Name: exploring the two herb combination strategy to treat injured pc12 cells
Uploaded: 2022-11-18T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells at JoVE.com

Denna forskning finansierades av viktiga FoU-projekt från Sichuan Provincial Department of Science and Technology (2020YFS0325).

1. Beredning av reagens
<ol><li>Bered hela mediet genom att tillsätta 90 ml DMEM högsockermedium, 10 ml fetalt bovint serum (FBS) och 1 ml penicillin-streptomycinlösning i en 125 ml steril odlingskolv. Blanda hela mediet och förvara vid 4 °C under stängda förhållanden.</li>
	<li>Bered CoCl2-lösning genom att tillsätta 0,02 gCoCl2-pulver (noggrant vägt) i 10 ml DMEM sockerfritt medium (löst fullständigt) för att erhålla en 8,4 mM stamlösning. Filtrera lösningen med...

<ol>
	<li>Mendelevich, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cerebral+ischemia,+and+dizziness.">Chronic cerebral ischemia, and dizziness.</a> Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).</li><li>Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+on+the+diagnosis+and+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+integrated+traditional+Chinese+and+western+medicine.">Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine.</a> Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).</li><li>Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+treatment+of+45+cases+of+cerebral+infarction+with+Astragalus+and+Dengzhan+Xixin+injection.">Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection.</a> Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).</li><li>Bei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+study+of+Dengzhanxixin+injection+combined+with+Astragalus+injection+in+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke.">Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke.</a> Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).</li><li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+ratio+of+Astragalus+injection+combined+with+Dengzhan+Xixin+injection+against+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+rats+by+baseline+equal-ratio+increase-decrease+design+method.">Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method.</a> China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+and+mechanism+of+Astragalus+combined+with+Erigeron+breviscapusin+the+best+proportion+on+cerebral+ischemia+rats.">Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+oxidative+damage+of+PC12+cells+with+hypoxia+and+hypoglycemia+based+on+the+combination+of+Astragalus+and+Dengzhan+Asarum+based+on+the+Nrf2/HO-1+pathway.">Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).</li><li>. Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I Available from: <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69</a> (2020)</li><li>. Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I Available from: <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8</a> (2020)</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linoleyltyrosine+protects+PC12+cells+against+oxidative+damage+via+autophagy:+Possible+involvement+of+CB1+receptor+regulation.">N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gab1+regulates+SDF-1-induced+progression+via+inhibition+of+apoptosis+pathway+induced+by+PI3K/AKT/Bcl-2/BAX+pathway+in+human+chondrosarcoma.">Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma.</a> Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).</li><li>Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Asarone+ameliorates+&#946;-Amyloid-induced+neurotoxicity+in+PC12+cells+by+activating+P13K/Akt/Nrf2+signaling+pathway.">&#946;-Asarone ameliorates &#946;-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).</li><li>Li, J., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+traditional+Chinese+and+western+medicine.">Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine.</a> Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).</li><li>Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discussion+on+the+therapeutic+value+of+traditional+Chinese+medicine+on+cognitive+dysfunction+caused+by+chronic+cerebral+ischemia.">Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia.</a> Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).</li><li>Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+research+on+pharmacological+and+neuroprotective+effects+of+traditional+Chinese+medicine+after+cerebral+ischemia.">Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia.</a> China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).</li><li>Wang, N., Sun, H., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+doses+of+astragalus+injection+on+neurological+rehabilitation+of+stroke+patients.">Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients.</a> Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).</li><li>Sun, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+astragalus+injection+on+apoptosis+after+cerebral+ischemia-reperfusion+in+rats.">Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats.</a> Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengzhan+Xixin+injection+derived+from+a+traditional+Chinese+herb+Erigeron+breviscapusameliorates+cerebral+ischemia/reperfusion+injury+in+rats+via+modulation+of+mitophagy+and+mitochondrial+apoptosis.">Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).</li><li>Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+research+progress+of+Dengzhanhua+preparation+in+prevention+and+treatment+of+ischemic+stroke+and+transient+ischemic+attack.">Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack.</a> Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).</li><li>Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+chronic+ethanol+consumption+on+apoptosis+and+autophagy+following+transient+focal+cerebral+ischemia+in+male+mice.">Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).</li><li>El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chrysin+attenuates+global+cerebral+ischemic+reperfusion+injury+via+suppression+of+oxidative+stress,+inflammation+and+apoptosis.">Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis.</a> Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).</li><li>Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+breviscapine+aglycone+on+PI+3+K/Akt+conduction+pathway+in+neonatal+rats+with+hypoxic-ischemic+brain+injury.">Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury.</a> Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).</li><li>Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-22+exerts+its+neuroprotective+and+angiogenic+functions+via+regulating+PI3K/Akt+signaling+pathway+in+cerebral+ischemia-reperfusion+rats).">MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats).</a> Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).</li><li>Luca, M., Luca, A., Calandra, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxidative+damage+in+the+pathogenesis+and+progression+of+alzheimer's+disease+and+vascular+dementia.">The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lupeol+alleviates+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+correlation+with+modulation+of+PI3K/Akt+pathway.">Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+phosphocreatine+on+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+induced+apoptosis+in+vitro+and+in+vivo:+Involvement+of+dual+PI3K/Akt+and+Nrf2/HO-1+pathways.">Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways.</a> Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).</li><li>Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J., Ch&#225;nez-C&#225;rdenas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cobalt+chloride+as+a+chemical+hypoxia+model.">The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).</li><li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside+attenuates+CoCl2-simulated+hypoxia+injury+in+PC12+cells+partly+by+mitochondrial+protection.">Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection.</a> European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).</li><li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+potency+of+Tofu+bio-processed+using+Actinomucor+elegans+against+hypoxic+injury+induced+by+cobalt+chloride+in+PC12+cells.">Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells.</a> Molecules. 26 (10), 2983 (2021).</li></ol>

