמשך; זהו הבסיס הפתולוגי של מחלת אלצהיימר, דמנציה וסקולרית ומחלות אחרות, ומשפיע קשות על איכות החיים של החולים. עם זאת, עדיין חסרות תרופות אידיאליות ברפואה המודרנית לטיפול באיסכמיה מוחית כרונית2. במקביל, השילוב של Astragalus mongholicus (Ast) ו- Erigeron breviscapus (Eri) נמצא בשימוש נרחב בפרקטיקה הקלינית של הרפואה הסינית המסורתית (TCM)4. האסטרטגיה המשולבת השתפרה להפליא בקידום התאוששות תפקוד העצבים לאחר איסכמיה מוחית, שהיא טובה יותר מזו של תרופה בודדת; עם זאת, ישנם הבדלים גדולים ביחס המינון בשילוב של שתי התרופות4. המרכיבים היעילים ומנגנון הפעולה אינם מוגדרים היטב, וזהו נושא המפתח המגביל את היישום הקליני שלה.
מחקרים קודמים הדגימו את ההשפעה הסינרגיסטית של שילוב ההכנה של הזרקת Ast והזרקת Eri בטיפול באיסכמיה מוחית בחולדות. זה יכול לווסת את הביטוי של חלבון p-Akt ולהפחית את הביטוי של Bcl-2 הקשורים למוות מקדמי מוות (BAD) חלבון5,6, שהוא אחד ממשפחת B-לימפובלסטומה 2 (Bcl-2) חלבונים ויש לו השפעה של קידום אפופטוזיס. עם זאת, הבסיס החומרי והמנגנון של השפעתה הסינרגטית אינם ברורים. יתר על כן, מודל הפציעה של תאי PC12 הוקם עם CoCl2 משולב תווך ללא גלוקוז, ושילוב הרכיבים האופטימלי ב- Ast ו- Eri נבדק והוגדר7.
במחקר זה, המינונים היעילים של Ast ו- Eri נבדקים באמצעות מודל תאי PC12 הפגוע. השילוב האופטימלי של שתי התרופות נבדק באמצעות מודל זה בשילוב עם שיטת התכנון ההומוגנית. מודל התא משמש להערכה נוספת של ההבדל בהשפעות ובמנגנונים של שילוב ההכנה ושילוב הרכיבים בתאי PC12 פגועים. אסטרטגיה זו שואפת לחקור את אפקט ההגנה ואת מנגנון הבקרה של שני סוגי הצירופים על תאי PC12 פגועים באמצעות מסלול האות PI3K/Akt/Nrf2 כדי לקבוע את מצב השילוב הטוב ביותר. מחקר זה מספק התייחסות למיטוב מצב היישום הטוב ביותר של TCM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1300 series class II biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>1374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>1334GR001</td>
			<td>MTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACEA NovoExpress&#160;1.4.0</td>
			<td>ACEA Biosciences, Inc</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>10176-2-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical flow cytometry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>62-2-1810-1027-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC apoptosis detection kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>C1062L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astragalus injection</td>
			<td>Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company</td>
			<td>A03190612144</td>
			<td>Ast injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astragaloside A</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>84687-43-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bax</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>60267-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl-2</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>26593-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>0816-2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-3</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>19677-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorogenic acid</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>327-97-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck Biotechnology, Inc.</td>
			<td>7791-13-1</td>
			<td>CoCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>2020112701</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2020090101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high sugar medium</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>2110050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM sugar free medium</td>
			<td>Beijing Solarbio life sciences Company</td>
			<td>2029548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL luminous fluid</td>
			<td>Lianshuo Biological Company</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>FA1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis instrument</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>1658026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erigeron breviscapus capsule</td>
			<td>Yunnan Biogu Pharmaceutical Company</td>
			<td>Z53021671</td>
			<td>Eri capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Four Seasons Institute of Biological Engineering</td>
			<td>20210402</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympms Corporation</td>
			<td>IX71-F32PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>SA00001- 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBM SPSS Statistics version 26.0</td>
			<td>International Business Machines Corporation, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ 1.8.0</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunol&#160;fluorescence&#160;staining kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2021070901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.</td>
			<td>HH35L2018296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motic Inverted microscope</td>
			<td>Nanda Scientific Instruments Co.</td>
			<td>AE2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2014081301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat milk</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>16396-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-Akt</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>66444-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC12 cells</td>
			<td>Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>CBP60430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase protease inhibitor mixture</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2015082901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive oxygen species assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RI-PA lysis solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scutellarin</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>27740-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample loading buffer, 5x</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter tips (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Merck Biotechnology, Inc.</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>1115GR500&#160;</td>
			<td>TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>J190013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2021051301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex oscillator</td>
			<td>OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>VXMNAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>66009-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the two herb combination strategy to treat injured pc12 cells

