Name: microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus
Uploaded: 2022-12-16T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af den belgiske fond for Alzheimerforskning (SAO; projektnummer: 20200032), Research Foundation Flanders (FWO Vlaanderen; projektnumre: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) og Baillet Latour Fund. Vi takker VIB BioImaging Core for træning, støtte og adgang til instrumentparken.

Alle dyreforsøg beskrevet i denne undersøgelse blev udført i henhold til den nationale (belgisk lov 14/08/1986 og 22/12/2003, belgisk kongeligt dekret 06/04/2010) og europæisk lovgivning (EU-direktiver 2010/63 / EU, 86/609 / EØF). Alle forsøg på mus og dyreprotokoller blev godkendt af den etiske komité ved Gent Universitet (tilladelsesnumre LA1400091 og EF 2017-026).
1. Forberedelse
<ol><li>Anæstetika: Forbered en terminal bedøvelse. For eksempel kan der fremstille...

<ol>
	<li>Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hidden+epithelial+barrier+in+the+brain+with+a+central+role+in+regulating+brain+homeostasis.+Implications+for+aging.">A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging.</a> Annals of the American Thoracic Society. 13, 407-410 (2016).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).</li><li>Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+central+nervous+system+inflammation.">Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation.</a> Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).</li><li>Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+movers+and+shapers+in+immune+privilege+of+the+CNS.">The movers and shapers in immune privilege of the CNS.</a> Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).</li><li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces:+a+role+for+connexins.">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins.</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li><li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules.">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).</li><li>Redzic, Z. B., Segal, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+choroid+plexus+and+the+physiology+of+the+choroid+plexus+epithelium.">The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).</li><li>Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+anatomy+and+functions+of+the+choroid+plexus+in+healthy+and+diseased+brain.">The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430 (2020).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+leukocyte+infiltration+at+the+choroid+plexus+in+(neuro)inflammatory+disorders.">Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders.</a> Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).</li><li>Brkic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;oligomers+disrupt+blood-CSF+barrier+integrity+by+activating+matrix+metalloproteinases.">Amyloid &#946;oligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases.</a> Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).</li><li>Vandenbroucke, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloprotease+8-dependent+extracellular+matrix+cleavage+at+the+blood-CSF+barrier+contributes+to+lethality+during+systemic+inflammatory+diseases.">Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases.</a> Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+response+to+a+repeated+peripheral+inflammatory+stimulus.">The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus.</a> BMC Neuroscience. 10, 135 (2009).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease:+dialogues+into+and+out+of+the+brain.">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li><li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system.">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li><li>Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balanced+view+of+choroid+plexus+structure+and+function:+Focus+on+adult+humans.">A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans.</a> Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).</li><li>Lehtinen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+and+cerebrospinal+fluid:+emerging+roles+in+development,+disease,+and+therapy.">The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy.</a> Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).</li><li>Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+Alzheimer's+disease:+more+than+just+a+barrier.">The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier.</a> Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+implications+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+neuropsychiatric+disorders.">Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).</li><li>Simon, M. J., Iliff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebrospinal+fluid+(CSF)+flow+in+neurodegenerative,+neurovascular+and+neuroinflammatory+disease.">Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).</li><li>Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+role+for+CSF+turnover+and+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+late+onset+Alzheimer's+disease.">A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+iron+metabolism+is+part+of+the+choroid+plexus+response+to+peripheral+inflammation.">Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation.</a> Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).</li><li>Thouvenot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteomic+analysis+of+mouse+choroid+plexus+secretome+reveals+a+high+protein+secretion+capacity+of+choroidal+epithelial+cells.">The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells.</a> Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).</li><li>Vandendriessche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+extracellular+vesicle+secretion+at+the+blood-cerebrospinal+fluid+interface+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143 (2021).</li><li>Bowyer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+description+of+the+dissection+of+the+cerebral+surface+vasculature+and+associated+meninges+and+the+choroid+plexus+from+rat+brain.">A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4285 (2012).</li><li>Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+the+ciliary+movement+of+choroid+plexus+epithelial+cells+ex+vivo.">Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52991 (2015).</li><li>Dani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+and+spatial+map+of+the+choroid+plexus+across+brain+ventricles+and+ages.">A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages.</a> Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).</li><li>Carloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+choroid+plexus+vascular+barrier+closing+during+intestinal+inflammation.">Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation.</a> Science. 374 (6566), 439-448 (2021).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+Niemann-Pick+disease+type.">Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type.</a> C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482 (2021).</li><li>Shipley, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+calcium+dynamics+and+immune+surveillance+at+the+choroid+plexus+blood-cerebrospinal+fluid+interface.">Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface.</a> Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).</li><li>Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+studies+using+serial+block+face+and+focused+ion+beam+scan+electron+microscopy.">Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e59480 (2019).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+(SEM).">Scanning Electron Microscopy (SEM).</a> JoVE Science Education Database. , (2022).</li><li>Pauwels, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus+derived+extracelular+vesicles+exhibit+brain+targeting+characteristics).">Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics).</a> Biomaterials. 290, 121830 (2022).</li></ol>

