Name: exploring the two herb combination strategy to treat injured pc12 cells
Uploaded: 2022-11-18T14:40:00
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Esta investigación fue financiada por proyectos clave de investigación y desarrollo del Departamento Provincial de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2020YFS0325).

1. Preparación del reactivo
<ol><li>Preparar el medio completo añadiendo 90 ml de medio DMEM con alto contenido de azúcar, 10 ml de suero fetal bovino (FBS) y 1 ml de solución de penicilina-estreptomicina en un matraz de cultivo estéril de 125 ml. Mezclar todo el medio y conservar a 4 °C en condiciones cerradas.</li>
	<li>Preparar la solución de CoCl 2 añadiendo 0,02 g de polvo de CoCl2 (pesado con precisión) en 10 ml de medio sin azúcar DMEM (disuelto completamente) par...

<ol>
	<li>Mendelevich, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cerebral+ischemia,+and+dizziness.">Chronic cerebral ischemia, and dizziness.</a> Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).</li><li>Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+on+the+diagnosis+and+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+integrated+traditional+Chinese+and+western+medicine.">Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine.</a> Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).</li><li>Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+treatment+of+45+cases+of+cerebral+infarction+with+Astragalus+and+Dengzhan+Xixin+injection.">Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection.</a> Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).</li><li>Bei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+study+of+Dengzhanxixin+injection+combined+with+Astragalus+injection+in+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke.">Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke.</a> Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).</li><li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+ratio+of+Astragalus+injection+combined+with+Dengzhan+Xixin+injection+against+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+rats+by+baseline+equal-ratio+increase-decrease+design+method.">Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method.</a> China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+and+mechanism+of+Astragalus+combined+with+Erigeron+breviscapusin+the+best+proportion+on+cerebral+ischemia+rats.">Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+oxidative+damage+of+PC12+cells+with+hypoxia+and+hypoglycemia+based+on+the+combination+of+Astragalus+and+Dengzhan+Asarum+based+on+the+Nrf2/HO-1+pathway.">Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).</li><li>. Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I Available from: <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69</a> (2020)</li><li>. Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I Available from: <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8</a> (2020)</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linoleyltyrosine+protects+PC12+cells+against+oxidative+damage+via+autophagy:+Possible+involvement+of+CB1+receptor+regulation.">N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gab1+regulates+SDF-1-induced+progression+via+inhibition+of+apoptosis+pathway+induced+by+PI3K/AKT/Bcl-2/BAX+pathway+in+human+chondrosarcoma.">Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma.</a> Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).</li><li>Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Asarone+ameliorates+&#946;-Amyloid-induced+neurotoxicity+in+PC12+cells+by+activating+P13K/Akt/Nrf2+signaling+pathway.">&#946;-Asarone ameliorates &#946;-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).</li><li>Li, J., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+traditional+Chinese+and+western+medicine.">Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine.</a> Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).</li><li>Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discussion+on+the+therapeutic+value+of+traditional+Chinese+medicine+on+cognitive+dysfunction+caused+by+chronic+cerebral+ischemia.">Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia.</a> Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).</li><li>Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+research+on+pharmacological+and+neuroprotective+effects+of+traditional+Chinese+medicine+after+cerebral+ischemia.">Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia.</a> China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).</li><li>Wang, N., Sun, H., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+doses+of+astragalus+injection+on+neurological+rehabilitation+of+stroke+patients.">Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients.</a> Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).</li><li>Sun, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+astragalus+injection+on+apoptosis+after+cerebral+ischemia-reperfusion+in+rats.">Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats.</a> Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengzhan+Xixin+injection+derived+from+a+traditional+Chinese+herb+Erigeron+breviscapusameliorates+cerebral+ischemia/reperfusion+injury+in+rats+via+modulation+of+mitophagy+and+mitochondrial+apoptosis.">Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).</li><li>Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+research+progress+of+Dengzhanhua+preparation+in+prevention+and+treatment+of+ischemic+stroke+and+transient+ischemic+attack.">Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack.</a> Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).</li><li>Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+chronic+ethanol+consumption+on+apoptosis+and+autophagy+following+transient+focal+cerebral+ischemia+in+male+mice.">Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).</li><li>El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chrysin+attenuates+global+cerebral+ischemic+reperfusion+injury+via+suppression+of+oxidative+stress,+inflammation+and+apoptosis.">Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis.</a> Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).</li><li>Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+breviscapine+aglycone+on+PI+3+K/Akt+conduction+pathway+in+neonatal+rats+with+hypoxic-ischemic+brain+injury.">Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury.</a> Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).</li><li>Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-22+exerts+its+neuroprotective+and+angiogenic+functions+via+regulating+PI3K/Akt+signaling+pathway+in+cerebral+ischemia-reperfusion+rats).">MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats).</a> Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).</li><li>Luca, M., Luca, A., Calandra, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+damage+in+the+pathogenesis+and+progression+of+alzheimer's+disease+and+vascular+dementia.">The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupeol+alleviates+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+correlation+with+modulation+of+PI3K/Akt+pathway.">Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+phosphocreatine+on+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+induced+apoptosis+in+vitro+and+in+vivo:+Involvement+of+dual+PI3K/Akt+and+Nrf2/HO-1+pathways.">Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways.</a> Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).</li><li>Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J., Ch&#225;nez-C&#225;rdenas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cobalt+chloride+as+a+chemical+hypoxia+model.">The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).</li><li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside+attenuates+CoCl2-simulated+hypoxia+injury+in+PC12+cells+partly+by+mitochondrial+protection.">Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection.</a> European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).</li><li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+potency+of+Tofu+bio-processed+using+Actinomucor+elegans+against+hypoxic+injury+induced+by+cobalt+chloride+in+PC12+cells.">Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells.</a> Molecules. 26 (10), 2983 (2021).</li></ol>