לאור יתרונות השילוב של הרפואה הסינית המסורתית (TCM) בטיפול באיסכמיה מוחית, חקרנו את ההבדלים ביעילות ובמנגנון בין שילוב התכשיר לשילוב הרכיבים על מנת לבחון את אסטרטגיית שילוב שני צמחי המרפא לטיפול בתאי PC12 פגועים. קובלט כלוריד (CoCl2) בשילוב עם מדיום נטול גלוקוז שימש כדי לגרום נזק חמצוני של תאי PC12. לאחר מכן, השילוב האופטימלי של הזרקת Astragalus mongholicus (Ast) והזרקת Erigeron breviscapus (Eri) נבחר ושולב בשיטות עיצוב אחידות לאחר סינון הריכוז הבטוח והיעיל שלהם על תאי PC12. יתר על כן, שילוב הרכיבים שנבדק כולל 10 מיקרומטר אסטרגלוסיד A, 40 מיקרומטר סקוטלרין, ו 75 מיקרומטר חומצה כלורוגנית בשני עשבי תיבול. לאחר מכן, MTT, Annexin V-FITC/PI, immunofluorescence, וניתוח כתמים מערביים שימשו להערכת היעילות והמנגנון של שילוב ההכנה ושילוב הרכיבים על תאי PC12 פגועים. התוצאות הראו כי שילוב ההכנה האופטימלי להישרדות תאים היה הזרקת Ast וקפסולה Eri עם ריכוז של 6:1.8 (μM). שילוב הרכיבים (10 מיקרומטר אסטרגלוסיד A, 40 מיקרומטר סקוטלרין ו-75 מיקרומטר חומצה כלורוגנית) היה יעיל יותר משילוב ההכנה. שני הצירופים הפחיתו במידה ניכרת את קצב האפופטוטי, את עוצמת הפלואורסצנטיות של קספאז-3 ואת רמת החמצן הריאקטיבי התוך-תאי (ROS); בינתיים, הם שיפרו את רמות הביטוי של p-Akt/Akt, Bcl-2/Bax ו-Nrf2. השפעות אלה ניכרו יותר בשילוב הרכיבים. לסיכום, שני השילובים יכולים לעכב את הפגיעה הנגרמת על ידי CoCl2 בשילוב עם תווך ללא גלוקוז על תאי PC12, ובכך לקדם את הישרדות התא. עם זאת, היעילות של שילוב הרכיבים על פני שילוב ההכנה עשויה לנבוע מהוויסות החזק יותר של מסלול האיתות PI3K/Akt/Nrf2 הקשור לעקה חמצונית ואפופטוזיס.

בדיקת השילוב האופטימלי של הזרקת Ast וקפסולת Eri מוצגת באיור 1. שיעור הישרדות התאים של הזרקת Ast וכמוסת Eri על תאי PC12 רגילים מוצג באיור 1A. כדאיות התא הייתה נמוכה מ-95% עם הזרקת Ast בריכוזים גדולים מ-12 מיקרומטר (איור 1A) וקפסולת Eri בריכוזים גדולים מ-5 מיקרומטר (?...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells at JoVE.com

Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells

פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה משולבת של שני צמחי מרפא לטיפול בתאי PC12 פגועים. הפרוטוקול מספק סימוכין לאופטימיזציה של מצב היישום הטוב ביותר של הרפואה הסינית המסורתית (TCM).

