Name: exploring the two herb combination strategy to treat injured pc12 cells
Uploaded: 2022-11-18T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells at JoVE.com

Questa ricerca è stata finanziata da progetti chiave di ricerca e sviluppo del Dipartimento provinciale di scienza e tecnologia del Sichuan (2020YFS0325).

1. Preparazione del reagente
<ol><li>Preparare il terreno completo aggiungendo 90 ml di terreno ad alto contenuto di zucchero DMEM, 10 ml di siero bovino fetale (FBS) e 1 ml di soluzione di penicillina-streptomicina in un matraccio di coltura sterile da 125 ml. Miscelare il mezzo completo e conservare a 4 °C in condizioni chiuse.</li>
	<li>Preparare la soluzione di CoCl 2 aggiungendo 0,02 g di polvere di CoCl2 (accuratamente pesata) in 10 ml di terreno senza zucchero DMEM (comple...

<ol>
	<li>Mendelevich, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cerebral+ischemia,+and+dizziness.">Chronic cerebral ischemia, and dizziness.</a> Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).</li><li>Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+on+the+diagnosis+and+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+integrated+traditional+Chinese+and+western+medicine.">Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine.</a> Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).</li><li>Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+treatment+of+45+cases+of+cerebral+infarction+with+Astragalus+and+Dengzhan+Xixin+injection.">Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection.</a> Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).</li><li>Bei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+study+of+Dengzhanxixin+injection+combined+with+Astragalus+injection+in+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke.">Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke.</a> Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).</li><li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+ratio+of+Astragalus+injection+combined+with+Dengzhan+Xixin+injection+against+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+rats+by+baseline+equal-ratio+increase-decrease+design+method.">Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method.</a> China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+and+mechanism+of+Astragalus+combined+with+Erigeron+breviscapusin+the+best+proportion+on+cerebral+ischemia+rats.">Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+oxidative+damage+of+PC12+cells+with+hypoxia+and+hypoglycemia+based+on+the+combination+of+Astragalus+and+Dengzhan+Asarum+based+on+the+Nrf2/HO-1+pathway.">Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).</li><li>. Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I Available from: <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69</a> (2020)</li><li>. Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I Available from: <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8</a> (2020)</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linoleyltyrosine+protects+PC12+cells+against+oxidative+damage+via+autophagy:+Possible+involvement+of+CB1+receptor+regulation.">N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gab1+regulates+SDF-1-induced+progression+via+inhibition+of+apoptosis+pathway+induced+by+PI3K/AKT/Bcl-2/BAX+pathway+in+human+chondrosarcoma.">Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma.</a> Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).</li><li>Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Asarone+ameliorates+&#946;-Amyloid-induced+neurotoxicity+in+PC12+cells+by+activating+P13K/Akt/Nrf2+signaling+pathway.">&#946;-Asarone ameliorates &#946;-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).</li><li>Li, J., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+traditional+Chinese+and+western+medicine.">Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine.</a> Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).</li><li>Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discussion+on+the+therapeutic+value+of+traditional+Chinese+medicine+on+cognitive+dysfunction+caused+by+chronic+cerebral+ischemia.">Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia.</a> Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).</li><li>Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+research+on+pharmacological+and+neuroprotective+effects+of+traditional+Chinese+medicine+after+cerebral+ischemia.">Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia.</a> China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).</li><li>Wang, N., Sun, H., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+doses+of+astragalus+injection+on+neurological+rehabilitation+of+stroke+patients.">Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients.</a> Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).</li><li>Sun, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+astragalus+injection+on+apoptosis+after+cerebral+ischemia-reperfusion+in+rats.">Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats.</a> Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengzhan+Xixin+injection+derived+from+a+traditional+Chinese+herb+Erigeron+breviscapusameliorates+cerebral+ischemia/reperfusion+injury+in+rats+via+modulation+of+mitophagy+and+mitochondrial+apoptosis.">Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).</li><li>Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+research+progress+of+Dengzhanhua+preparation+in+prevention+and+treatment+of+ischemic+stroke+and+transient+ischemic+attack.">Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack.</a> Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).</li><li>Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+chronic+ethanol+consumption+on+apoptosis+and+autophagy+following+transient+focal+cerebral+ischemia+in+male+mice.">Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).</li><li>El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chrysin+attenuates+global+cerebral+ischemic+reperfusion+injury+via+suppression+of+oxidative+stress,+inflammation+and+apoptosis.">Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis.</a> Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).</li><li>Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+breviscapine+aglycone+on+PI+3+K/Akt+conduction+pathway+in+neonatal+rats+with+hypoxic-ischemic+brain+injury.">Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury.</a> Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).</li><li>Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-22+exerts+its+neuroprotective+and+angiogenic+functions+via+regulating+PI3K/Akt+signaling+pathway+in+cerebral+ischemia-reperfusion+rats).">MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats).</a> Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).</li><li>Luca, M., Luca, A., Calandra, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+damage+in+the+pathogenesis+and+progression+of+alzheimer's+disease+and+vascular+dementia.">The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupeol+alleviates+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+correlation+with+modulation+of+PI3K/Akt+pathway.">Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+phosphocreatine+on+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+induced+apoptosis+in+vitro+and+in+vivo:+Involvement+of+dual+PI3K/Akt+and+Nrf2/HO-1+pathways.">Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways.</a> Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).</li><li>Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J., Ch&#225;nez-C&#225;rdenas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cobalt+chloride+as+a+chemical+hypoxia+model.">The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).</li><li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside+attenuates+CoCl2-simulated+hypoxia+injury+in+PC12+cells+partly+by+mitochondrial+protection.">Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection.</a> European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).</li><li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+potency+of+Tofu+bio-processed+using+Actinomucor+elegans+against+hypoxic+injury+induced+by+cobalt+chloride+in+PC12+cells.">Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells.</a> Molecules. 26 (10), 2983 (2021).</li></ol>