Todavía hay una falta de fármacos ideales para el tratamiento de la isquemia cerebral en la práctica clínica moderna2. Bajo la guía de suplementar qi y activar el método de circulación sanguínea, Ast, Eri y otras preparaciones se han utilizado en combinación en la práctica clínica de la MTC y han logrado buenas ventajas integrales13,14,15. Un gran número de estudios han demostrado que Ast pued...

La isquemia cerebral crónica, causada por hipoperfusión cerebral, es una enfermedad común en personas de mediana edad y ancianos1. Como una enfermedad de isquemia oculta a largo plazo, puede conducir a una disfunción neurológica progresiva o persistente. Los principales mecanismos patológicos incluyen la apoptosis celular y el daño oxidativo, lo que lleva a una disfunción neurológica progresiva o persistente; esta es la base patológica de la enfermedad de Alzheimer, la demencia vascular y otras enfermedades, y afecta seriamente la calidad de vida de los pacientes. Sin embargo, todavía hay una falta de medicamentos ideales en la medicina moderna para tratar la isquemia cerebral crónica2. Al mismo tiempo, la combinación de Astrágalo mongholicus (Ast) y Erigeron breviscapus (Eri) ha sido ampliamente utilizada en la práctica clínica de la medicina tradicional china (MTC)4. La estrategia de combinación ha mejorado notablemente en la promoción de la recuperación de la función nerviosa después de la isquemia cerebral, que es mejor que la de un solo fármaco; Sin embargo, existen grandes diferencias en la relación de dosis en la combinación de los dos fármacos4. Los componentes efectivos y el mecanismo de acción no están bien definidos, que es la cuestión clave que restringe su aplicación clínica.
Estudios previos han demostrado el efecto sinérgico de la combinación de preparación de la inyección de Ast y la inyección de Eri en el tratamiento de la isquemia cerebral en ratas. Puede regular al alza la expresión de la proteína p-Akt y regular negativamente la expresión de la proteína 5,6 promotora de la muerte asociada a Bcl-2 (BAD), que es una de las proteínas de la familia del linfoblastoma B 2 (Bcl-2) y tiene el efecto de promover la apoptosis. Sin embargo, la base material y el mecanismo de su efecto sinérgico no están claros. Además, el modelo de lesión de las células PC12 se estableció con CoCl2 combinado de medio libre de glucosa, y la combinación óptima de componentes en Ast y Eri ha sido examinada y definida7.
En este estudio, las dosis efectivas de Ast y Eri se examinan utilizando el modelo de células PC12 lesionadas. La combinación óptima de los dos fármacos se examina utilizando este modelo combinado con el método de diseño homogéneo. El modelo celular se utiliza para evaluar más a fondo la diferencia en los efectos y mecanismos de la combinación de preparación y la combinación de componentes en células PC12 lesionadas. Esta estrategia tiene como objetivo explorar el efecto protector y el mecanismo regulador de los dos tipos de combinaciones en células PC12 lesionadas a través de la vía de señal PI3K / Akt / Nrf2 para determinar el mejor modo de combinación. Este estudio proporciona una referencia para optimizar el mejor modo de aplicación de TCM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1300 series class II biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>1374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>1334GR001</td>
			<td>MTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACEA NovoExpress&#160;1.4.0</td>
			<td>ACEA Biosciences, Inc</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>10176-2-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical flow cytometry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>62-2-1810-1027-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC apoptosis detection kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>C1062L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astragalus injection</td>
			<td>Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company</td>
			<td>A03190612144</td>
			<td>Ast injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astragaloside A</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>84687-43-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bax</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>60267-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl-2</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>26593-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>0816-2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-3</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>19677-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorogenic acid</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>327-97-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck Biotechnology, Inc.</td>
			<td>7791-13-1</td>
			<td>CoCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>2020112701</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2020090101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high sugar medium</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>2110050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM sugar free medium</td>
			<td>Beijing Solarbio life sciences Company</td>
			<td>2029548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL luminous fluid</td>
			<td>Lianshuo Biological Company</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>FA1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis instrument</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>1658026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erigeron breviscapus capsule</td>
			<td>Yunnan Biogu Pharmaceutical Company</td>
			<td>Z53021671</td>
			<td>Eri capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Four Seasons Institute of Biological Engineering</td>
			<td>20210402</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympms Corporation</td>
			<td>IX71-F32PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>SA00001- 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBM SPSS Statistics version 26.0</td>
			<td>International Business Machines Corporation, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ 1.8.0</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunol&#160;fluorescence&#160;staining kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2021070901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.</td>
			<td>HH35L2018296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motic Inverted microscope</td>
			<td>Nanda Scientific Instruments Co.</td>
			<td>AE2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2014081301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat milk</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>16396-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-Akt</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>66444-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC12 cells</td>
			<td>Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>CBP60430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase protease inhibitor mixture</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2015082901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive oxygen species assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RI-PA lysis solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scutellarin</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>27740-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample loading buffer, 5x</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter tips (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Merck Biotechnology, Inc.</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>1115GR500&#160;</td>
			<td>TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>J190013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2021051301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex oscillator</td>
			<td>OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>VXMNAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>66009-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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exploring the two herb combination strategy to treat injured pc12 cells

