Name: exploring the two herb combination strategy to treat injured pc12 cells
Uploaded: 2022-11-18T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiada por projetos-chave de P & D do Departamento Provincial de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2020YFS0325).

1. Preparação do reagente
<ol><li>Preparar o meio completo adicionando 90 mL de meio DMEM com alto teor de açúcar, 10 mL de soro fetal bovino (FBS) e 1 mL de solução de penicilina-estreptomicina em um frasco de cultura estéril de 125 mL. Misturar o meio completo e conservar a 4 °C em condições fechadas.</li>
	<li>Preparar a solução de CoCl 2 adicionando 0,02 g de pó de CoCl2 (pesado com precisão) em 10 ml de meio DMEM sem açúcar (dissolvido completamente) para obte...

<ol>
	<li>Mendelevich, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cerebral+ischemia,+and+dizziness.">Chronic cerebral ischemia, and dizziness.</a> Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).</li><li>Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+on+the+diagnosis+and+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+integrated+traditional+Chinese+and+western+medicine.">Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine.</a> Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).</li><li>Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+treatment+of+45+cases+of+cerebral+infarction+with+Astragalus+and+Dengzhan+Xixin+injection.">Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection.</a> Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).</li><li>Bei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+study+of+Dengzhanxixin+injection+combined+with+Astragalus+injection+in+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke.">Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke.</a> Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).</li><li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+ratio+of+Astragalus+injection+combined+with+Dengzhan+Xixin+injection+against+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+rats+by+baseline+equal-ratio+increase-decrease+design+method.">Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method.</a> China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+and+mechanism+of+Astragalus+combined+with+Erigeron+breviscapusin+the+best+proportion+on+cerebral+ischemia+rats.">Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+oxidative+damage+of+PC12+cells+with+hypoxia+and+hypoglycemia+based+on+the+combination+of+Astragalus+and+Dengzhan+Asarum+based+on+the+Nrf2/HO-1+pathway.">Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).</li><li>. Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I Available from: <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69</a> (2020)</li><li>. Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I Available from: <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8</a> (2020)</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linoleyltyrosine+protects+PC12+cells+against+oxidative+damage+via+autophagy:+Possible+involvement+of+CB1+receptor+regulation.">N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gab1+regulates+SDF-1-induced+progression+via+inhibition+of+apoptosis+pathway+induced+by+PI3K/AKT/Bcl-2/BAX+pathway+in+human+chondrosarcoma.">Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma.</a> Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).</li><li>Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Asarone+ameliorates+&#946;-Amyloid-induced+neurotoxicity+in+PC12+cells+by+activating+P13K/Akt/Nrf2+signaling+pathway.">&#946;-Asarone ameliorates &#946;-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).</li><li>Li, J., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+traditional+Chinese+and+western+medicine.">Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine.</a> Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).</li><li>Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discussion+on+the+therapeutic+value+of+traditional+Chinese+medicine+on+cognitive+dysfunction+caused+by+chronic+cerebral+ischemia.">Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia.</a> Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).</li><li>Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+research+on+pharmacological+and+neuroprotective+effects+of+traditional+Chinese+medicine+after+cerebral+ischemia.">Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia.</a> China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).</li><li>Wang, N., Sun, H., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+doses+of+astragalus+injection+on+neurological+rehabilitation+of+stroke+patients.">Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients.</a> Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).</li><li>Sun, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+astragalus+injection+on+apoptosis+after+cerebral+ischemia-reperfusion+in+rats.">Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats.</a> Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengzhan+Xixin+injection+derived+from+a+traditional+Chinese+herb+Erigeron+breviscapusameliorates+cerebral+ischemia/reperfusion+injury+in+rats+via+modulation+of+mitophagy+and+mitochondrial+apoptosis.">Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).</li><li>Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+research+progress+of+Dengzhanhua+preparation+in+prevention+and+treatment+of+ischemic+stroke+and+transient+ischemic+attack.">Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack.</a> Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).</li><li>Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+chronic+ethanol+consumption+on+apoptosis+and+autophagy+following+transient+focal+cerebral+ischemia+in+male+mice.">Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).</li><li>El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chrysin+attenuates+global+cerebral+ischemic+reperfusion+injury+via+suppression+of+oxidative+stress,+inflammation+and+apoptosis.">Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis.</a> Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).</li><li>Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+breviscapine+aglycone+on+PI+3+K/Akt+conduction+pathway+in+neonatal+rats+with+hypoxic-ischemic+brain+injury.">Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury.</a> Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).</li><li>Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-22+exerts+its+neuroprotective+and+angiogenic+functions+via+regulating+PI3K/Akt+signaling+pathway+in+cerebral+ischemia-reperfusion+rats).">MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats).</a> Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).</li><li>Luca, M., Luca, A., Calandra, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+damage+in+the+pathogenesis+and+progression+of+alzheimer's+disease+and+vascular+dementia.">The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupeol+alleviates+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+correlation+with+modulation+of+PI3K/Akt+pathway.">Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+phosphocreatine+on+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+induced+apoptosis+in+vitro+and+in+vivo:+Involvement+of+dual+PI3K/Akt+and+Nrf2/HO-1+pathways.">Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways.</a> Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).</li><li>Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J., Ch&#225;nez-C&#225;rdenas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cobalt+chloride+as+a+chemical+hypoxia+model.">The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).</li><li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside+attenuates+CoCl2-simulated+hypoxia+injury+in+PC12+cells+partly+by+mitochondrial+protection.">Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection.</a> European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).</li><li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+potency+of+Tofu+bio-processed+using+Actinomucor+elegans+against+hypoxic+injury+induced+by+cobalt+chloride+in+PC12+cells.">Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells.</a> Molecules. 26 (10), 2983 (2021).</li></ol>