Det saknas fortfarande ideala läkemedel för behandling av cerebral ischemi i modern klinisk praxis2. Under ledning av komplettering av qi och aktivering av blodcirkulationsmetoden har Ast, Eri och andra preparat använts i kombination i klinisk praxis av TCM och har uppnått goda omfattande fördelar13,14,15. Ett stort antal studier har visat att AST kan förbättra permeabiliteten hos blod-hjärnbarri?...

Kronisk cerebral ischemi, orsakad av cerebral hypoperfusion, är en vanlig sjukdom hos medelålders ochäldre 1. Som en långvarig ockult ischemi sjukdom, Det kan leda till progressiv eller ihållande neurologisk dysfunktion. De huvudsakliga patologiska mekanismerna innefattar cellapoptos och oxidativ skada, vilket leder till progressiv eller ihållande neurologisk dysfunktion; detta är den patologiska grunden för Alzheimers sjukdom, vaskulär demens och andra sjukdomar, och påverkar allvarligt patienternas livskvalitet. Det saknas emellertid fortfarande ideala läkemedel i modern medicin för att behandla kronisk cerebral ischemi2. Samtidigt har kombinationen av Astragalus mongholicus (Ast) och Erigeron breviscapus (Eri) använts i stor utsträckning i klinisk praxis av traditionell kinesisk medicin (TCM)4. Kombinationsstrategin har anmärkningsvärt förbättrats för att främja återhämtningen av nervfunktionen efter cerebral ischemi, vilket är bättre än för ett enda läkemedel; Det finns emellertid stora skillnader i doseringsförhållandet i kombinationen av de två läkemedlen4. De effektiva komponenterna och verkningsmekanismen är inte väldefinierade, vilket är nyckelfrågan som begränsar dess kliniska tillämpning.
Tidigare studier har visat den synergistiska effekten av preparatkombinationen av ASAT-injektion och Eri-injektion vid behandling av cerebral ischemi hos råtta. Det kan uppreglera uttrycket av p-Akt-protein och nedreglera uttrycket av Bcl-2-associerat dödspromotorprotein (BAD) 5,6, vilket är ett av B-lymfoblastom 2(Bcl-2) familjeproteiner och har effekten att främja apoptos. Den materiella grunden och mekanismen för dess synergistiska effekt är emellertid inte klarlagda. Vidare etablerades skademodellen för PC12-celler med CoCl2 kombinerat glukosfritt medium, och den optimala komponentkombinationen i AST och Eri har screenats och definierats7.
I denna studie screenas de effektiva doserna av AST och Eri med hjälp av den skadade PC12-cellmodellen. Den optimala kombinationen av de två läkemedlen screenas med hjälp av denna modell i kombination med den homogena designmetoden. Cellmodellen används för att ytterligare utvärdera skillnaden i effekter och mekanismer av preparatkombinationen och komponentkombinationen i skadade PC12-celler. Denna strategi syftar till att utforska skyddseffekten och regleringsmekanismen för de två typerna av kombinationer på skadade PC12-celler genom PI3K / Akt / Nrf2-signalvägen för att bestämma det bästa kombinationsläget. Denna studie ger en referens för att optimera det bästa applikationsläget för TCM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1300 series class II biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>1374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>1334GR001</td>
			<td>MTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACEA NovoExpress&#160;1.4.0</td>
			<td>ACEA Biosciences, Inc</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>10176-2-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical flow cytometry</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>62-2-1810-1027-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC apoptosis detection kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>C1062L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astragalus injection</td>
			<td>Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company</td>
			<td>A03190612144</td>
			<td>Ast injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astragaloside A</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>84687-43-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bax</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>60267-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl-2</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>26593-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>0816-2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-3</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>19677-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorogenic acid</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>327-97-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck Biotechnology, Inc.</td>
			<td>7791-13-1</td>
			<td>CoCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>2020112701</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2020090101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high sugar medium</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>2110050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM sugar free medium</td>
			<td>Beijing Solarbio life sciences Company</td>
			<td>2029548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL luminous fluid</td>