C'è ancora una mancanza di farmaci ideali per il trattamento dell'ischemia cerebrale nella moderna pratica clinica2. Sotto la guida dell'integrazione del qi e dell'attivazione del metodo di circolazione sanguigna, Ast, Eri e altri preparati sono stati utilizzati in combinazione nella pratica clinica della MTC e hanno ottenuto buoni vantaggi globali13,14,15. Un gran numero di studi ha dimostrato che Ast p...

L'ischemia cerebrale cronica, causata da ipoperfusione cerebrale, è una malattia comune nelle persone di mezza età e negli anziani1. Come una malattia da ischemia occulta a lungo termine, può portare a disfunzione neurologica progressiva o persistente. I principali meccanismi patologici includono l'apoptosi cellulare e il danno ossidativo, che portano a disfunzioni neurologiche progressive o persistenti; questa è la base patologica della malattia di Alzheimer, della demenza vascolare e di altre malattie e influisce seriamente sulla qualità della vita dei pazienti. Tuttavia, c'è ancora una mancanza di farmaci ideali nella medicina moderna per trattare l'ischemia cerebrale cronica2. Allo stesso tempo, la combinazione di Astragalus mongholicus (Ast) e Erigeron breviscapus (Eri) è stata ampiamente utilizzata nella pratica clinica della medicina tradizionale cinese (MTC)4. La strategia di combinazione è notevolmente migliorata nel promuovere il recupero della funzione nervosa dopo ischemia cerebrale, che è migliore di quella di un singolo farmaco; Tuttavia, ci sono grandi differenze nel rapporto di dosaggio nella combinazione dei due farmaci4. Le componenti efficaci e il meccanismo d'azione non sono ben definiti, che è il problema chiave che limita la sua applicazione clinica.
Studi precedenti hanno dimostrato l'effetto sinergico della combinazione di preparazione di iniezione di Ast e iniezione di Eri nel trattamento dell'ischemia cerebrale nei ratti. Può sovraregolare l'espressione della proteina p-Akt e downregolare l'espressionedella proteina 5,6 del promotore di morte associato a Bcl-2 (BAD), che è una delle proteine della famiglia del linfoblastoma B 2 (Bcl-2) e ha l'effetto di promuovere l'apoptosi. Tuttavia, la base materiale e il meccanismo del suo effetto sinergico non sono chiari. Inoltre, il modello di lesione delle cellule PC12 è stato stabilito con terreno combinato privo di glucosio CoCl2 e la combinazione ottimale di componenti in Ast ed Eri è stata esaminata e definita7.
In questo studio, le dosi efficaci di Ast ed Eri sono sottoposte a screening utilizzando il modello cellulare PC12 danneggiato. La combinazione ottimale dei due farmaci viene esaminata utilizzando questo modello combinato con il metodo di progettazione omogeneo. Il modello cellulare viene utilizzato per valutare ulteriormente la differenza negli effetti e nei meccanismi della combinazione di preparazione e della combinazione di componenti nelle cellule PC12 danneggiate. Questa strategia mira a esplorare l'effetto protettivo e il meccanismo regolatore dei due tipi di combinazioni su cellule PC12 danneggiate attraverso la via del segnale PI3K / Akt / Nrf2 per determinare la migliore modalità di combinazione. Questo studio fornisce un riferimento per ottimizzare la migliore modalità di applicazione della MTC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1300 series class II biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>1374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>1334GR001</td>
			<td>MTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACEA NovoExpress&#160;1.4.0</td>
			<td>ACEA Biosciences, Inc</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>10176-2-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical flow cytometry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>62-2-1810-1027-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC apoptosis detection kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>C1062L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astragalus injection</td>
			<td>Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company</td>
			<td>A03190612144</td>
			<td>Ast injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astragaloside A</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>84687-43-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bax</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>60267-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl-2</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>26593-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>0816-2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-3</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>19677-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorogenic acid</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>327-97-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck Biotechnology, Inc.</td>
			<td>7791-13-1</td>
			<td>CoCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>2020112701</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2020090101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high sugar medium</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>2110050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM sugar free medium</td>
			<td>Beijing Solarbio life sciences Company</td>
			<td>2029548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL luminous fluid</td>
			<td>Lianshuo Biological Company</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>FA1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis instrument</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>1658026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erigeron breviscapus capsule</td>
			<td>Yunnan Biogu Pharmaceutical Company</td>
			<td>Z53021671</td>
			<td>Eri capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Four Seasons Institute of Biological Engineering</td>
			<td>20210402</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympms Corporation</td>
			<td>IX71-F32PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>SA00001- 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBM SPSS Statistics version 26.0</td>
			<td>International Business Machines Corporation, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ 1.8.0</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunol&#160;fluorescence&#160;staining kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2021070901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.</td>
			<td>HH35L2018296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motic Inverted microscope</td>
			<td>Nanda Scientific Instruments Co.</td>
			<td>AE2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2014081301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat milk</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>16396-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-Akt</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>66444-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC12 cells</td>
			<td>Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>CBP60430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase protease inhibitor mixture</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2015082901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive oxygen species assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RI-PA lysis solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scutellarin</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>27740-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample loading buffer, 5x</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter tips (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Merck Biotechnology, Inc.</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>1115GR500&#160;</td>
			<td>TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>J190013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2021051301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex oscillator</td>
			<td>OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>VXMNAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>66009-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the two herb combination strategy to treat injured pc12 cells