בחינת האסטרטגיה המשולבת של שני צמחי מרפא לטיפול בתאי PC12 פצועים

In view of the advantages of the combination of traditional Chinese medicine (TCM) in the treatment of cerebral ischemia, we studied the differences in ...

הפרוטוקול במחקר זה מספק אסטרטגיה משולבת של שני צמחי מרפא לטיפול בתאי PC12 שניזוקו מהיפוקסיה, והתייחסות למיטוב המצב המשולב הטוב ביותר של צמחי מרפא. טכניקה זו יכולה לספק שיטה ניסיונית פשוטה, אמינה ויעילה במבחנה לסינון שילוב המרכיבים היעיל מצמחי מרפא, כנגד תאים היפוקסיאליים. אסטרטגיה זו יכולה להיות מיושמת גם כדי לסנן את שילובי המרכיבים כנגד תאים היפוקסיאליים משילובי הכנת צמחים אחרים, ולהמחיש את מנגנון ההגנה שלהם.כדי להתחיל, תת-תרבית של תאי PC12 כל יומיים-שלושה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור בתוספת 5% פחמן דו חמצני כדי לקבל מעבר של 4 עד 8 עבור כל הניסויים הבאים. יש לטפל בתאי PC12 בנפח של 70% עד 80% עם מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין, ולצפות בתאים תחת מיקרוסקופ לצורך ניתוק תאים. לאחר מכן לעצור את העיכול טריפסין על ידי הוספת שלושה מיליליטר של המדיום המלא.סובב את התאים המועברים בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר ב 840 x גרם במשך חמש דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, השהה מחדש את גלולת התא עם המדיום המלא והעבר את תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. כדי לספור את התאים, הפעל את תוכנת ציטומטריית הזרימה ובחר את מכפילת הדילול המתאימה של תמיסת התא בהגדרת הספירה.לחץ על תרשים צפיפות לאחר טעינת דוגמת התא. הקיפו את אוכלוסיית התאים הרחק מציר ה-x ומציר ה-y. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על טבלת הנתונים מתחת לאיור ובחר X, Y, Count ו- ABS.ספור כדי לקבל את תוצאות ספירת התאים תחת טבלת הנתונים של Abs.Count. לאחר התאמת ריכוז התא בערך עד 1 כפול 10 לתאים 5 למיליליטר עם המדיום המלא, להוסיף 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר לצלחת 96 באר ולדגור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות. למחרת, לצלחת הסופר-זרוקה מוסיפים 120 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר תמיסת MTT בכל באר, ודגרים במשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, לאחר השלכת הסופרנאטנט, הוסיפו 150 מיקרוליטר DMSO לכל באר. שמור את הצלחת תחת רעד במתנד מערבולת במשך 10 דקות במהירות של 240 פעמים בדקה. לאחר מכן מדוד את הספיגה ב 490 ננומטר בקורא microplate.כדי לסנן את השילוב האופטימלי של תרופות בשיטת תכנון הומוגנית, תרבית את התאים כפי שהודגם קודם לכן וטפל בתאי PC12 הפגועים עם שישה ריכוזי פרופורציה שונים של הזרקת אסטרגלוס וקפסולה breviscapus. כדי להעריך את ההשפעה המגנה של שני שילובים אופטימליים, לטפל בתאי PC12 הפגועים עם שני סוגים של שילוב של תרופות. דגרו על התאים במשך 24 שעות וחשבו את כדאיות התא כפי שהודגם קודם לכן.זרעו את תאי PC12 בצלחת של 12 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר הטיפול התרופתי, יש לטפל בתאים עם 250 מיקרוליטר טריפסין לכל באר ולצנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 840 x גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן להשעות מחדש את גלולת התא עם 500 מיקרוליטר של חיץ קשירה.הוסף 5 מיקרוליטר של Annexin V-FITC, 10 מיקרוליטר של יודיד פרופידיום בטריפליקט לכל קבוצה, ודגר על התאים בחושך במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לבדוק אפופטוזיס באמצעות ציטומטריית זרימה. בתוכנת ציטומטר הזרימה, לחץ על פיצוי אוטומטי בתפריט התחלה, בחר FITC, PE, PerCP ו- APC בערוץ בחר ובחר פיצוי בגובה. לאחר מכן לחץ על אישור בפריט סטטיסטי:חציון.לחץ על מפת צפיפות והקף בעיגול את אוכלוסיית התאים האפקטיבית באמצעות שיטת ספירת התאים שהודגמה קודם לכן. עם פלואורסצנטיות FITC כפרמטר ציר x ופלואורסצנטיות אחרת כפרמטר ציר y, צור מפת צפיפות. לחץ על מטריצת פיצוי בתפריט התחלה ומקדם במטריצת הגלישה.