Name: microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus
Uploaded: 2022-12-16T14:10:00
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Ce travail a été soutenu par la Fondation belge pour la recherche sur la maladie d’Alzheimer (SAO; numéro de projet: 20200032), la Fondation pour la recherche Flandre (FWO Vlaanderen; numéros de projet: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) et le Fonds Baillet Latour. Nous remercions le VIB BioImaging Core pour la formation, le soutien et l’accès au parc d’instruments.

Toutes les expérimentations animales décrites dans cette étude ont été menées conformément à la législation nationale (loi belge 14/08/1986 et 22/12/2003, arrêté royal belge 06/04/2010) et européenne (directives européennes 2010/63/UE, 86/609/CEE). Toutes les expériences sur des souris et des protocoles animaux ont été approuvées par le comité d’éthique de l’Université de Gand (numéros de permis LA1400091 et CE 2017-026).
1. Préparation
<ol><li>Anes...

<ol>
	<li>Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hidden+epithelial+barrier+in+the+brain+with+a+central+role+in+regulating+brain+homeostasis.+Implications+for+aging.">A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging.</a> Annals of the American Thoracic Society. 13, 407-410 (2016).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).</li><li>Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+central+nervous+system+inflammation.">Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation.</a> Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).</li><li>Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+movers+and+shapers+in+immune+privilege+of+the+CNS.">The movers and shapers in immune privilege of the CNS.</a> Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).</li><li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces:+a+role+for+connexins.">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins.</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li><li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules.">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).</li><li>Redzic, Z. B., Segal, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+choroid+plexus+and+the+physiology+of+the+choroid+plexus+epithelium.">The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).</li><li>Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+anatomy+and+functions+of+the+choroid+plexus+in+healthy+and+diseased+brain.">The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430 (2020).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+leukocyte+infiltration+at+the+choroid+plexus+in+(neuro)inflammatory+disorders.">Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders.</a> Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).</li><li>Brkic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;oligomers+disrupt+blood-CSF+barrier+integrity+by+activating+matrix+metalloproteinases.">Amyloid &#946;oligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases.</a> Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).</li><li>Vandenbroucke, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloprotease+8-dependent+extracellular+matrix+cleavage+at+the+blood-CSF+barrier+contributes+to+lethality+during+systemic+inflammatory+diseases.">Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases.</a> Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+response+to+a+repeated+peripheral+inflammatory+stimulus.">The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus.</a> BMC Neuroscience. 10, 135 (2009).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease:+dialogues+into+and+out+of+the+brain.">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li><li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system.">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li><li>Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balanced+view+of+choroid+plexus+structure+and+function:+Focus+on+adult+humans.">A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans.</a> Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).</li><li>Lehtinen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+and+cerebrospinal+fluid:+emerging+roles+in+development,+disease,+and+therapy.">The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy.</a> Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).</li><li>Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+Alzheimer's+disease:+more+than+just+a+barrier.">The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier.</a> Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+implications+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+neuropsychiatric+disorders.">Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).</li><li>Simon, M. J., Iliff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebrospinal+fluid+(CSF)+flow+in+neurodegenerative,+neurovascular+and+neuroinflammatory+disease.">Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).</li><li>Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+role+for+CSF+turnover+and+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+late+onset+Alzheimer's+disease.">A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+iron+metabolism+is+part+of+the+choroid+plexus+response+to+peripheral+inflammation.">Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation.</a> Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).</li><li>Thouvenot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteomic+analysis+of+mouse+choroid+plexus+secretome+reveals+a+high+protein+secretion+capacity+of+choroidal+epithelial+cells.">The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells.</a> Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).</li><li>Vandendriessche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+extracellular+vesicle+secretion+at+the+blood-cerebrospinal+fluid+interface+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143 (2021).</li><li>Bowyer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+description+of+the+dissection+of+the+cerebral+surface+vasculature+and+associated+meninges+and+the+choroid+plexus+from+rat+brain.">A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4285 (2012).</li><li>Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+the+ciliary+movement+of+choroid+plexus+epithelial+cells+ex+vivo.">Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52991 (2015).</li><li>Dani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+and+spatial+map+of+the+choroid+plexus+across+brain+ventricles+and+ages.">A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages.</a> Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).</li><li>Carloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+choroid+plexus+vascular+barrier+closing+during+intestinal+inflammation.">Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation.</a> Science. 374 (6566), 439-448 (2021).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+Niemann-Pick+disease+type.">Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type.</a> C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482 (2021).</li><li>Shipley, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+calcium+dynamics+and+immune+surveillance+at+the+choroid+plexus+blood-cerebrospinal+fluid+interface.">Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface.</a> Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).</li><li>Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+studies+using+serial+block+face+and+focused+ion+beam+scan+electron+microscopy.">Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e59480 (2019).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+(SEM).">Scanning Electron Microscopy (SEM).</a> JoVE Science Education Database. , (2022).</li><li>Pauwels, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus+derived+extracelular+vesicles+exhibit+brain+targeting+characteristics).">Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics).</a> Biomaterials. 290, 121830 (2022).</li></ol>