In considerazione dei vantaggi della combinazione della medicina tradizionale cinese (MTC) nel trattamento dell'ischemia cerebrale, abbiamo studiato le differenze nell'efficacia e nel meccanismo tra la combinazione di preparazione e la combinazione di componenti al fine di esplorare la strategia di combinazione di due erbe per trattare le cellule PC12 danneggiate. Il cloruro di cobalto (CoCl2) combinato con un mezzo privo di glucosio è stato impiegato per indurre il danno ossidativo delle cellule PC12. Quindi, la combinazione ottimale di iniezione di Astragalus mongholicus (Ast) e Erigeron breviscapus (Eri) è stata selezionata e combinata seguendo metodi di progettazione uniformi dopo aver esaminato la loro concentrazione sicura ed efficace sulle cellule PC12. Inoltre, la combinazione di componenti esaminata comprende 10 μM di astragaloside A, 40 μM di scutellarina e 75 μM di acido clorogenico in due erbe. Quindi, MTT, Annexin V-FITC / PI, immunofluorescenza e analisi Western blot sono stati utilizzati per valutare l'efficacia e il meccanismo della combinazione di preparazione e della combinazione di componenti su cellule PC12 danneggiate. I risultati hanno mostrato che la combinazione di preparazione ottimale per la pro-sopravvivenza cellulare era l'iniezione di Ast e la capsula di Eri con una concentrazione di 6:1,8 (μM). La combinazione di componenti (10 μM di astragaloside A, 40 μM di scutellarina e 75 μM di acido clorogenico) è risultata più efficace della combinazione di preparazione. Entrambe le combinazioni hanno notevolmente ridotto la velocità apoptotica, l'intensità di fluorescenza della caspasi-3 e il livello intracellulare di specie reattive dell'ossigeno (ROS); nel frattempo, hanno sovraregolato i livelli di espressione di p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax e Nrf2. Questi effetti erano più evidenti nella combinazione di componenti. In conclusione, entrambe le combinazioni possono inibire la lesione indotta da CoCl2 combinata con un mezzo privo di glucosio sulle cellule PC12, promuovendo così la sopravvivenza cellulare. Tuttavia, l'efficienza della combinazione di componenti rispetto alla combinazione di preparazione può essere dovuta alla sua più forte regolazione della via di segnalazione PI3K / Akt / Nrf2 correlata allo stress ossidativo e all'apoptosi.

Lo screening della combinazione ottimale di Ast iniezione ed Eri capsule è mostrato nella Figura 1. Il tasso di sopravvivenza cellulare dell'iniezione di Ast e della capsula Eri sulle cellule PC12 normali è mostrato nella Figura 1A. La vitalità cellulare era inferiore al 95% con iniezione di Ast a concentrazioni superiori a 12 μM (Figura 1A) e capsula Eri a concentrazioni superiori a 5 μM (Figura 1A), indicando che la concentr...

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Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells

Questo protocollo fornisce una strategia di combinazione di due erbe per trattare le cellule PC12 ferite. Il protocollo fornisce un riferimento per ottimizzare la migliore modalità di applicazione della medicina tradizionale cinese (MTC).

Esplorare la strategia di combinazione di due erbe per trattare le cellule PC12 ferite

In view of the advantages of the combination of traditional Chinese medicine (TCM) in the treatment of cerebral ischemia, we studied the differences in ...