זרעו את תאי PC12 לכיסויים שהונחו על צלחת של 24 בארות היטב בטריפליקטים, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר הטיפול התרופתי, שטפו את הכיסויים פעמיים עם PBS במשך חמש דקות כל אחד, תקנו אותם עם 4% פרפורמאלדהיד למשך 15 דקות, וחדרו עם 0.5% Triton X-100 למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים, חוסמים אותם בסרום 10% עיזים למשך שעה בטמפרטורת החדר.יש להוסיף 200 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מדולל קספאז-3 לכל כיסוי ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך שלוש דקות כל אחת, ודגרו עם 200 מיקרוליטר של נוגדן משני למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר הדגירה, יש לדגור על הכיסויים עם 300 מיקרוליטר של 0.5 מיקרוגרם למיליליטר DAPI למשך 10 דקות, ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם TBST במשך חמש דקות כל אחד.צלם את תמונות הכיסוי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ונתח סטטיסטית את עוצמת הפלואורסצנטיות באמצעות תוכנת ההדמיה. שטפו את כיסוי תאי PC12 שטופל בתרופה שלוש פעמים עם PBS במשך שלוש דקות כל אחד ודגרו עם 400 מיקרוליטר של 10 מיקרומולרי דיכלורו-דיהידרו-פלואורסצאין דיאצטט ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. שטפו שוב את התאים עם DMEM ללא סרום פעמיים במשך שלוש דקות כל אחד.הוסף את חומר המרווה הפלואורסצנטי וצלם מיד את תמונות הכיסוי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לחשב את עוצמת הפלואורסצנטיות היחסית באמצעות תוכנת ההדמיה. שטפו את תאי PC12 שטופלו בתרופות בצלחת בת 6 בארות שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות כל אחת, ודגרו על קרח במשך 30 דקות במאגר הליזיס המוכן של 100 מיקרוליטר לבאר. בעקבות ליזה, צנטריפוגה את התאים ב 16, 000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את supernatant.לאחר זיהוי ריכוז החלבון על ידי בדיקת ברדפורד, הפעל אלקטרופורזה של 12% SDS-PAGE עם 25 מיקרוגרם חלבון בכל נתיב והעבר את הג'ל לקרום PVDF. לחסום את הממברנות עם חלב 5% שומן במשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר, לדגור עם חמישה מיליליטר של נוגדנים ראשוניים המתאימים במשך 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה ושטיפת הממברנה עם TBST שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת, יש לדגור עם חמישה מיליליטר של נוגדנים מצומדים משניים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.לבסוף, לקרום השטוף TBST, הוסף מצע HRP כימילומינסנטי לזיהוי רצועת חלבונים בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן צלם את התמונות באמצעות מערכת ההדמיה הכימילומינסנטית כדי לכמת את הערכים האפורים של החלבונים, עם בטא-אקטין כבקרה פנימית. יכולת הקיום של התא בתאי PC12 הרגילים הייתה נמוכה מ-95% עם הזרקת אסטרגלוס בריכוזים גדולים מ-12 מיקרומולרים, ויותר מ-5 מיקרומולרים עבור קפסולת ה-breviscapus.הזרקת אסטרגלוס יכולה לשפר את שיעור ההישרדות של תאי PC12 הפגועים בטווח ריכוז של 6 עד 12 מיקרומולרים, וקפסולת breviscapus בטווח של 2 עד 5 מיקרומולרית. ואילו שילוב התרופות ביחס של 6 עד 1.8 מיקרומולר הציג את הכדאיות התאית הגבוהה ביותר. יכולת הקיום של שני הצירופים על תאי PC12 הפגועים קודמה באופן משמעותי, ושילוב הרכיבים היה עדיף על שילוב ההכנה.שיעור האפופטוזיס הראה כי אחוזי התאים האפופטוטיים המוקדמים, המאוחרים והכוללים היו גבוהים משמעותית בקבוצת המודל מאשר בקבוצה הרגילה. בהשוואה לקבוצת המודל, אחוזי התאים האפופטוטיים בכל שלב היו נמוכים משמעותית בקבוצת הטיפול. עוצמת הפלואורסצנטיות של קספאז-3 הייתה נמוכה משמעותית בכל קבוצת טיפול בהשוואה לקבוצת המודל, והייתה נמוכה יחסית בקבוצת שילוב הרכיבים.ביטוי יחסי של הגנים Akt, Bcl-2 ו-Bax גילה כי שילוב המרכיבים עדיף על שילוב ההכנה בקידום הישרדות התא, הקשור לאפקט האנטי-אפופטוזיס החזק יותר. שילוב הרכיבים הציג אפקט נזק נוגד חמצון טוב יותר מזה של שילוב ההכנה, וביטוי גבוה משמעותית של חלבון Nrf2. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לסנן ולהעריך את שילוב הרכיבים עם פעילויות פרמקולוגיות פוטנציאליות אחרות משילוב העשבים, כגון אנטי דלקתיות, אנטיבקטריאליות ועוד.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

