Name: microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus
Uploaded: 2022-12-16T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הבלגית לחקר האלצהיימר (SAO; מספר פרויקט: 20200032), קרן המחקר פלנדריה (FWO Vlaanderen; מספרי הפרויקט: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) וקרן Baillet Latour. אנו מודים ל-VIB BioImaging Core על ההכשרה, התמיכה והגישה לפארק המכשירים.

כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים במחקר זה נערכו על פי החקיקה הלאומית (החוק הבלגי 14/08/1986 ו- 22/12/2003, הצו המלכותי הבלגי 06/04/2010) והחקיקה האירופית (הנחיות האיחוד האירופי 2010/63/EU, 86/609/EEC). כל הניסויים בעכברים ובפרוטוקולים של בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת גנט (מספרי היתרים LA1400091 ו- EC 2017-...

<ol>
	<li>Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hidden+epithelial+barrier+in+the+brain+with+a+central+role+in+regulating+brain+homeostasis.+Implications+for+aging.">A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging.</a> Annals of the American Thoracic Society. 13, 407-410 (2016).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).</li><li>Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+central+nervous+system+inflammation.">Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation.</a> Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).</li><li>Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+movers+and+shapers+in+immune+privilege+of+the+CNS.">The movers and shapers in immune privilege of the CNS.</a> Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).</li><li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces:+a+role+for+connexins.">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins.</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li><li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules.">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).</li><li>Redzic, Z. B., Segal, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+choroid+plexus+and+the+physiology+of+the+choroid+plexus+epithelium.">The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).</li><li>Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+anatomy+and+functions+of+the+choroid+plexus+in+healthy+and+diseased+brain.">The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430 (2020).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+leukocyte+infiltration+at+the+choroid+plexus+in+(neuro)inflammatory+disorders.">Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders.</a> Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).</li><li>Brkic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;oligomers+disrupt+blood-CSF+barrier+integrity+by+activating+matrix+metalloproteinases.">Amyloid &#946;oligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases.</a> Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).</li><li>Vandenbroucke, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloprotease+8-dependent+extracellular+matrix+cleavage+at+the+blood-CSF+barrier+contributes+to+lethality+during+systemic+inflammatory+diseases.">Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases.</a> Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+response+to+a+repeated+peripheral+inflammatory+stimulus.">The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus.</a> BMC Neuroscience. 10, 135 (2009).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease:+dialogues+into+and+out+of+the+brain.">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li><li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system.">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li><li>Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balanced+view+of+choroid+plexus+structure+and+function:+Focus+on+adult+humans.">A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans.</a> Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).</li><li>Lehtinen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+and+cerebrospinal+fluid:+emerging+roles+in+development,+disease,+and+therapy.">The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy.</a> Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).</li><li>Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+Alzheimer's+disease:+more+than+just+a+barrier.">The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier.</a> Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+implications+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+neuropsychiatric+disorders.">Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).</li><li>Simon, M. J., Iliff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebrospinal+fluid+(CSF)+flow+in+neurodegenerative,+neurovascular+and+neuroinflammatory+disease.">Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).</li><li>Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+role+for+CSF+turnover+and+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+late+onset+Alzheimer's+disease.">A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+iron+metabolism+is+part+of+the+choroid+plexus+response+to+peripheral+inflammation.">Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation.</a> Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).</li><li>Thouvenot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteomic+analysis+of+mouse+choroid+plexus+secretome+reveals+a+high+protein+secretion+capacity+of+choroidal+epithelial+cells.">The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells.</a> Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).</li><li>Vandendriessche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+extracellular+vesicle+secretion+at+the+blood-cerebrospinal+fluid+interface+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143 (2021).</li><li>Bowyer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+description+of+the+dissection+of+the+cerebral+surface+vasculature+and+associated+meninges+and+the+choroid+plexus+from+rat+brain.">A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4285 (2012).</li><li>Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+the+ciliary+movement+of+choroid+plexus+epithelial+cells+ex+vivo.">Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52991 (2015).</li><li>Dani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+and+spatial+map+of+the+choroid+plexus+across+brain+ventricles+and+ages.">A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages.</a> Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).</li><li>Carloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+choroid+plexus+vascular+barrier+closing+during+intestinal+inflammation.">Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation.</a> Science. 374 (6566), 439-448 (2021).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+Niemann-Pick+disease+type.">Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type.</a> C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482 (2021).</li><li>Shipley, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+calcium+dynamics+and+immune+surveillance+at+the+choroid+plexus+blood-cerebrospinal+fluid+interface.">Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface.</a> Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).</li><li>Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+studies+using+serial+block+face+and+focused+ion+beam+scan+electron+microscopy.">Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e59480 (2019).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+(SEM).">Scanning Electron Microscopy (SEM).</a> JoVE Science Education Database. , (2022).</li><li>Pauwels, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus+derived+extracelular+vesicles+exhibit+brain+targeting+characteristics).">Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics).</a> Biomaterials. 290, 121830 (2022).</li></ol>