Her beskrives en metode til at isolere choroid plexus (CP) ud af den laterale ventrikel og den fjerde ventrikel i en musehjerne. Hele denne monteringsmetode for CP letter yderligere analyse ved hjælp af et repertoire af teknikker for at få et komplet overblik over CP-morfologien, cellulær sammensætning, transkriptom, proteom og sekretom. Sådanne analyser er afgørende for at få en bedre forståelse af denne bemærkelsesværdige struktur, der stikker ud fra hjernens ventrikler. Denne viden er af enorm forskningsinte...

Stramme barrierer adskiller centralnervesystemet (CNS) fra periferien, herunder blod-hjerne-barrieren (BBB) og blod-cerebrospinalvæsken (CSF) barrieren. Disse barrierer beskytter CNS mod eksterne fornærmelser og sikrer et afbalanceret og kontrolleret mikromiljø 1,2,3. Mens BBB er blevet grundigt undersøgt over tid, har blod-CSF-barrieren placeret ved choroid plexus (CP) kun fået stigende forskningsinteresse i løbet af det sidste årti. Denne sidstnævnte barriere kan findes i hjernens fire ventrikler (figur 1A, B) og er kendetegnet ved et enkelt lag af choroid plexus epitelceller (CPE), der omgiver en central stroma, utætte kapillærer, fibroblaster og en lymfoid og myeloid cellepopulation (figur 1C) 4,5,6. CPE-cellerne er tæt forbundet med hinanden ved tætte kryds, hvilket forhindrer lækage fra de underliggende fenestrerede blodkapillærer ind i CSF og hjernen. Derudover reguleres transport på tværs af CPE-cellerne af en række ind- og udadgående transportsystemer, der styrer tilstrømningen af gavnlige forbindelser (f.eks. næringsstoffer og hormoner) fra blodet til CSF og udstrømningen af skadelige molekyler (f.eks. metabolisk affald, overskydende neurotransmittere) i den anden retning 1,6. For at kunne udøve deres aktive transportfunktion indeholder CPE-cellerne adskillige mitokondrier i deres cytoplasma7. Desuden er CP den vigtigste kilde til CSF og fungerer som hjernens gatekeeper ved tilstedeværelsen af residente inflammatoriske celler1. På grund af sin unikke placering mellem blodet og hjernen er CP også perfekt placeret til at udføre immunovervågning8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk oversigt over placeringen og sammensætningen af choroid plexus (CP). (A, B) CP-væv findes i de to laterale, den tredje og den fjerde ventrikel i (A) menneskelige og (B) musehjerner. (C) CP-vævet består af et enkelt lag af tæt forbundne kuboide CP-epitelceller (CPE), der omgiver fenestrerede kapillærer, løst bindevæv og lymfoide og myeloide celler og danner blod-cerebrospinalvæskebarrieren (tilpasset og modificeret fra reference23). Figur oprettet med Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
I løbet af det sidste årti har stigende beviser, herunder flere rapporter fra vores forskningsgruppe, afsløret, at CP spiller en central rolle i sundhed og sygdom 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . For eksempel er det kendt, at den aldrende blod-CSF-barriere viser morfologiske ændringer i blandt andet kernerne, mikrovilli og kældermembranen 1,19. Derudover er den overordnede barriereintegritet kompromitteret i forbindelse med Alzheimers sygdom, og alle disse aldersrelaterede ændringer synes at være endnu mere udtalte 1,8,20. Ud over morfologiske ændringer ændres CP's transkriptom, proteom og sekretom under sygdom 12,21,22,23. Således er avanceret viden om CP afgørende for bedre at forstå dens rolle i neurologiske sygdomme og potentielt udvikle nye terapeutiske strategier.
En effektiv metode til nøjagtig mikrodissektion af CP ud af hjernens ventrikler er det første uvurderlige skridt til at muliggøre korrekt undersøgelse af denne lille hjernestruktur. På grund af sin stærkt vaskulariserede natur (figur 2B) kan CP, der flyder inde i hjernens ventrikulære hulrum, identificeres ved hjælp af et kikkertmikroskop. Imidlertid kræves transkardieperfusion ofte til downstream-analyse, hvilket komplicerer korrekt identifikation og isolering af CP-vævet (figur 2C). Hvis de videre behandlingstrin tillader det (f.eks. i tilfælde af RNA- og proteinanalyse), kan CP visualiseres via transkardieperfusion med bromphenolblåt (figur 2A). Flere publikationer beskriver allerede isolationen af CP fra rotte24 og musehvalpehjerner25. Her beskrives