En vista de las ventajas de la combinación de la medicina tradicional china (MTC) en el tratamiento de la isquemia cerebral, estudiamos las diferencias en la eficacia y el mecanismo entre la combinación de preparación y la combinación de componentes para explorar la estrategia de combinación de dos hierbas para tratar las células PC12 lesionadas. El cloruro de cobalto (CoCl2) combinado con un medio libre de glucosa se empleó para inducir el daño oxidativo de las células PC12. Luego, se seleccionó la combinación óptima de inyección de Astragalus mongholicus (Ast) y Erigeron breviscapus (Eri) y se combinó siguiendo métodos de diseño uniformes después de evaluar su concentración segura y efectiva en células PC12. Además, la combinación de componentes cribados comprende 10 μM de astragalósido A, 40 μM de escutelarina y 75 μM de ácido clorogénico en dos hierbas. Luego, se utilizaron MTT, anexina V-FITC / PI, inmunofluorescencia y análisis de Western blot para evaluar la eficacia y el mecanismo de la combinación de preparación y la combinación de componentes en células PC12 lesionadas. Los resultados mostraron que la combinación óptima de preparación para la pro-supervivencia celular fue la inyección de Ast y la cápsula de Eri con una concentración de 6:1.8 (μM). La combinación de componentes (10 μM de astragalósido A, 40 μM de escutelarina y 75 μM de ácido clorogénico) fue más efectiva que la combinación de preparación. Ambas combinaciones redujeron notablemente la tasa apoptótica, la intensidad de fluorescencia de la caspasa-3 y el nivel de especies reactivas intracelulares de oxígeno (ROS); mientras tanto, reguló al alza los niveles de expresión de p-Akt/Akt, Bcl-2/Bax y Nrf2. Estos efectos fueron más evidentes en la combinación de componentes. En conclusión, ambas combinaciones pueden inhibir la lesión inducida por CoCl2 combinado con un medio libre de glucosa en células PC12, promoviendo así la supervivencia celular. Sin embargo, la eficiencia de la combinación de componentes sobre la combinación de preparación puede deberse a su regulación más fuerte de la vía de señalización PI3K / Akt / Nrf2 relacionada con el estrés oxidativo y la apoptosis.

El cribado de la combinación óptima de Ast inyectable y Eri cápsula se muestra en la Figura 1. La tasa de supervivencia celular de la inyección de Ast y la cápsula de Eri en las células PC12 normales se muestra en la Figura 1A. La viabilidad celular fue inferior al 95% con la inyección de Ast a concentraciones superiores a 12 μM (Figura 1A) y la cápsula de Eri a concentraciones superiores a 5 μM (Figura 1A), lo que indica...