אסטרטגיה לזהות מוטציות דה נובו בהפרעות נפוצות כגון אוטיזם וסכיזופרניה

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Catheter Ablation in Combination With Left Atrial Appendage Closure for Atrial Fibrillation

אבלציה צנתר בשילוב עם סגירת תוספת פרוזדורי שמאל לפרפור פרוזדורים

Atrial fibrillation (AF) is the most common sustained cardiac arrhythmia, affecting millions of individuals worldwide 1-3. The rapid, irregular, and ...

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

המדידה והטיפול בדיכוי בעין עצלה

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Dual-phase Cone-beam Computed Tomography to See, Reach, and Treat Hepatocellular Carcinoma during Drug-eluting Beads Transarterial Chemo-embolization

Dual-שלב cone-beam טומוגרפיה ממוחשבת לראי, להגיע, ופנק את Hepatocellular Carcinoma במהלך משחררי תרופת חרוזים Transarterial חמו-אמבוליזציה

The advent of cone-beam computed tomography (CBCT) in the angiography suite has been revolutionary in interventional radiology. CBCT offers 3 ...

Tumor Treating Field Therapy in Combination with Bevacizumab for the Treatment of Recurrent Glioblastoma

גידול טיפול שדה תרפיה בשילוב עם Bevacizumab לטיפול החוזר וגליובלסטומה

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Development of Recombinant Proteins to Treat Chronic Pain

פיתוח חומרים לטיפול בכאב כרוני

Chronic pain is difficult to treat and new approaches to resolve persistent pain are urgently needed. Anti-inflammatory cytokines are promising candidates ...

Three-Dimensional Collagen Matrix Scaffold Implantation as a Liver Regeneration Strategy

השתלת פיגומי מטריצת קולגן תלת מימדית כאסטרטגיית התחדשות הכבד

Liver diseases are the leading cause of death worldwide. Excessive alcohol consumption, a high-fat diet, and hepatitis C virus infection promote fibrosis, ...

Vessel-Sparing Microsurgical Longitudinal Intussusception Vasoepididymostomy to Treat Epididymal Obstructive Azoospermia

כלי מיקרוכירורגי חוסך אורך Intussusception Vasoepididymostomy לטיפול אפידידימלי חסימתי אזוספרמיה

The epididymis is a common site of obstruction in obstructive azoospermia (OA). Vasoepididymostomy has become an important method for the treatment of ...