כאן מתוארת שיטה לבידוד מקלעת הכורואיד (CP) מהחדר הצידי ומהחדר הרביעי במוח עכבר. כל שיטת הרכבה זו של CP מאפשרת ניתוח נוסף באמצעות רפרטואר של טכניקות כדי לקבל תצוגה מלאה של המורפולוגיה של CP, הרכב התא, תעתוק, פרוטאום והפרשה. ניתוחים כאלה חיוניים כדי להשיג הבנה טובה יותר של המבנה המדהים הזה הבולט ?...

מחסומים הדוקים מפרידים בין מערכת העצבים המרכזית (CNS) לבין הפריפריה, כולל מחסום הדם-מוח (BBB) ומחסום הדם-מוח השדרתי (CSF). מחסומים אלה מגנים על מערכת העצבים המרכזית מפני עלבונות חיצוניים ומבטיחים מיקרו-סביבה מאוזנת ומבוקרת 1,2,3. בעוד BBB נחקר בהרחבה לאורך זמן, מחסום הדם-CSF הממוקם במקלעת הכורואיד (CP) רק זכה להתעניינות מחקרית גוברת במהלך העשור האחרון. המחסום האחרון הזה נמצא בארבעת חדרי המוח (איור 1A, B), והוא מאופיין על-ידי שכבה אחת של תאי אפיתל מקלעת כורואיד (CPE) המקיפה סטרומה מרכזית, נימים דולפים, פיברובלסטים ואוכלוסיית תאים לימפואידים ומיאלואידים (איור 1C)4,5,6. תאי ה-CPE מחוברים היטב זה לזה על ידי צמתים הדוקים, ובכך מונעים דליפה מנימי הדם המוגנים הבסיסיים לתוך CSF והמוח. בנוסף, ההובלה על פני תאי CPE מווסתת על ידי מספר מערכות הובלה פנימה והחוצה המנהלות את זרם התרכובות המועילות (למשל, חומרים מזינים והורמונים) מהדם ל- CSF ואת זרם המולקולות המזיקות (למשל, פסולת מטבולית, מוליכים עצביים עודפים) בכיוון השני 1,6. כדי להיות מסוגלים להפעיל את פונקציית ההובלה הפעילה שלהם, תאי CPE מכילים מיטוכונדריה רבים בציטופלסמהשלהם 7. יתר על כן, CP הוא המקור העיקרי של CSF ופועל כשומר הסף של המוח על ידי נוכחות של תאים דלקתיים תושב1. בשל מיקומו הייחודי בין הדם למוח, CP נמצא גם במיקום מושלם לביצוע מעקב חיסוני8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig01.jpg"> איור 1: סקירה סכמטית של המיקום וההרכב של מקלעת הכורואיד (CP). (A,B) רקמת CP נמצאת בשני החדרים הצדיים, השלישי והרביעי של (A) מוח אנושי ו-(B) מוח עכבר. (C) רקמת ה-CP מורכבת משכבה אחת של תאי אפיתל CPE (CPE) קובואידים המחוברים זה לזה באופן הדוק, המקיפים נימים מוגנים, רקמת חיבור רופפת ותאי לימפה ומיאלואידים, ויוצרת את מחסום נוזל הדם-המוח השדרה (מותאם ושונה מהפניה23). איור שנוצר באמצעות Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
במהלך העשור האחרון, ראיות הולכות וגדלות, כולל מספר דוחות מקבוצת המחקר שלנו, גילו כי CP ממלא תפקיד מרכזי בבריאות ובמחלות 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . לדוגמה, ידוע כי מחסום הדם-CSF המזדקן מציג שינויים מורפולוגיים, בין היתר, בגרעינים, מיקרוווילי ובקרום המרתף 1,19. בנוסף, בהקשר של מחלת אלצהיימר, שלמות המחסום הכללית נפגעת וכל השינויים הקשורים לגיל נראים בולטים עוד יותר 1,8,20. בנוסף לשינויים מורפולוגיים, התמלול, הפרוטאום וההפרשה של CP משתנים במהלך מחלה 12,21,22,23. לפיכך, ידע מתקדם של CP הוא חיוני כדי להבין טוב יותר את תפקידו במחלות נוירולוגיות ואולי לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.
שיטה יעילה למיקרודיסקציה מדויקת של CP מחוץ לחדרי המוח היא הצעד הראשון שלא יסולא בפז כדי לאפשר חקירה נכונה של מבנה המוח הזעיר הזה. בשל אופיו הווסקולרי מאוד (איור 2B), ניתן לזהות את ה-CP שצף בתוך חללי החדרים במוח באמצעות מיקרוסקופ דו-עיני. אולם לעתים קרובות נדרש זילוח טרנסקרדיאלי לניתוח במורד הזרם, מה שמסבך את הזיהוי והבידוד הנכונים של רקמת ה-CP (איור 2C). אם שלבי העיבוד הנוספים מאפשרים (למשל, במקרה של ניתוח רנ"א וחלבונים), ניתן לדמיין את ה-CP באמצעות זילוח טרנסקרדיאלי עם ברומופנול כחול (איור 2A). מספר פרסומים כבר מתארים את בידודו של ה-CP ממוחות של עכברוש24 ועכבר25. כאן מתוארת טכניקת בידוד מיקרודיסקציה כדי לבודד את ה-CP מעכברים בוגרים. חשוב לציין שטכניקת בידוד זו משמרת את הכדאיות, התפקוד והמבנה של התאים בתוך ה-CP. הבידוד של ה-CP הצף בחדרים הרביעי והצידי מתואר כאן. בקיצור, העכברים מורדמים סופנית, ואם יש צורך, מחוררים טרנסקרדילית. עם זאת, יש לציין כי זילוח יכול לפגוע במבנה התאים בתוך CP. כתוצאה מכך, אם יש לנתח את הדגימה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), מיקרוסקופ אלקטרונים לסריקת פנים בלוק טורי (SBF-SEM), או קרן יונים ממוקדת SEM (FIB-SEM), אין לבצע זילוח. לאחר מכן, המוח כולו מבודד, ומלקחיים משמשים כדי לחצות את המוח. מכאן, ניתן לזהות ולנתח את ה-CPs הצפים בחדרים הצדיים, בעוד שניתן לבודד את ה-CP מהחדר הרביעי מהצד הקטן של המוח.