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Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells

Este protocolo proporciona una estrategia de combinación de dos hierbas para tratar las células PC12 lesionadas. El protocolo proporciona una referencia para optimizar el mejor modo de aplicación de la medicina tradicional china (MTC).

Explorando la estrategia de combinación de dos hierbas para tratar las células PC12 lesionadas

In view of the advantages of the combination of traditional Chinese medicine (TCM) in the treatment of cerebral ischemia, we studied the differences in ...

El protocolo en este estudio proporciona una estrategia de combinación de dos hierbas para tratar las células PC12 dañadas por hipoxia, y una referencia para optimizar el mejor modo de combinación de hierbas. Esta técnica puede proporcionar un método experimental in vitro simple, confiable y eficiente para detectar la combinación efectiva de ingredientes de hierbas, contra células hipoxiales. Esta estrategia también se puede aplicar para examinar las combinaciones de componentes contra las células hipoxiales de otras combinaciones de preparación de hierbas, e ilustrar su mecanismo de protección.Para empezar, subcultive las células PC12 cada dos o tres días a 37 grados centígrados en una incubadora suplementada con 5% de dióxido de carbono para obtener un paso de 4 a 8 para todos los experimentos posteriores. Trate de 70 a 80% de células PC12 confluentes con un mililitro de 0,25% de tripsina, y observe las células bajo un microscopio para el desprendimiento celular. Luego detenga la digestión de tripsina agregando tres mililitros del medio completo.Haga girar las células transferidas en un tubo de centrífuga de 15 mililitros a 840 x g durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, resuspenda el pellet celular con el medio completo y transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Para contar las células, inicie el software de citometría de flujo y seleccione el múltiplo de dilución correspondiente de la solución celular en el ajuste de recuento.Haga clic en Gráfico de densidad después de cargar la muestra de celda. Rodee la población celular lejos del eje x y del eje y. Haga clic con el botón secundario en la tabla de datos situada debajo de la figura y seleccione X, Y, Count y Abs.Count para obtener los resultados del recuento de celdas en la tabla de datos de Abs.Count. Después de ajustar la concentración celular aproximadamente a 1 veces 10 a la 5ª célula por mililitro con el medio completo, agregue 100 microlitros de la suspensión celular por pocillo a una placa de 96 pocillos e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Al día siguiente, a la placa desechada por sobrenadante, agregue 120 microlitros de un miligramo por mililitro de solución MTT en cada pocillo e incube durante cuatro horas a 37 grados centígrados.Después de la incubación, una vez que se deseche el sobrenadante, agregue 150 microlitros de DMSO a cada pocillo. Mantenga la placa bajo agitación en un oscilador de vórtice durante 10 minutos a una velocidad de 240 veces por minuto. Luego mida la absorbancia a 490 nanómetros en un lector de microplacas.Para detectar la combinación óptima de fármacos mediante el método de diseño homogéneo, cultivar las células como se demostró anteriormente y tratar las células PC12 lesionadas con seis concentraciones de proporción diferentes de inyección de astrágalo y cápsula de breviscapus. Para evaluar el efecto protector de dos combinaciones óptimas, trate las células PC12 lesionadas con los dos tipos de combinación de fármacos. Incubar las células durante 24 horas y calcular la viabilidad celular como se demostró anteriormente.Sembrar las células PC12 en una placa de 12 pocillos e incubar a 37 grados centígrados durante 24 horas. Después del tratamiento farmacológico, tratar las células con 250 microlitros de tripsina por pocillo y centrifugar las células a 840 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego vuelva a suspender el pellet celular con 500 microlitros del tampón de unión.Agregue 5 microlitros de Annexin V-FITC, 10 microlitros de yoduro de propidio por triplicado para cada grupo e incube las células en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente para verificar la apoptosis mediante citometría de flujo. En el software del citómetro de flujo, haga clic en Compensación automática en el menú Inicio, seleccione FITC, PE, PerCP y APC en el canal Seleccionar y seleccione Compensación en altura. A continuación, haga clic en Aceptar en el elemento estadístico:Mediana.Haga clic en Mapa de densidad y encierre en un círculo la población celular efectiva con el método de recuento de células demostrado anteriormente. Con la fluorescencia FITC como parámetro del eje x y otra fluorescencia como parámetro del eje y, cree un mapa de densidad. Haga clic en Matriz de compensación en el menú Inicio y Coeficiente en la matriz de desbordamiento.Sembrar las células PC12 en los cubreobjetos colocados en