Ainda há carência de medicamentos ideais para o tratamento da isquemia cerebral na prática clínica moderna2. Sob a orientação da suplementação de qi e ativação do método de circulação sanguínea, Ast, Eri e outras preparações têm sido utilizadas em combinação na prática clínica da MTC e têm alcançado boas vantagens abrangentes13,14,15. Um grande número de estudos tem demonstrado que...

A isquemia cerebral crônica, causada por hipoperfusão cerebral, é uma doença comum em pessoas de meia-idade e idosos1. Como uma doença de isquemia oculta a longo prazo, pode levar a disfunção neurológica progressiva ou persistente. Os principais mecanismos patológicos incluem apoptose celular e dano oxidativo, levando a disfunção neurológica progressiva ou persistente; esta é a base patológica da doença de Alzheimer, demência vascular e outras doenças, e afeta seriamente a qualidade de vida dos pacientes. No entanto, ainda há uma falta de drogas ideais na medicina moderna para tratar a isquemia cerebral crônica2. Ao mesmo tempo, a combinação de Astragalus mongholicus (Ast) e Erigeron breviscapus (Eri) tem sido amplamente utilizada na prática clínica da medicina tradicional chinesa (MTC)4. A estratégia de combinação melhorou notavelmente na promoção da recuperação da função nervosa após isquemia cerebral, que é melhor do que a de uma única droga; no entanto, existem grandes diferenças na razão de dosagem na combinação das duas drogas4. Os componentes efetivos e o mecanismo de ação não estão bem definidos, o que é a questão-chave que restringe sua aplicação clínica.
Estudos anteriores demonstraram o efeito sinérgico da combinação de preparação da injeção de Ast e da injeção de Eri no tratamento da isquemia cerebral em ratos. Pode regular positivamente a expressão da proteína p-Akt e regular negativamente a expressão da proteína promotora de morte associada (TAB)Bcl-2 5,6, que é uma das proteínas da família do linfoblastoma B 2 (Bcl-2) e tem o efeito de promover a apoptose. No entanto, a base material e o mecanismo de seu efeito sinérgico não são claros. Além disso, o modelo de lesão de células PC12 foi estabelecido com o meio combinado livre de glicose CoCl2, e a combinação ótima de componentes em Ast e Eri foi rastreada e definida7.
Neste estudo, as doses efetivas de Ast e Eri são rastreadas usando o modelo de célula PC12 lesionado. A combinação ideal das duas drogas é rastreada usando este modelo combinado com o método de design homogêneo. O modelo celular é usado para avaliar melhor a diferença nos efeitos e mecanismos da combinação de preparação e da combinação de componentes em células PC12 lesadas. Esta estratégia visa explorar o efeito protetor e o mecanismo regulador dos dois tipos de combinações em células PC12 lesadas através da via de sinal PI3K/Akt/Nrf2 para determinar o melhor modo de combinação. Este estudo fornece uma referência para otimizar o melhor modo de aplicação do TCM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1300 series class II biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>1374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>1334GR001</td>
			<td>MTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACEA NovoExpress&#160;1.4.0</td>
			<td>ACEA Biosciences, Inc</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>10176-2-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical flow cytometry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>62-2-1810-1027-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC apoptosis detection kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>C1062L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astragalus injection</td>
			<td>Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company</td>
			<td>A03190612144</td>
			<td>Ast injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astragaloside A</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>84687-43-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bax</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>60267-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl-2</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>26593-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>0816-2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-3</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>19677-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorogenic acid</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>327-97-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck Biotechnology, Inc.</td>
			<td>7791-13-1</td>
			<td>CoCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>2020112701</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2020090101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high sugar medium</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>2110050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM sugar free medium</td>
			<td>Beijing Solarbio life sciences Company</td>
			<td>2029548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL luminous fluid</td>
			<td>Lianshuo Biological Company</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>FA1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis instrument</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>1658026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erigeron breviscapus capsule</td>
			<td>Yunnan Biogu Pharmaceutical Company</td>
			<td>Z53021671</td>
			<td>Eri capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Four Seasons Institute of Biological Engineering</td>
			<td>20210402</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympms Corporation</td>
			<td>IX71-F32PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>SA00001- 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBM SPSS Statistics version 26.0</td>
			<td>International Business Machines Corporation, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ 1.8.0</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunol&#160;fluorescence&#160;staining kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2021070901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.</td>
			<td>HH35L2018296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motic Inverted microscope</td>
			<td>Nanda Scientific Instruments Co.</td>
			<td>AE2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2014081301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat milk</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>16396-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-Akt</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>66444-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC12 cells</td>
			<td>Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>CBP60430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase protease inhibitor mixture</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2015082901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive oxygen species assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RI-PA lysis solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scutellarin</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>27740-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample loading buffer, 5x</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter tips (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Merck Biotechnology, Inc.</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>1115GR500&#160;</td>
			<td>TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>J190013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2021051301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex oscillator</td>
			<td>OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>VXMNAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>66009-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the two herb combination strategy to treat injured pc12 cells