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig02.jpg"> איור 2: הדמיה של מקלעת כורואיד החדר הצידית (C-C) הרביעית ו-(D-F) הצידית (CP) לאחר (A,D) זילוח כחול ברומופנול, (B,E) ללא זילוח, ו-(C,F) זילוח עם PBS/הפרין. התמונות מצולמות במיקרוסקופ סטריאו (הגדלה של 8x-32x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
ברגע שה-CP מנותח כראוי מחדרי המוח, ניתן ליישם רפרטואר שלם של טכניקות כדי להשיג הבנה נוספת על תפקודו של מבנה זה. לדוגמה, ניתן לבצע ציטומטריית זרימה או ריצוף RNA של תא בודד כדי לכמת ולנתח פנוטיפית את תאי הדלקת החודרים בתנאי מחלה מסוימים26,27. בנוסף להרכב התאי, ניתן לנתח את ההרכב המולקולרי של CP כדי להעריך את נוכחותם של ציטוקינים וכימוקינים באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA), אימונובלוט, או באמצעות ניתוח סימולטני של ציטוקינים מרובים באמצעות מערך חרוזי ציטוקינים28. יתר על כן, ניתן לבצע ניתוחי שעתוק, כלי דם, היסטולוגיה של תאי מערכת החיסון והפרשה על צמחי CP מנותחיםבמיקרו 29. כאן, מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) על כל הר CP משמש כדי לקבל תצוגה כוללת של מבנה CP. SEM משתמש באלומה של אלקטרונים ממוקדים כדי לסרוק על פני השטח וליצור תמונה של הטופוגרפיה וההרכב של המשטח. מכיוון שאורך הגל של אלקטרונים קטן בהרבה מזה של האור, הרזולוציה של SEM היא בתחום הננומטרי ועדיפה על זו של מיקרוסקופ אור. כתוצאה מכך, מחקרים מורפולוגיים ברמה התת-תאית יכולים להתבצע באמצעות SEM. בקצרה, CP מנותח מועבר מיד לתוך קיבוע המכיל גלוטראלדהיד עבור קיבוע לילה, ואחריו osmication ו uranyl אצטט צביעה. הדגימות מטופלות לאחר מכן בכתם אספרטט עופרת, מיובשות ובסופו של דבר מוטמעות להדמיה.
לפיכך, פרוטוקול זה מאפשר בידוד יעיל של CP מחדרי המוח של העכבר, אשר ניתן לנתח עוד יותר באמצעות מגוון רחב של טכניקות במורד הזרם כדי לחקור את המבנה והתפקוד שלה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G x 1/2 needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium specimen mounts</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel surgial blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0210</td>
			<td>size: 0.45 mm x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon adhesive tabs -12 mm</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>77825-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer&#160;</td>
			<td>Bal-Tec&#160;</td>
			<td>CPD030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossbeam 540</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SEM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel</td>
			<td>Metrohm Belgium N.V</td>
			<td>CPA-7800160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide&#160;</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#160;</td>
			<td>Quorum&#160;</td>
			<td>Q150T ES</td>
			<td>PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kela NV</td>
			<td>514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Basket Stainless Steel</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>70190-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi DV4 Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus

מקלעת הכורואיד (CP), מבנה וסקולרי מאוד הבולט לתוך חדרי המוח, היא אחת הרקמות הנחקרות ביותר במדעי המוח. ככל שמתברר יותר ויותר כי מבנה זעיר זה ממלא תפקיד מכריע בבריאות ובמחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), יש חשיבות עליונה לנתח כראוי את ה- CP מתוך חדרי המוח באופן המאפשר עיבוד במורד הזרם, החל מניתוח פונקציונלי ועד ניתוח מבני. כאן מתואר בידוד של CP עכבר המוח הצידי והרביעי ללא צורך בכלים או ציוד מיוחדים. טכניקת בידוד זו משמרת את הכדאיות, התפקוד והמבנה של תאים בתוך CP. בשל כלי הדם הגבוהים שלו, ניתן לדמיין את CP צף בתוך חללי החדרים במוח באמצעות מיקרוסקופ דו-עיני. עם זאת, זילוח קרום הלב הדרוש לניתוח במורד הזרם יכול לסבך את זיהוי רקמת CP. בהתאם לשלבי העיבוד הנוספים (למשל, RNA וניתוח חלבונים), ניתן לפתור זאת על ידי הדמיה של CP באמצעות זילוח קרום הלב עם ברומופנול כחול. לאחר בידוד, CP יכול להיות מעובד באמצעות מספר טכניקות, כולל RNA, חלבון, או ניתוח תא בודד, כדי לקבל הבנה נוספת על הפונקציה של מבנה המוח המיוחד הזה. כאן, מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) על כל הר CP משמש כדי לקבל תצוגה כוללת של המבנה.