en mikrodissektionsisoleringsteknik til isolering af CP fra voksne mus. Det er vigtigt, at denne isolationsteknik bevarer levedygtigheden, funktionen og strukturen af cellerne i CP. Isoleringen af CP, der flyder i fjerde og laterale ventrikler, er beskrevet her. Kort sagt bedøves musene terminalt og om nødvendigt transkardialt perfuserede. Det skal dog bemærkes, at perfusion kan beskadige strukturen af cellerne i CP. Hvis prøven skal analyseres ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM), seriel blokfladescanningelektronmikroskopi (SBF-SEM) eller fokuseret ionstråle SEM (FIB-SEM), bør perfusion derfor ikke udføres. Dernæst isoleres hele hjernen, og tang bruges til sagittalt hemisect hjernen. Herfra kan CP'erne, der flyder i laterale ventrikler, identificeres og dissekeres, mens CP fra fjerde ventrikel kan isoleres fra den cerebellære side af hjernen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig02.jpg"> Figur 2: Visualisering af (A-C) fjerde og (D-F) lateral ventrikel choroid plexus (CP) efter (A,D) bromphenolblå perfusion, (B,E) ingen perfusion og (C,F) perfusion med PBS/heparin. Billederne er taget med et stereomikroskop (8x-32x forstørrelse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Når CP er korrekt dissekeret ud af hjernens ventrikler, kan et helt repertoire af teknikker anvendes til at få yderligere forståelse for funktionen af denne struktur. For eksempel kan flowcytometri eller enkeltcelle RNA-sekventering udføres for at kvantificere og fænotypisk analysere de infiltrerende inflammatoriske celler under visse sygdomstilstande26,27. Ud over den cellulære sammensætning kan den molekylære sammensætning af CP analyseres for at vurdere tilstedeværelsen af cytokiner og kemokiner via enzymbundet immunosorbentassay (ELISA), immunoblot eller gennem samtidig analyse af flere cytokiner ved anvendelse af cytokinperlearrayet28. Desuden kan transkriptom-, vaskulær-, immuncellehistologi og sekretomanalyser udføres på de mikrodissekerede CP-eksplanter29. Her bruges scanningelektronmikroskopi (SEM) på helmonteret CP til at få et samlet overblik over CP-strukturen. SEM bruger en stråle af fokuserede elektroner til at scanne over overfladen og skabe et billede af overfladens topografi og sammensætning. Da elektronernes bølgelængde er meget mindre end lysets, er opløsningen af SEM i nanometerområdet og bedre end et lysmikroskop. Derfor kan morfologiske undersøgelser på det subcellulære niveau udføres via SEM. Kort fortalt overføres den dissekerede CP straks til et glutaraldehydholdigt fikseringsmiddel til en fiksering natten over efterfulgt af osmication og uranylacetatfarvning. Prøverne behandles derefter med blyaspartatplet, dehydreres og i sidste ende indlejres til billeddannelse.
Således letter denne protokol den effektive isolering af CP fra musehjerneventriklerne, som kan analyseres yderligere ved hjælp af en række nedstrømsteknikker til at undersøge dens struktur og funktion.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G x 1/2 needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium specimen mounts</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel surgial blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0210</td>
			<td>size: 0.45 mm x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon adhesive tabs -12 mm</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>77825-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer&#160;</td>
			<td>Bal-Tec&#160;</td>
			<td>CPD030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossbeam 540</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SEM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel</td>
			<td>Metrohm Belgium N.V</td>
			<td>CPA-7800160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide&#160;</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#160;</td>
			<td>Quorum&#160;</td>
			<td>Q150T ES</td>
			<td>PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kela NV</td>
			<td>514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Basket Stainless Steel</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>70190-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi DV4 Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus

Choroid plexus (CP), en stærkt vaskulariseret struktur, der stikker ud i hjernens ventrikler, er et af de mest understuderede væv inden for neurovidenskab. Da det bliver mere og mere klart, at denne lille struktur spiller en afgørende rolle i sundhed og sygdom i centralnervesystemet (CNS), er det yderst vigtigt at dissekere CP korrekt ud af hjernens ventrikler på en måde, der tillader nedstrøms behandling, lige fra funktionel til strukturel analyse. Her beskrives isolering af lateral og fjerde hjerneventrikelmus CP uden behov for specialværktøj eller udstyr. Denne isolationsteknik bevarer levedygtigheden, funktionen og strukturen af celler inden for CP. På grund af sin høje vaskularisering kan CP visualiseres flydende inde i hjernens ventrikulære hulrum ved hjælp af et kikkertmikroskop. Imidlertid kan transkardieperfusion, der kræves til downstream-analyse, komplicere identifikationen af CP-vævet. Afhængigt af de videre behandlingstrin (f.eks. RNA- og proteinanalyse) kan dette løses ved at visualisere CP via transkardial perfusion med bromphenolblåt. Efter isolering kan CP behandles ved hjælp af flere teknikker, herunder RNA, protein eller enkeltcelleanalyse, for at få yderligere forståelse for funktionen af denne specielle hjernestruktur. Her bruges scanningelektronmikroskopi (SEM) på helmonteret CP til at få et samlet overblik over strukturen.

Den beskrevne protokol letter effektiv isolering af CP fra musehjernens laterale (figur 2A-C) og fjerde (figur 2D-F) ventrikler. Efter isolering af hele hjernen bruges tang til sagittalt hemisect hjernen og identificere CP'erne, der flyder i laterale ventrikler. CP fra fjerde ventrikel kan isoleres fra den cerebellære side af hjernen. Perfusion med bromphenolblåt kan bruges til at visualisere ...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus at JoVE.com

Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

Choroid plexus (CP), et understuderet væv i neurovidenskab, spiller en nøglerolle i sundhed og sygdom i centralnervesystemet. Denne protokol beskriver en mikrodissektionsteknik til isolering af CP og brugen af scanningelektronmikroskopi for at få et samlet overblik over dets cellulære struktur.

Mikrodissektion og helmonteret scanningelektronmikroskopi visualisering af musechoroid plexus

The choroid plexus (CP), a highly vascularized structure protruding into the ventricles of the brain, is one of the most understudied tissues in ...