			<td>Lianshuo Biological Company</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>FA1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis instrument</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>1658026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erigeron breviscapus capsule</td>
			<td>Yunnan Biogu Pharmaceutical Company</td>
			<td>Z53021671</td>
			<td>Eri capsule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Four Seasons Institute of Biological Engineering</td>
			<td>20210402</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympms Corporation</td>
			<td>IX71-F32PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>SA00001- 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBM SPSS Statistics version 26.0</td>
			<td>International Business Machines Corporation, USA</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ 1.8.0</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunol&#160;fluorescence&#160;staining kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2021070901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Instruments Company</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.</td>
			<td>HH35L2018296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motic Inverted microscope</td>
			<td>Nanda Scientific Instruments Co.</td>
			<td>AE2000LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2014081301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat milk</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>16396-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-Akt</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>66444-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC12 cells</td>
			<td>Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>CBP60430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase protease inhibitor mixture</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2015082901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactive oxygen species assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RI-PA lysis solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scutellarin</td>
			<td>Chongqing Gao Ren Biotechnology Company</td>
			<td>27740-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample loading buffer, 5x</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company</td>
			<td>P0015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter tips (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Merck Biotechnology, Inc.</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Guangzhou saiguo biotech Company</td>
			<td>1115GR500&#160;</td>
			<td>TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo scientific Hyclone</td>
			<td>J190013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Company</td>
			<td>2021051301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex oscillator</td>
			<td>OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>VXMNAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc</td>
			<td>66009-1-Ig</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the two herb combination strategy to treat injured pc12 cells

Med tanke på fördelarna med kombinationen av traditionell kinesisk medicin (TCM) vid behandling av cerebral ischemi studerade vi skillnaderna i effekt och mekanism mellan preparatkombinationen och komponentkombinationen för att utforska de två örtkombinationsstrategierna för att behandla skadade PC12-celler. Koboltklorid (CoCl2) kombinerat med ett glukosfritt medium användes för att inducera oxidativ skada på PC12-celler. Därefter valdes den optimala kombinationen av Astragalus mongholicus (Ast) och Erigeron breviscapus (Eri) injektion och kombinerades enligt enhetliga designmetoder efter screening av deras säkra och effektiva koncentration på PC12-celler. Vidare innefattar den screenade komponentkombinationen 10 μM astragalosid A, 40 μM scutellarin och 75 μM klorogensyra i två örter. Därefter användes MTT, Annexin V-FITC / PI, immunofluorescens och Western blot-analys för att utvärdera effekten och mekanismen för preparatkombinationen och komponentkombinationen på skadade PC12-celler. Resultaten visade att den optimala kombinationen för cellöverlevnad var Ast-injektion och Eri-kapsel med en koncentration på 6:1,8 (μM). Komponentkombinationen (10 μM astragalosid A, 40 μM scutellarin och 75 μM klorogensyra) var effektivare än preparatkombinationen. Båda kombinationerna reducerade anmärkningsvärt apoptotisk hastighet, fluorescensintensiteten hos kaspas-3 och intracellulära reaktiva syrearter (ROS) nivå; under tiden uppreglerade de uttrycksnivåerna för p-Akt/Akt, Bcl-2/Bax och Nrf2. Dessa effekter var tydligare i komponentkombinationen. Sammanfattningsvis kan båda kombinationerna hämma skadan inducerad av CoCl2 i kombination med ett glukosfritt medium på PC12-celler, vilket främjar cellöverlevnad. Komponentkombinationens effektivitet över preparatkombinationen kan emellertid bero på dess starkare reglering av PI3K / Akt / Nrf2-signalvägen relaterad till oxidativ stress och apoptos.