Ici, une méthode pour isoler le plexus choroïde (CP) hors du ventricule latéral et du quatrième ventricule d’un cerveau de souris est décrite. Toute cette méthode de montage du CP facilite une analyse plus approfondie en utilisant un répertoire de techniques pour obtenir une vue complète de la morphologie du CP, de la composition cellulaire, du transcriptome, du protéome et du sécrétome. De telles analyses sont cruciales pour mieux comprendre cette structure remarquable qui dépasse des ventricules du cervea...

Des barrières serrées séparent le système nerveux central (SNC) de la périphérie, y compris la barrière hémato-encéphalique (BHE) et la barrière hémato-céphalo-rachidien (LCR). Ces barrières protègent le SNC contre les agressions extérieures et assurent un microenvironnement équilibré et contrôlé 1,2,3. Alors que la BHE a été largement étudiée au fil du temps, la barrière hémato-LCR située au plexus choroïde (PC) n’a fait que susciter un intérêt croissant de la recherche au cours de la dernière décennie. Cette dernière barrière se trouve dans les quatre ventricules du cerveau (Figure 1A, B) et se caractérise par une seule couche de cellules épithéliales du plexus choroïde (CPE) entourant un stroma central, des capillaires qui fuient, des fibroblastes et une population de cellules lymphoïdes et myéloïdes (Figure 1C)4,5,6. Les cellules CPE sont fermement interconnectées par des jonctions serrées, empêchant ainsi les fuites des capillaires sanguins fenêtrés sous-jacents dans le LCR et le cerveau. De plus, le transport à travers les cellules CPE est régulé par un certain nombre de systèmes de transport vers l’intérieur et vers l’extérieur qui gèrent l’afflux de composés bénéfiques (p. ex. nutriments et hormones) du sang vers le LCR et l’efflux de molécules nocives (p. ex. déchets métaboliques, neurotransmetteurs en excès) dans l’autre sens 1,6. Pour pouvoir exercer leur fonction de transport actif, les cellules CPE contiennent de nombreuses mitochondries dans leur cytoplasme7. De plus, le CP est la principale source de LCR et agit comme le gardien du cerveau par la présence de cellules inflammatoires résidentes1. En raison de son emplacement unique entre le sang et le cerveau, le PC est également parfaitement positionné pour effectuer une surveillance immunitaire8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble schématique de l’emplacement et de la composition du plexus choroïde (CP). (A,B) Le tissu CP se trouve dans les deux ventricules latéraux, le troisième et le quatrième ventricules (A) du cerveau humain et (B) du cerveau de la souris. (C) Le tissu CP est constitué d’une seule couche de cellules cuboïdes de l’épithélium CP (CPE) étroitement connectées entourant les capillaires fenêtrés, le tissu conjonctif lâche et les cellules lymphoïdes et myéloïdes, et forme la barrière hémato-céphalorachidienne (adaptée et modifiée à partir de la référence23). Figure créée avec Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Au cours de la dernière décennie, de plus en plus de preuves, y compris plusieurs rapports de notre groupe de recherche, ont révélé que la PC joue un rôle central dans la santé et la maladie 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Par exemple, on sait que la barrière hémato-LCR vieillissante présente des altérations morphologiques dans, entre autres, les noyaux, les microvillosités et la membrane basale 1,19. De plus, dans le contexte de la maladie d’Alzheimer, l’intégrité globale de la barrière est compromise et tous ces changements liés à l’âge semblent être encore plus prononcés 1,8,20. En plus des changements morphologiques, le transcriptome, le protéome et le sécrétome de la PC sont modifiés au cours de la maladie 12,21,22,23. Ainsi, une connaissance avancée de la PC est essentielle pour mieux comprendre son rôle dans les maladies neurologiques et potentiellement développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Une méthode efficace de microdissection précise de la PC hors des ventricules cérébraux est la première étape inestimable pour permettre une étude appropriée de cette minuscule structure cérébrale. En raison de sa nature hautement vascularisée (Figure 2B), la PC flottant à l’intérieur des cavités ventriculaires du cerveau peut être identifiée à l’aide d’un microscope binoculaire. Cependant, la perfusion transcardique est souvent nécessaire pour l’analyse en aval, ce qui complique l’identification et l’isolement corrects du tissu CP (Figure 2C). Si les étapes de traitement ultérieures le permettent (par exemple, dans le cas de l’analyse de l’ARN et des protéines), la PC peut être visualisée par perfusion transcardique avec du bleu de bromophénol (Figure 2A). Plusieurs publications décrivent déjà l’isolement du PC à partir de cerveaux de rats24 