Tendo em vista as vantagens da combinação da medicina tradicional chinesa (MTC) no tratamento da isquemia cerebral, estudamos as diferenças na eficácia e no mecanismo entre a combinação de preparação e a combinação de componentes, a fim de explorar a estratégia de combinação de duas ervas para tratar células PC12 lesadas. O cloreto de cobalto (CoCl2) combinado com um meio livre de glicose foi empregado para induzir danos oxidativos das células PC12. Em seguida, a combinação ideal de Astragalus mongholicus (Ast) e Erigeron breviscapus (Eri) foi selecionada e combinada seguindo métodos de design uniformes após a triagem de sua concentração segura e eficaz em células PC12. Além disso, a combinação de componentes rastreados compreende 10 μM de astragalosídeo A, 40 μM de escutelarina e 75 μM de ácido clorogênico em duas ervas. Em seguida, MTT, anexina V-FITC/PI, imunofluorescência e Western blot foram utilizados para avaliar a eficácia e o mecanismo da combinação de preparação e da combinação de componentes em células PC12 lesadas. Os resultados mostraram que a combinação de preparação ideal para a pró-sobrevivência celular foi a injeção de Ast e a cápsula de Eri com uma concentração de 6:1,8 (μM). A combinação de componentes (10 μM de astragalosídeo A, 40 μM de escutelarina e 75 μM de ácido clorogênico) foi mais eficaz do que a combinação de preparação. Ambas as combinações reduziram notavelmente a taxa apoptótica, a intensidade de fluorescência da caspase-3 e o nível de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular; enquanto isso, eles regularam positivamente os níveis de expressão de p-Akt/Akt, Bcl-2/Bax e Nrf2. Esses efeitos foram mais evidentes na combinação de componentes. Em conclusão, ambas as combinações podem inibir a lesão induzida pela CoCl2 combinada com um meio livre de glicose nas células PC12, promovendo assim a sobrevivência celular. No entanto, a eficiência da combinação de componentes sobre a combinação de preparação pode ser devida à sua regulação mais forte da via de sinalização PI3K/Akt/Nrf2 relacionada ao estresse oxidativo e à apoptose.

A triagem da combinação ideal de injeção de Ast e cápsula de Eri é mostrada na Figura 1. A taxa de sobrevivência celular da injeção de Ast e da cápsula de Eri nas células PC12 normais é mostrada na Figura 1A. A viabilidade celular foi inferior a 95% com injeção de Ast em concentrações superiores a 12 μM (Figura 1A) e cápsula de Eri em concentrações superiores a 5 μM (Figura 1A), indicando que a concentração m...