un pozo de placa de 24 pocillos por triplicados, e incubar a 37 grados centígrados durante 24 horas. Después del tratamiento farmacológico, enjuague los cubreobjetos dos veces con PBS durante cinco minutos cada uno, fíjelos con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos y permeabilice con Triton X-100 al 0,5% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de enjuagar las células, bloquearlas con suero de cabra al 10% durante una hora a temperatura ambiente.Agregue 200 microlitros de anticuerpo primario diluido caspasa-3 a cada cubreobjetos e incube durante la noche a 4 grados centígrados. Al día siguiente, lavar tres veces con tampón TBST durante tres minutos cada una, e incubar con 200 microlitros de anticuerpo secundario durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, incube los cubobjetos con 300 microlitros de 0,5 microgramos por mililitro de DAPI durante 10 minutos y lave las células tres veces con TBST durante cinco minutos cada una.Capture las imágenes de la cubierta bajo un microscopio de fluorescencia y analice estadísticamente la intensidad de fluorescencia con el software de imágenes. Lave el cubreobjetos de células PC12 tratado con medicamentos tres veces con PBS durante tres minutos cada una e incube con 400 microlitros de 10 diacetato de dicloro-dihidrofluoresceína micromolar a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Lave las células nuevamente con DMEM sin suero dos veces durante tres minutos cada una.Agregue el agente de extinción de fluorescencia e inmediatamente capture las imágenes de la cubierta bajo un microscopio de fluorescencia para calcular la intensidad relativa de fluorescencia con el software de imágenes. Lave las células PC12 tratadas con medicamentos en una placa de 6 pocillos tres veces con PBS durante cinco minutos cada una, e incube en hielo durante 30 minutos en el tampón de lisis preparado de 100 microlitros por pocillo. Después de la lisis, centrifugar las células a 16, 000 x g durante 20 minutos a 4 grados centígrados para recoger el sobrenadante.Después de detectar la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford, ejecute una electroforesis SDS-PAGE al 12% con 25 microgramos de proteína en cada carril y transfiera el gel a la membrana de PVDF. Bloquear las membranas con leche descremada al 5% durante 1,5 horas a temperatura ambiente, e incubar con cinco mililitros de los anticuerpos primarios correspondientes durante 24 horas a 4 grados centígrados. Después de incubar y lavar la membrana con TBST tres veces durante 10 minutos cada una, incubar con cinco mililitros de anticuerpos secundarios conjugados con HRP a temperatura ambiente durante dos horas.Finalmente, a la membrana lavada con TBST, agregue sustrato HRP quimioluminiscente para la detección de bandas de proteínas según las instrucciones del fabricante. Luego capture las imágenes utilizando el sistema de imágenes de quimioluminiscencia para cuantificar los valores de gris de las proteínas, con beta-actina como control interno. La viabilidad celular en las células PC12 normales fue inferior al 95% con inyección de astrágalo a concentraciones superiores a 12 micromolares y mayores de 5 micromolares para la cápsula de breviscapus.La inyección de astrágalo podría mejorar la tasa de supervivencia de las células PC12 lesionadas en el rango de concentración de 6 a 12 micromolares, y la cápsula de breviscapus de 2 a 5 micromolares. Mientras que la combinación de fármacos en una proporción de 6 a 1,8 micromolares exhibió la mayor viabilidad celular. La viabilidad celular de las dos combinaciones en las células PC12 lesionadas se promovió significativamente, y la combinación de componentes fue superior a la combinación de preparación.La tasa de apoptosis mostró que los porcentajes de células apoptóticas tempranas, tardías y totales fueron significativamente mayores en el grupo modelo que en el grupo normal. En comparación con el grupo modelo, los porcentajes de células apoptóticas en cada etapa fueron significativamente menores en el grupo de tratamiento. La intensidad de fluorescencia de la caspasa-3 fue significativamente menor en cada grupo de tratamiento en comparación con el grupo modelo, y fue relativamente menor en el grupo de combinación de componentes.La expresión relativa de los genes Akt, Bcl-2 y Bax reveló que la combinación de componentes es superior a la combinación de preparación para promover la supervivencia celular, que está relacionada con el efecto anti-apoptosis más fuerte. La combinación de componentes exhibió un mejor efecto de daño antioxidante que el de la combinación de preparación, y una expresión significativamente mayor de la proteína Nrf2. Este método se puede utilizar para detectar y evaluar la combinación de componentes con otras actividades farmacológicas potenciales de la combinación de hierbas, como antiinflamatorios, antibacterianos y más.

Research

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Medicine

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