Il protocollo in questo studio fornisce una strategia di combinazione di due erbe per il trattamento delle cellule PC12 danneggiate dall'ipossia e un riferimento per ottimizzare la migliore modalità di combinazione di erbe. Questa tecnica può fornire un metodo sperimentale in vitro semplice, affidabile ed efficiente per lo screening dell'efficace combinazione di ingredienti dalle erbe, contro le cellule ipossiali. Questa strategia può anche essere applicata per schermare le combinazioni di componenti contro le cellule ipossiali da altre combinazioni di preparazione di erbe e illustrare il loro meccanismo protettivo.Per iniziare, sub-coltura le cellule PC12 ogni due o tre giorni a 37 gradi Celsius in un incubatore integrato con il 5% di anidride carbonica per ottenere un passaggio da 4 a 8 per tutti gli esperimenti successivi. Trattare dal 70 all'80% le cellule PC12 confluenti con un millilitro di tripsina allo 0,25% e osservare le cellule al microscopio per il distacco delle cellule. Quindi interrompere la digestione della tripsina aggiungendo tre millilitri del mezzo completo.Far girare le cellule trasferite in una provetta da centrifuga da 15 millilitri a 840 x g per cinque minuti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare con il mezzo completo e trasferire la sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri. Per contare le cellule, avviare il software di citometria a flusso e selezionare il multiplo di diluizione corrispondente della soluzione cellulare nell'impostazione di conteggio.Fare clic su Grafico densità dopo aver caricato il campione di cella. Circondare la popolazione cellulare lontano dall'asse x e dall'asse y. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla tabella dati sotto la figura e scegliere X, Y, Conteggio e Abs.Contare per ottenere i risultati del conteggio delle celle nella tabella dei dati di Abs.Count. Dopo aver regolato la concentrazione cellulare approssimativamente a 1 volte 10 alle 5 celle per millilitro con il mezzo completo, aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto a una piastra a 96 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica per 24 ore. Il giorno successivo, alla piastra scartata dal surnatante, aggiungere 120 microlitri di una soluzione MTT da un milligrammo per millilitro in ciascun pozzetto e incubare per quattro ore a 37 gradi Celsius.Dopo l'incubazione, una volta scartato il surnatante aggiungere 150 microlitri di DMSO a ciascun pozzetto. Tenere la piastra agitata in un oscillatore a vortice per 10 minuti ad una velocità di 240 volte al minuto. Quindi misurare l'assorbanza a 490 nanometri in un lettore di micropiastre.Per esaminare la combinazione ottimale di farmaci con un metodo di progettazione omogeneo, coltivare le cellule come dimostrato in precedenza e trattare le cellule PC12 danneggiate con sei diverse concentrazioni proporzionali di iniezione di astragalo e capsula di breviscapus. Per valutare l'effetto protettivo di due combinazioni ottimali, trattare le cellule PC12 danneggiate con i due tipi di combinazione di farmaci. Incubare le cellule per 24 ore e calcolare la vitalità cellulare come dimostrato in precedenza.Seminare le cellule PC12 in una piastra a 12 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo il trattamento farmacologico, trattare le cellule con 250 microlitri di tripsina per pozzetto e centrifugare le cellule a 840 x g per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi risospendere il pellet cellulare con 500 microlitri del tampone legante.Aggiungere 5 microlitri di Annexin V-FITC, 10 microlitri di ioduro di propidio in triplice copia per ciascun gruppo e incubare le cellule al buio per 15 minuti a temperatura ambiente per verificare l'apoptosi utilizzando la citometria a flusso. Nel software del citometro a flusso, fare clic su Compensazione automatica nel menu Start, selezionare FITC, PE, PerCP e APC nel canale Select e selezionare Compensation at Height (Compensazione in altezza). Quindi fare clic su OK nella voce statistica:Mediana.Fare clic su Mappa densità e cerchiare la popolazione cellulare effettiva con il metodo di conteggio delle celle illustrato in precedenza. Con la fluorescenza FITC come parametro dell'asse x e altra fluorescenza come parametro dell'asse y, creare una mappa di densità. Fare clic su Matrice di compensazione nel menu Start e Coefficiente nella matrice di overflow.Seminare le cellule PC12 ai coprivetrini posti su un pozzetto a 24 pozzetti in triplice copia e incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo il trattamento farmacologico, sciacquare i coprivetrini due volte con PBS per cinque minuti ciascuno, fissarli