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Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells

Este protocolo fornece uma estratégia de combinação de duas ervas para tratar células PC12 lesadas. O protocolo fornece uma referência para otimizar o melhor modo de aplicação da medicina tradicional chinesa (MTC).

Explorando a estratégia de combinação de duas ervas para tratar células PC12 lesadas

In view of the advantages of the combination of traditional Chinese medicine (TCM) in the treatment of cerebral ischemia, we studied the differences in ...

O protocolo neste estudo fornece uma estratégia de combinação de duas ervas para o tratamento de células PC12 danificadas por hipóxia e uma referência para otimizar o melhor modo de combinação de ervas. Esta técnica pode fornecer um método experimental in vitro simples, confiável e eficiente para rastrear a combinação eficaz de ingredientes de ervas contra células hipóxicas. Essa estratégia também pode ser aplicada para rastrear as combinações de componentes contra células hipóxias de outras combinações de preparação de ervas e ilustrar seu mecanismo de proteção.Para começar, sub-cultura das células PC12 a cada dois a três dias a 37 graus Celsius em uma incubadora suplementada com 5% de dióxido de carbono para obter uma passagem de 4 a 8 para todos os experimentos subsequentes. Trate 70 a 80% de células PC12 confluentes com um mililitro de 0,25% de tripsina e observe as células sob um microscópio para descolamento celular. Em seguida, pare a digestão da tripsina adicionando três mililitros do meio completo.Gire as células transferidas em um tubo de centrífuga de 15 mililitros a 840 x g por cinco minutos. Depois de descartar o sobrenadante, ressuscite o pellet celular com o meio completo e transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Para contar as células, inicie o software de citometria de fluxo e selecione o múltiplo de diluição correspondente da solução celular na configuração de contagem.Clique em Gráfico de densidade depois de carregar a amostra de célula. Circule a população de células para longe dos eixos x e y. Clique com o botão direito do mouse na tabela de dados abaixo da figura e selecione X, Y, Contagem e Abs.Conte para obter os resultados da contagem de células na tabela de dados de Abs.Count. Depois de ajustar a concentração celular aproximadamente a 1 vezes 10 para a 5ª célula por mililitro com o meio completo, adicione 100 microlitros da suspensão celular por poço a uma placa de 96 poços e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. No dia seguinte, à placa descartada do sobrenadante, adicione 120 microlitros de um miligrama por mililitro de solução de MTT em cada poço e incube por quatro horas a 37 graus Celsius.Após a incubação, uma vez que o sobrenadante é descartado, adicione 150 microlitros de DMSO a cada poço. Mantenha a placa sob agitação em um oscilador de vórtice por 10 minutos a uma velocidade de 240 vezes por minuto. Em seguida, meça a absorvância a 490 nanômetros em um leitor de microplacas.Para rastrear a combinação ideal de drogas pelo método de design homogêneo, cultivar as células conforme demonstrado anteriormente e tratar as células PC12 lesadas com seis concentrações de proporção diferentes de injeção de Astragalus e cápsula de breviscapus. Para avaliar o efeito protetor de duas combinações ideais, trate as células PC12 lesadas com os dois tipos de combinação de drogas. Incubar as células por 24 horas e calcular a viabilidade celular como demonstrado anteriormente.Semeia as células PC12 em uma placa de 12 poços e incube a 37 graus Celsius por 24 horas. Após o tratamento medicamentoso, trate as células com 250 microlitros de tripsina por poço e centrifugar as células a 840 x g por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, ressuspenda o pellet celular com 500 microlitros do tampão de ligação.Adicionar 5 microlitros de anexina V-FITC, 10 microlitros de iodeto de propídio em triplicados para cada grupo e incubar as células no escuro por 15 minutos à temperatura ambiente para verificar se há apoptose usando citometria de fluxo. No software do citômetro de fluxo, clique em Compensação Automática no menu Iniciar, selecione FITC, PE, PerCP e APC no canal Selecionar e selecione Compensação em Altura. Em seguida, clique em OK no Item Estatístico:Mediana.Clique em Mapa de Densidade e circule a população de células efetiva com o método de contagem de células demonstrado anteriormente. Com a fluorescência FITC como parâmetro do eixo x e outras fluorescências como o parâmetro do eixo y, crie um mapa de densidade. Clique em Matriz de compensação no menu Iniciar e Coeficiente na matriz de