et de petits souris25. Ici, une technique d’isolement par microdissection est décrite pour isoler la PC des souris adultes. Il est important de noter que cette technique d’isolement préserve la viabilité, la fonction et la structure des cellules au sein du CP. L’isolement de la PC flottant dans le quatrième ventricule et les ventricules latéraux est décrit ici. En bref, les souris sont anesthésiées en phase terminale et, si nécessaire, perfusées par voie transcardale. Cependant, il convient de noter que la perfusion peut endommager la structure des cellules au sein du CP. Par conséquent, si l’échantillon doit être analysé par microscopie électronique à transmission (MET), microscopie électronique à balayage de face de bloc série (SBF-SEM) ou MEB à faisceau d’ions focalisés (FIB-MEB), la perfusion ne doit pas être effectuée. Ensuite, tout le cerveau est isolé et des forceps sont utilisés pour hémisecter le cerveau de manière sagittique. De là, les PC flottant dans les ventricules latéraux peuvent être identifiés et disséqués, tandis que les PC du quatrième ventricule peuvent être isolés du côté cérébelleux du cerveau.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig02.jpg"> Figure 2 : Visualisation du (A-C) quatrième et (D-F) ventricule latéral du plexus choroïde (CP) après perfusion au bleu de bromophénol (A,D), (B,E) pas de perfusion et (C,F) perfusion avec PBS/héparine. Les images sont prises au stéréomicroscope (grossissement 8x-32x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Une fois que la PC est correctement disséquée hors des ventricules cérébraux, tout un répertoire de techniques peut être appliqué pour mieux comprendre la fonction de cette structure. Par exemple, la cytométrie en flux ou le séquençage de l’ARN unicellulaire peuvent être effectués pour quantifier et analyser phénotypiquement les cellules inflammatoires infiltrantes dans certaines conditions pathologiques26,27. En plus de la composition cellulaire, la composition moléculaire du PC peut être analysée pour évaluer la présence de cytokines et de chimiokines via un test immuno-enzymatique (ELISA), immunoblot, ou par analyse simultanée de plusieurs cytokines à l’aide du réseau de billes de cytokines28. De plus, des analyses du transcriptome, vasculaire, histologie des cellules immunitaires et sécrétome peuvent être effectuées sur les explants CP microdisséqués29. Ici, la microscopie électronique à balayage (MEB) sur l’ensemble de la monture CP est utilisée pour obtenir une vue d’ensemble de la structure de la CP. Le MEB utilise un faisceau d’électrons focalisés pour balayer la surface et créer une image de la topographie et de la composition de la surface. Comme la longueur d’onde des électrons est beaucoup plus petite que celle de la lumière, la résolution du MEB est de l’ordre du nanomètre et supérieure à celle d’un microscope optique. Par conséquent, les études morphologiques au niveau subcellulaire peuvent être effectuées via SEM. En bref, le CP disséqué est immédiatement transféré dans un fixateur contenant du glutaraldéhyde pour une fixation nocturne, suivie d’une osmication et d’une coloration à l’acétate d’uranyle. Les échantillons sont ensuite traités avec une coloration à l’aspartate de plomb, déshydratés et finalement intégrés pour l’imagerie.
Ainsi, ce protocole facilite l’isolement efficace de la PC des ventricules cérébraux de la souris, qui peut être analysée plus en détail à l’aide d’une variété de techniques en aval pour étudier sa structure et sa fonction.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G x 1/2 needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium specimen mounts</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel surgial blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0210</td>
			<td>size: 0.45 mm x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon adhesive tabs -12 mm</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>77825-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer&#160;</td>
			<td>Bal-Tec&#160;</td>
			<td>CPD030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossbeam 540</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SEM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel</td>
			<td>Metrohm Belgium N.V</td>
			<td>CPA-7800160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide&#160;</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#160;</td>
			<td>Quorum&#160;</td>
			<td>Q150T ES</td>
			<td>PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kela NV</td>
			<td>514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Basket Stainless Steel</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>70190-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi DV4 Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus

Le plexus choroïde (CP), une structure hautement vascularisée faisant saillie dans les ventricules du cerveau, est l’un des tissus les moins étudiés en neurosciences. Comme il devient de plus en plus clair que cette minuscule structure joue un rôle crucial dans la santé et la maladie du système nerveux central (SNC), il est de la plus haute importance de disséquer correctement la PC hors des ventricules cérébraux d’une manière qui permet un traitement en aval, allant de l’analyse fonctionnelle à l’analyse structurelle. Ici, l’isolement de la PC de souris ventricule latéral et quatrième cerveau sans avoir besoin d’outils ou d’équipement spécialisés est décrit. Cette technique d’isolement préserve la viabilité, la fonction et la structure des cellules au sein du CP. En raison de sa vascularisation élevée, le CP peut être visualisé flottant à l’intérieur des cavités ventriculaires du cerveau à l’aide d’un microscope binoculaire. Cependant, la perfusion transcardique requise pour l’analyse en aval peut compliquer l’identification du tissu CP. En fonction des étapes de traitement ultérieures (par exemple, analyse de l’ARN et des protéines), cela peut être résolu en visualisant le PC par perfusion transcardique avec du bleu de bromophénol. Après isolement, la PC peut être traitée à l’aide de plusieurs techniques, y compris l’analyse de l’ARN, des protéines ou d’une seule cellule, pour mieux comprendre la fonction de cette structure cérébrale spéciale. Ici, la microscopie électronique à balayage (MEB) sur l’ensemble de la monture CP est utilisée pour obtenir une vue d’ensemble de la structure.

Le protocole décrit facilite l’isolement efficace de la PC à partir des ventricules latéraux (Figure 2A-C) et quatrième (Figure 2D-F) du cerveau de la souris. Après avoir isolé tout le cerveau, les forceps sont utilisés pour hémisecter le cerveau de manière sagittale et identifier les PC flottant dans les ventricules latéraux. La PC du quatrième ventricule peut être isolée du côt...

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Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

Le plexus choroïde (CP), un tissu peu étudié en neurosciences, joue un rôle clé dans la santé et la maladie du système nerveux central. Ce protocole décrit une technique de microdissection pour isoler le CP et l’utilisation de la microscopie électronique à balayage pour obtenir une vue d’ensemble de sa structure cellulaire.

Microdissection et microscopie électronique à balayage à monture entière Visualisation du plexus choroïde de souris

The choroid plexus (CP), a highly vascularized structure protruding into the ventricles of the brain, is one of the most understudied tissues in ...