Screening av den optimala kombinationen av AST injektion och Eri-kapsel visas i figur 1. Cellöverlevnaden för ASAT-injektion och Eri-kapsel på normala PC12-celler visas i figur 1A. Cellviabiliteten var lägre än 95 % vid ASAT-injektion vid koncentrationer högre än 12 μM (figur 1A) och Eri-kapsel vid koncentrationer större än 5 μM (figur 1A), vilket indikerar att den maximala icke-toxiska konc...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells at JoVE.com

Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells

Detta protokoll ger en kombinationsstrategi av två örter för att behandla skadade PC12-celler. Protokollet ger en referens för att optimera det bästa applikationsläget för traditionell kinesisk medicin (TCM).

Utforska de två örtkombinationsstrategierna för att behandla skadade PC12-celler

In view of the advantages of the combination of traditional Chinese medicine (TCM) in the treatment of cerebral ischemia, we studied the differences in ...

Protokollet i denna studie ger en kombinationsstrategi av två örter för behandling av hypoxiskadade PC12-celler och en referens för att optimera det bästa kombinationsläget för örter. Denna teknik kan ge en enkel, pålitlig och effektiv in vitro experimentell metod för screening av den effektiva ingredienskombinationen från örter, mot hypoxiala celler. Denna strategi kan också tillämpas för att screena komponentkombinationerna mot hypoxialceller från andra örtberedningskombinationer och illustrera deras skyddsmekanism.Till att börja med, subkultur PC12-cellerna varannan till var tredje dag vid 37 grader Celsius i en inkubator kompletterad med 5% koldioxid för att få en passage av 4 till 8 för alla efterföljande experiment. Behandla 70 till 80% konfluenta PC12-celler med en milliliter 0,25% trypsin och observera cellerna under ett mikroskop för cellavskiljning. Stoppa sedan trypsinsmältningen genom att tillsätta tre milliliter av hela mediet.Snurra ner de överförda cellerna i ett 15-milliliter centrifugrör vid 840 x g i fem minuter. Efter kassering av supernatanten, suspendera cellpelleten med hela mediet och överför cellsuspensionen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. För att räkna cellerna, starta flödescytometriprogramvaran och välj motsvarande utspädningsmultipel av celllösningen i räkningsinställningen.Klicka på Densitetsdiagram efter att ha laddat cellprovet. Cirkel cellpopulationen bort från x-axeln och y-axeln. Högerklicka på datatabellen under bilden och välj X, Y, Antal och Abs.Räkna för att få cellräkningsresultaten under datatabellen i Abs.Count. Efter justering av cellkoncentrationen ungefär till 1 gånger 10 till 5: e cellerna per milliliter med hela mediet, tillsätt 100 mikroliter av cellsuspensionen per brunn till en 96-brunnsplatta och inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 24 timmar. Nästa dag, till den supernatantkasserade plattan tillsätt 120 mikroliter av ett milligram per milliliter MTT-lösning i varje brunn och inkubera i fyra timmar vid 37 grader Celsius.Efter inkubation, när supernatanten kasseras, tillsätt 150 mikroliter DMSO till varje brunn. Håll plattan under skakning i en virveloscillator i 10 minuter med en hastighet av 240 gånger per minut. Mät sedan absorbansen vid 490 nanometer i en mikroplattläsare.För att screena den optimala kombinationen av läkemedel med homogen designmetod, odla cellerna som visats tidigare och behandla de skadade PC12-cellerna med sex olika proportionskoncentrationer av Astragalus injektion och breviscapuskapsel. För att utvärdera den skyddande effekten av två optimala kombinationer, behandla de skadade PC12-cellerna med de två typerna av kombinationer av läkemedel. Inkubera cellerna i 24 timmar och beräkna cellviabiliteten som visats tidigare.Frö PC12-cellerna i en 12-brunnsplatta och inkubera vid 37 grader Celsius i 24 timmar. Efter läkemedelsbehandling, behandla cellerna med 250 mikroliter trypsin per brunn och centrifugera cellerna vid 840 x g i fem minuter vid rumstemperatur. Resuspendera sedan cellpelleten med 500 mikroliter av bindningsbufferten.Tillsätt 5 mikroliter Annexin V-FITC, 10 mikroliter propidiumjodid i tre exemplar för varje grupp och inkubera cellerna i mörkret i 15 minuter vid rumstemperatur för att kontrollera apoptos med flödescytometri. I flödescytometerprogrammet klickar du på Automatisk kompensation på Start-menyn, väljer FITC, PE, PerCP och APC i Välj kanal och väljer Kompensation på höjd. Klicka sedan på OK i Statistikobjekt:Median.Klicka på Densitetskarta och ringa in den