estouro.Semeia as células PC12 para as folhas de cobertura colocadas em um poço de placa de 24 poços em triplicados e incube a 37 graus Celsius por 24 horas. Após o tratamento medicamentoso, enxaguar as coberturas duas vezes com PBS por cinco minutos cada, fixá-las com paraformaldeído a 4% por 15 minutos e permeabilizar com 0,5%Triton X-100 por 20 minutos à temperatura ambiente. Depois de enxaguar as células, bloqueie-as com soro de cabra a 10% durante uma hora à temperatura ambiente.Adicione 200 microlitros de caspase-3 do anticorpo primário diluído a cada folha de cobertura e incube durante a noite a 4 graus Celsius. No dia seguinte, lave três vezes com tampão TBST por três minutos cada e incube com 200 microlitros de anticorpo secundário por uma hora à temperatura ambiente no escuro. Após a incubação, incubar as tampas com 300 microlitros de 0,5 microgramas por mililitro de DAPI por 10 minutos e lavar as células três vezes com TBST por cinco minutos cada.Capture as imagens de cobertura sob um microscópio de fluorescência e analise estatisticamente a intensidade da fluorescência com o software de imagem. Lave a tampa da célula PC12 tratada com fármaco três vezes com PBS por três minutos cada e incube com 400 microlitros de 10 diacetatos micromolares de dicloro-diidro-fluoresceína a 37 graus Celsius por 20 minutos. Lave as células novamente com DMEM sem soro duas vezes por três minutos cada.Adicione o agente de têmpera de fluorescência e capture imediatamente as imagens de folha de cobertura sob um microscópio de fluorescência para calcular a intensidade relativa de fluorescência com o software de imagem. Lave as células PC12 tratadas com drogas em uma placa de 6 poços três vezes com PBS por cinco minutos cada e incube no gelo por 30 minutos no tampão de lise preparado de 100 microlitros por poço. Após a lise, centrifugar as células a 16.000 x g por 20 minutos a 4 graus Celsius para coletar o sobrenadante.Depois de detectar a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford, execute uma eletroforese 12%SDS-PAGE com 25 microgramas de proteína em cada pista e transfira o gel para a membrana PVDF. Bloquear as membranas com 5% de leite desnatado por 1,5 horas à temperatura ambiente e incubar com cinco mililitros dos anticorpos primários correspondentes por 24 horas a 4 graus Celsius. Após incubação e lavagem da membrana com TBST três vezes por 10 minutos cada, incubar com cinco mililitros de anticorpos secundários conjugados com HRP à temperatura ambiente por duas horas.Finalmente, à membrana lavada com TBST, adicione substrato quimioluminescente HRP para detecção de banda de proteína de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, capture as imagens usando o sistema de imagem de quimioluminescência para quantificar os valores de cinza das proteínas, com beta-actina como controle interno. A viabilidade celular nas células PC12 normais foi inferior a 95% com injeção de Astrágalo em concentrações superiores a 12 micromolares e superiores a 5 micromolares para a cápsula de breviscapus.A injeção de astrágalo pode melhorar a taxa de sobrevivência das células PC12 lesadas na faixa de concentração de 6 a 12 micromolares e a cápsula de breviscapus em 2 a 5 micromolares. Considerando que a combinação de drogas em uma proporção de 6 a 1,8 micromolar exibiu a maior viabilidade celular. A viabilidade celular das duas combinações nas células PC12 lesadas foi significativamente promovida e a combinação de componentes foi superior à combinação de preparação.A taxa de apoptose mostrou que as porcentagens de células apoptóticas precoces, tardias e totais foram significativamente maiores no grupo modelo do que no grupo normal. Em comparação com o grupo modelo, as porcentagens de células apoptóticas em cada estágio foram significativamente menores no grupo de tratamento. A intensidade de fluorescência da caspase-3 foi significativamente menor em cada grupo de tratamento em comparação com o grupo modelo, e foi relativamente menor no grupo de combinação de componentes.A expressão relativa dos genes Akt, Bcl-2 e Bax revelou que a combinação de componentes é superior à combinação de preparação na promoção da sobrevivência celular, o que está relacionado ao efeito anti-apoptose mais forte. A combinação de componentes exibiu um melhor efeito de dano antioxidante do que o da combinação de preparação e uma expressão significativamente maior da proteína Nrf2. Este método pode ser usado para rastrear e avaliar a combinação de componentes com outras atividades farmacológicas potenciais da combinação de ervas, como anti-inflamatórias, antibacterianas e muito mais.

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