Pour mieux comprendre la composition et la structure du plexus choroïde, une méthode efficace pour isoler le plexus choroïde des ventricules cérébraux est une première étape inestimable. Avec cette technique de microdissection, il est possible de disséquer le plexus choroïde hors des ventricules cérébraux tout en contenant sa fonction, sa viabilité et sa structure sans contaminer le plexus choroïde avec les tissus environnants. Un obstacle important dans l’isolement du plexus choroïde est l’identification de la structure car elle flotte encore dans les ventricules cérébraux.La coloration du plexus choroïde avec du bleu de bromophénol facilite l’isolement. La procédure sera présentée par Elien Van Wonterghem, notre responsable de laboratoire. Commencez par préparer une solution d’anesthésie terminale, de perfusion transcardique et une solution requise pour la microscopie électronique à balayage, ou MEB, et d’autres solutions mentionnées dans le texte.Pour isoler le cerveau de la souris, placez l’animal anesthésié en phase terminale dans la position du décubitus dorsal et fixez la souris en épinglant les membres sur une plaque. Désinfectez la poitrine en pulvérisant de l’éthanol à 70% avant de faire une incision d’environ quatre centimètres juste sous le diaphragme à l’aide d’une lame chirurgicale en acier au carbone. Ouvrez la peau et exposez la poitrine à l’aide de ciseaux chirurgicaux.Coupez complètement le diaphragme et séparez le thorax pour exposer les poumons et le cœur qui bat. À l’aide d’une pompe à perfusion transcardiale, la souris perfuse avec 10 millilitres de solution de perfusion à un taux de 4,5 millilitres par minute. Insérez une aiguille de calibre 26 dans le ventricule gauche pour pomper la solution dans le circuit systémique.À l’aide de ciseaux chirurgicaux, coupez l’oreillette droite pour que le sang sorte de la circulation. Après la décapitation de la souris, coupez le cuir chevelu en faisant une incision commençant entre les oreilles jusqu’aux yeux supérieurs aux yeux. Tirez la peau latéralement pour exposer le crâne.Ensuite, coupez le crâne en suivant les sutures squamosales vers la partie nasale. Une fois cela fait, placez le cerveau dans une boîte de Petri glacée et ajoutez un millilitre de PBS glacé au tissu cérébral. Pour isoler le plexus choroïde flottant dans le quatrième ventricule, coupez doucement le cervelet du cerveau à l’aide d’un scalpel.Retirez les parties restantes du tissu du tronc cérébral du cervelet. Faites pivoter le cerveau de manière à ce que la ligne de coupe soit tournée vers le haut, en veillant à ce que la quatrième cavité ventriculaire soit visible au milieu de la section avec le plexus choroïde situé sur le site dorsal. Si nécessaire, ouvrez le ventricule en tirant le tissu conjonctif avec une pince tranchante.Arrachez doucement le plexus choroïde de la paroi du ventricule à l’aide de minuscules pinces tranchantes. Pour isoler le plexus choroïde du ventricule latéral, coupez sagittiquement le cerveau en deux hémisphères à l’aide de minuscules pinces tranchantes. Faites pivoter un hémisphère cérébral de sorte que la ligne de coupe soit vers le haut.Pour révéler le ventricule latéral, retirez doucement le cortex du thalamus. Rétractez l’hippocampe à la ligne de coupe mi-sagittale. Le ventricule latéral est maintenant visible avec le plexus choroïde situé au bas du ventricule.Si nécessaire, ouvrez un peu le ventricule en ouvrant le tissu conjonctif avec une pince tranchante. Utilisez de minuscules pinces tranchantes pour arracher doucement le plexus choroïde de la paroi du ventricule. Pour effectuer la préparation de l’échantillon pour le SEM, transférer le plexus choroïde fraîchement isolé dans une solution de fixation fraîchement préparée et incuber pendant une nuit à quatre degrés Celsius.Une fois cela fait, laver l’échantillon trois fois en utilisant trois à cinq millilitres de tampon cacodylate de sodium 0,1 molaire pendant cinq minutes chacun. Postfixer les échantillons dans trois à cinq millilitres de tétroxyde d’osmium 2% dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 molaire pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les échantillons trois fois pendant cinq minutes chacun en utilisant trois à cinq millilitres d’eau ultrapure.Ensuite, déshydrater les échantillons dans une série croissante de concentrations d’alcool éthylique glacé avec 15 minutes par solution d’alcool éthylique. Utilisez un sécheur à point critique pour sécher correctement l’échantillon. Placez soigneusement l’échantillon sur un support d’échantillon avec un autocollant en carbone et visualisez les échantillons de plexus choroïde en utilisant SEM.Le présent protocole a facilité l’isolement efficace du plexus choroïde des ventricules latéraux et quatrièmes du cerveau de la souris. La perfusion avec le bleu de bromophénol a permis de visualiser le plexus choroïde. Lorsque le bleu de bromophénol n’était pas autorisé dans les étapes de traitement ultérieures, la perfusion avec de l’héparine PBS ou aucune perfusion n’a été effectuée pour le traitement.L’analyse morphologique SEM de la surface des cellules épithéliales du plexus choroïde, ou CPE, montre clairement la structure à deux bras du quatrième ventricule et la forme typique en forme de C du plexus choroïde latéral isolée du ventricule latéral. Un grossissement SEM plus élevé a révélé des structures ressemblant à des vésicules sur la face apicale des cellules CPE et des microvillosités, indiquant que les altérations morphologiques des cellules CPE dans des conditions pathologiques peuvent être étudiées à l’aide de la MEB. Il est important de toucher et de retirer uniquement le tissu du plexus choroïde afin de ne pas contaminer l’échantillon avec les tissus environnants.Soyez prudent pour préserver la structure du plexus choroïde. Une variété de techniques en aval peuvent être appliquées sur le plexus choroïde isolé pour étudier sa structure et sa fonction, allant de l’analyse au microscope à la cytométrie en flux, en passant par l’analyse du transcriptome. La microdissection du plexus choroïde hors du cerveau nous permet de mieux comprendre la structure et la fonction de ce minuscule tissu cérébral.Ces connaissances sont essentielles pour mieux comprendre son rôle dans les maladies neurologiques.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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