effektiva cellpopulationen med cellräkningsmetoden som visades tidigare. Med FITC-fluorescens som x-axelparameter och annan fluorescens som y-axelparameter skapar du ett densitetsschema. Klicka på Kompensationsmatris i Start-menyn och Koefficient i överflödesmatrisen.Frö PC12-cellerna till täckglasen placerade på en 24-brunnsplatta väl i tre exemplar och inkubera vid 37 grader Celsius i 24 timmar. Efter läkemedelsbehandling, skölj täckglasen två gånger med PBS i fem minuter vardera, fixa dem med 4% paraformaldehyd i 15 minuter och permeabilisera med 0,5% Triton X-100 i 20 minuter vid rumstemperatur. Efter sköljning av cellerna, blockera dem med 10% getserum i en timme vid rumstemperatur.Tillsätt 200 mikroliter utspädd primär antikroppskaspas-3 till varje täckglas och inkubera över natten vid 4 grader Celsius. Följande dag, tvätta tre gånger med TBST-buffert i tre minuter vardera och inkubera med 200 mikroliter sekundär antikropp i en timme vid rumstemperatur i mörkret. Efter inkubation, inkubera täckglasen med 300 mikroliter 0,5 mikrogram per milliliter DAPI i 10 minuter och tvätta cellerna tre gånger med TBST i fem minuter vardera.Ta täckglasbilderna under ett fluorescensmikroskop och analysera fluorescensintensiteten statistiskt med bildprogramvaran. Tvätta det läkemedelsbehandlade PC12-celltäcket tre gånger med PBS i tre minuter vardera och inkubera med 400 mikroliter 10 mikromolär diklor-dihydro-fluoresceindiacetat vid 37 grader Celsius i 20 minuter. Tvätta cellerna igen med serumfritt DMEM två gånger i tre minuter vardera.Tillsätt fluorescenssläckningsmedlet och ta omedelbart täckglasbilderna under ett fluorescensmikroskop för att beräkna den relativa fluorescensintensiteten med bildprogramvaran. Tvätta de läkemedelsbehandlade PC12-cellerna i en 6-brunnsplatta tre gånger med PBS i fem minuter vardera och inkubera på is i 30 minuter i den beredda lysbufferten på 100 mikroliter per brunn. Efter lys, centrifugera cellerna vid 16 000 x g i 20 minuter vid 4 grader Celsius för att samla supernatanten.Efter detektering av proteinkoncentrationen med Bradford-analys, kör en 12% SDS-PAGE elektrofores med 25 mikrogram protein i varje körfält och överför gelén till PVDF-membranet. Blockera membranen med 5% fettfri mjölk i 1,5 timmar vid rumstemperatur och inkubera med fem milliliter av motsvarande primära antikroppar i 24 timmar vid 4 grader Celsius. Efter inkubation och tvättning av membranet med TBST tre gånger i 10 minuter vardera, inkubera med fem milliliter sekundära HRP-konjugerade antikroppar vid rumstemperatur i två timmar.Slutligen, till det TBST-tvättade membranet, tillsätt kemiluminescerande HRP-substrat för detektering av proteinband enligt tillverkarens instruktioner. Ta sedan bilderna med hjälp av kemiluminiscensavbildningssystemet för att kvantifiera proteinernas gråvärden, med beta-aktin som intern kontroll. Cellviabiliteten på de normala PC12-cellerna var lägre än 95% med Astragalus-injektion vid koncentrationer större än 12 mikromolar och större än 5 mikromolar för breviscapuskapseln.Astragalus injektion kan förbättra överlevnaden av de skadade PC12-cellerna i koncentrationsområdet 6 till 12 mikromolar och breviscapuskapseln vid 2 till 5 mikromolar. Medan läkemedelskombinationen i ett förhållande av 6 till 1,8 mikromolar uppvisade den högsta cellviabiliteten. Cellviabiliteten hos de två kombinationerna på de skadade PC12-cellerna främjades signifikant och komponentkombinationen var överlägsen preparatkombinationen.Apoptosfrekvensen visade att procentandelarna av tidiga, sena och totala apoptotiska celler var signifikant högre i modellgruppen än i normalgruppen. Jämfört med modellgruppen var procentandelen apoptotiska celler i varje steg signifikant lägre i behandlingsgruppen. Fluorescensintensiteten för kaspas-3 var signifikant lägre i varje behandlingsgrupp jämfört med modellgruppen, och var relativt lägre i komponentkombinationsgruppen.Relativt uttryck av generna Akt, Bcl-2 och Bax avslöjade att komponentkombinationen är överlägsen preparatkombinationen för att främja cellöverlevnad, vilket är relaterat till den starkare anti-apoptoseffekten. Komponentkombinationen uppvisade en bättre antioxidativ skadeeffekt än preparatkombinationen, och signifikant högre uttryck av Nrf2-proteinet. Denna metod kan användas för att screena och utvärdera komponentkombinationen med andra potentiella farmakologiska aktiviteter från örtkombinationen, såsom antiinflammatorisk, antibakteriell och mer.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