con paraformaldeide al 4% per 15 minuti e permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,5% per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver risciacquato le cellule, bloccarle con il 10% di siero di capra per un'ora a temperatura ambiente.Aggiungere 200 microlitri di anticorpo primario diluito caspasi-3 a ciascun coprivetrino e incubare durante la notte a 4 gradi Celsius. Il giorno seguente, lavare tre volte con tampone TBST per tre minuti ciascuno e incubare con 200 microlitri di anticorpo secondario per un'ora a temperatura ambiente al buio. Dopo l'incubazione, incubare i vetrini con 300 microlitri di 0,5 microgrammi per millilitro di DAPI per 10 minuti e lavare le cellule tre volte con TBST per cinque minuti ciascuna.Cattura le immagini del coprislip al microscopio a fluorescenza e analizza statisticamente l'intensità della fluorescenza con il software di imaging. Lavare il foglietto di copertura delle cellule PC12 trattate con farmaco tre volte con PBS per tre minuti ciascuno e incubare con 400 microlitri di 10 micromolari dicloro-diidro-fluoresceina diacetato a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Lavare nuovamente le cellule con DMEM senza siero due volte per tre minuti ciascuna.Aggiungere l'agente di spegnimento a fluorescenza e acquisire immediatamente le immagini del vetrino al microscopio a fluorescenza per calcolare l'intensità relativa della fluorescenza con il software di imaging. Lavare le cellule PC12 trattate con farmaci in una piastra a 6 pozzetti tre volte con PBS per cinque minuti ciascuna e incubare su ghiaccio per 30 minuti nel tampone di lisi preparato di 100 microlitri per pozzetto. Dopo la lisi, centrifugare le cellule a 16.000 x g per 20 minuti a 4 gradi Celsius per raccogliere il surnatante.Dopo aver rilevato la concentrazione proteica mediante il test Bradford, eseguire un'elettroforesi SDS-PAGE al 12% con 25 microgrammi di proteine in ciascuna corsia e trasferire il gel alla membrana PVDF. Bloccare le membrane con latte scremato al 5% per 1,5 ore a temperatura ambiente e incubare con cinque millilitri dei corrispondenti anticorpi primari per 24 ore a 4 gradi Celsius. Dopo l'incubazione e il lavaggio della membrana con TBST tre volte per 10 minuti ciascuna, incubare con cinque millilitri di anticorpi secondari coniugati HRP a temperatura ambiente per due ore.Infine, alla membrana lavata con TBST, aggiungere substrato HRP chemiluminescente per il rilevamento della banda proteica secondo le istruzioni del produttore. Quindi catturare le immagini utilizzando il sistema di imaging a chemiluminescenza per quantificare i valori di grigio delle proteine, con beta-actina come controllo interno. La vitalità cellulare sulle cellule PC12 normali era inferiore al 95% con iniezione di astragalo a concentrazioni superiori a 12 micromolari e superiore a 5 micromolari per la capsula del breviscapo.L'iniezione di astragalo potrebbe migliorare il tasso di sopravvivenza delle cellule PC12 danneggiate nell'intervallo di concentrazione da 6 a 12 micromolari e della capsula di breviscapus da 2 a 5 micromolari. Mentre la combinazione di farmaci con un rapporto da 6 a 1,8 micromolari ha mostrato la più alta vitalità cellulare. La vitalità cellulare delle due combinazioni sulle cellule PC12 danneggiate è stata significativamente promossa e la combinazione di componenti è stata superiore alla combinazione di preparazione.Il tasso di apoptosi ha mostrato che le percentuali di cellule apoptotiche precoci, tardive e totali erano significativamente più alte nel gruppo modello rispetto al gruppo normale. Rispetto al gruppo modello, le percentuali di cellule apoptotiche in ogni fase erano significativamente più basse nel gruppo di trattamento. L'intensità di fluorescenza della caspasi-3 era significativamente più bassa in ciascun gruppo di trattamento rispetto al gruppo modello ed era relativamente più bassa nel gruppo di combinazione di componenti.L'espressione relativa dei geni Akt, Bcl-2 e Bax ha rivelato che la combinazione di componenti è superiore alla combinazione di preparazione nel promuovere la sopravvivenza cellulare, che è correlata al più forte effetto anti-apoptosi. La combinazione di componenti ha mostrato un migliore effetto di danno antiossidante rispetto a quello della combinazione di preparazione e un'espressione significativamente più elevata della proteina Nrf2. Questo metodo può essere utilizzato per esaminare e valutare la combinazione di componenti con altre potenziali attività farmacologiche dalla combinazione di erbe, come antinfiammatorio, antibatterico e altro.

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