For at få et bedre indblik i sammensætningen og strukturen af choroid plexus er en effektiv metode til at isolere choroid plexus ud af hjernens ventrikler et første uvurderligt skridt. Med denne mikrodissektionsteknik er det muligt at dissekere choroid plexus ud af hjernens ventrikler, mens den indeholder dens funktion, levedygtighed og struktur uden at forurene choroid plexus med omgivende væv. En betydelig hindring i choroid plexus isolering er at identificere strukturen, da den stadig flyder i hjernens ventrikler.Farvning af choroid plexus med bromphenolblå letter isoleringen. Elien Van Wonterghem, vores laboratoriechef, demonstrerer proceduren. Begynd med at forberede en terminal bedøvelsesmiddel, transkardial perfusionsopløsning og en opløsning, der kræves til scanning af elektronmikroskopi eller SEM og andre opløsninger som nævnt i teksten.For at isolere musehjernen skal du placere det terminalt bedøvede dyr i dorsal decubitusposition og fastgøre musen ved at fastgøre lemmerne på en plade. Desinficer brystet ved at sprøjte 70% ethanol, før du laver et snit på cirka fire centimeter lige under membranen ved hjælp af et kirurgisk blad i kulstofstål. Åbn huden og udsæt brystet ved hjælp af kirurgisk saks.Skær membranen helt åben og adskil brystkassen for at udsætte lungerne og det bankende hjerte. Brug af en perfusionspumpe transkardialt perfusere musen med 10 ml perfusionsopløsning med en hastighed på 4, 5 ml pr. Minut. Indsæt en 26-gauge nål i venstre ventrikel for at pumpe opløsningen ind i det systemiske kredsløb.Brug kirurgisk saks til at skære det højre atrium for blodet at komme ud af omløb. Efter halshugning af musen skal du åbne hovedbunden ved at lave et snit, der starter mellem ørerne til den overordnede for øjnene. Træk huden sideværts for at udsætte kraniet.Skær derefter kraniet op ved at følge squamosal suturerne mod næsedelen. Når du er færdig, skal du placere hjernen i en iskold petriskål og tilføje en milliliter iskold PBS til hjernevævet. For at isolere choroid plexus, der flyder i fjerde ventrikel, skal du forsigtigt afskære cerebellum fra cerebrum ved hjælp af en skalpel.Fjern de resterende hjernestammevævsdele fra lillehjernen. Drej hjernen, så skærelinjen vender opad, og sørg for, at det fjerde ventrikelhulrum er synligt i midten af sektionen med choroid plexus liggende på dorsalstedet. Åbn om nødvendigt ventriklen ved at trække bindevævet med skarpe tang.Riv forsigtigt choroid plexus ud af ventrikelvæggen ved hjælp af små skarpe tang. For at isolere choroid plexus fra den laterale ventrikel skærer sagittalt hjernen i to halvkugler ved hjælp af små skarpe tang. Drej en hjernehalvdel, så skærelinjen er opad.For at afsløre den laterale ventrikel skal du forsigtigt trække cortex væk fra thalamus. Træk hippocampus tilbage til den midterste sagittale skærelinje. Den laterale ventrikel er nu synlig med choroid plexus liggende i bunden af ventriklen.Åbn om nødvendigt ventriklen lidt ved at trække bindevævet op med skarpe tang. Brug små skarpe tang til forsigtigt at rive choroid plexus ud af ventrikelvæggen. For at udføre prøveforberedelsen til SEM overføres den nyligt isolerede choroid plexus til frisklavet fikseringsopløsning og inkuberes natten over ved fire grader Celsius.Når det er gjort, vaskes prøven tre gange med tre til fem ml 0,1 molær natriumcacodylatbuffer i fem minutter hver. Postfix prøverne i tre til fem ml 2% osmiumtetroxid i 0,1 molær natriumcacodylatbuffer i 30 minutter. Vask derefter prøverne tre gange i fem minutter hver med tre til fem ml ultrarent vand.Derefter dehydreres prøverne i en stigende række iskolde ethylalkoholkoncentrationer med 15 minutter pr. Ethylalkoholopløsning. Brug en kritisk punkttørrer til at tørre prøven ordentligt. Placer prøven forsigtigt på en prøvemontering med et carbon-klistermærke, og visualiser choroid plexus-prøverne ved hjælp af SEM.Den nuværende protokol lettede effektiv isolering af choroid plexus fra musehjernens laterale og fjerde ventrikler. Perfusion med bromphenolblåt resulterede i visualisering af choroid plexus. Når bromphenolblåt ikke var tilladt i de videre forarbejdningstrin, blev der udført perfusion med PBS-heparin eller ingen perfusion til behandling.Den SEM morfologiske analyse af overfladen af choroid plexus epitel, eller CPE, celler viser tydeligt de to armstrukturer i den fjerde ventrikel og den typiske C-formede form af lateral choroid plexus isoleret fra lateral ventrikel. En højere SEM-forstørrelse afslørede vesikellignende strukturer på den apikale side af CPE-celler og mikrovilli, hvilket indikerer, at morfologiske ændringer af CPE-cellerne under sygdomstilstande kan undersøges ved hjælp af SEM. Det er vigtigt kun at røre ved og tage plexusvævet choroid ud for ikke at forurene prøven med omgivende væv.Vær forsigtig med at bevare strukturen af choroid plexus. En række nedstrømsteknikker kan anvendes på den isolerede choroid plexus for at undersøge dens struktur og funktion, der går fra mikroskopanalyse over transkriptomanalyse til flowcytometri. Mikrodissekering af choroid plexus ud af hjernen giver os mulighed for at få et bedre indblik i strukturen og funktionen af dette lille hjernevæv.Denne viden er afgørende for bedre at forstå dens rolle i neurologiske sygdomme.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Reproducerbar Mouse iskiasnerven Crush og efterfølgende vurdering af Regeneration af Whole Mount Muskel Analyse

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

En visuel beskrivelse af dissektion af cerebral Surface vaskulatur og associerede meninges og choroid plexus fra rottehjerne

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Hele Mount immunfluorescensfarvning af Neonatal Mouse Retina at undersøge Angiogenesis<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Hele-mount Imaging af museembryo Sensory Axon Fremskrivninger

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Observation af den ciliære Bevægelse af plexus chorioideus epitelceller<em&gt; Ex vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Hele Mount Dissektion og Immunofluorescens af Voksen Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Analyse af Brain mitokondrier Brug Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...