En strategi för att identifiera de novo mutationer i vanliga sjukdomar som autism och schizofreni

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Catheter Ablation in Combination With Left Atrial Appendage Closure for Atrial Fibrillation

Kateterablation i kombination med vänster atriumbihang Stängning av förmaksflimmer

Atrial fibrillation (AF) is the most common sustained cardiac arrhythmia, affecting millions of individuals worldwide 1-3. The rapid, irregular, and ...

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Mätning och behandling av Suppression i Amblyopi

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolering, karakterisering och jämförande differentiering av mänskliga Dental celler Pulp Stem Härstammar från permanenta tänder med hjälp av två olika metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Dual-phase Cone-beam Computed Tomography to See, Reach, and Treat Hepatocellular Carcinoma during Drug-eluting Beads Transarterial Chemo-embolization

The advent of cone-beam computed tomography (CBCT) in the angiography suite has been revolutionary in interventional radiology. CBCT offers 3 ...

Tumor Treating Field Therapy in Combination with Bevacizumab for the Treatment of Recurrent Glioblastoma

Tumör Behandla Fältterapi i kombination med bevacizumab för behandling av återkommande glioblastom

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studera bukspottkörtelcancer Stem Cell egenskaper för att utveckla nya behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Development of Recombinant Proteins to Treat Chronic Pain

Utveckling av rekombinanta proteiner att behandla kronisk smärta

Chronic pain is difficult to treat and new approaches to resolve persistent pain are urgently needed. Anti-inflammatory cytokines are promising candidates ...

Three-Dimensional Collagen Matrix Scaffold Implantation as a Liver Regeneration Strategy

Tredimensionell kollagenmatris byggnadsställning implantation som en leverregenereringsstrategi

Liver diseases are the leading cause of death worldwide. Excessive alcohol consumption, a high-fat diet, and hepatitis C virus infection promote fibrosis, ...

Vessel-Sparing Microsurgical Longitudinal Intussusception Vasoepididymostomy to Treat Epididymal Obstructive Azoospermia

Kärlsparande mikrokirurgisk längsgående intussusception vasoepididymostomi för att behandla epididymal obstruktiv azoospermi

The epididymis is a common site of obstruction in obstructive azoospermia (OA). Vasoepididymostomy has become an important method for the treatment of ...