הפרוטוקול המתואר מאפשר בידוד יעיל של CP מהמוח הצידי של העכבר (איור 2A-C) ומהחדר הרביעי (איור 2D-F). לאחר בידוד המוח כולו, מלקחיים משמשים כדי לחצות את המוח ולזהות את CPs צפים בחדרים הצדיים. CP מהחדר הרביעי יכול להיות מבודד מן הצד cer...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus at JoVE.com

Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

מקלעת הכורואיד (CP), רקמה שלא נחקרה מספיק במדעי המוח, ממלאת תפקיד מפתח בבריאות ובמחלות של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר טכניקת מיקרודיסקציה לבידוד CP ושימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לקבל מבט כולל על המבנה התאי שלו.

מיקרודיסקציה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק הר שלם הדמיה של מקלעת כורואיד עכבר

The choroid plexus (CP), a highly vascularized structure protruding into the ventricles of the brain, is one of the most understudied tissues in ...

כדי לקבל תובנה טובה יותר בהרכב ובמבנה של מקלעת הכורואידים, שיטה יעילה לבודד את מקלעת הכורואיד מחוץ לחדרי המוח היא צעד ראשון שלא יסולא בפז. בעזרת טכניקת מיקרודיסקציה זו ניתן לנתח את מקלעת הכורואיד מתוך חדרי המוח תוך הכלת תפקודו, כדאיותו ומבנהו מבלי לזהם את מקלעת הכורואיד ברקמה שמסביב. מכשול משמעותי בבידוד מקלעת כורואיד הוא זיהוי המבנה כפי שהוא עדיין צף בחדרי המוח.צביעת מקלעת הכורואיד בכחול ברומופנול מקלה על הבידוד. מי שידגים את ההליך יהיה אליין ואן וונטרגהם, מנהל המעבדה שלנו. התחילו בהכנת חומר הרדמה סופני, תמיסת זילוח טרנסקרדיאלית, ותמיסה הנדרשת לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, או SEM, ופתרונות נוספים כאמור בטקסט.כדי לבודד את מוח העכבר, הניחו את בעל החיים המורדם הסופנית במצב הדקוביטוס הגבי, וקבעו את העכבר על ידי הצמדת הגפיים לצלחת. יש לחטא את החזה על ידי ריסוס 70% אתנול לפני ביצוע חתך של כארבעה סנטימטרים ממש מתחת לסרעפת באמצעות להב כירורגי מפלדת פחמן. לפתוח את העור ולחשוף את החזה באמצעות מספריים כירורגיים.חותכים את הסרעפת פתוחה לחלוטין ומפרידים את בית החזה כדי לחשוף את הריאות ואת הלב הפועם. באמצעות משאבת זילוח לנקב את העכבר עם 10 מיליליטר של פתרון זילוח בקצב של 4.5 מיליליטר לדקה. הכנס מחט של 26 מד לחדר השמאלי כדי לשאוב את התמיסה לתוך המעגל המערכתי.באמצעות מספריים כירורגיים, לחתוך את אטריום הנכון עבור הדם כדי לצאת ממחזור הדם. לאחר עריפת ראשו של העכבר חתכו את הקרקפת על ידי ביצוע חתך המתחיל בין האוזניים לעליון על העיניים. משוך את העור לרוחב כדי לחשוף את הגולגולת.לאחר מכן פתח את הגולגולת על ידי ביצוע התפרים הקשקשים לכיוון חלק האף. לאחר שתסיים, הניחו את המוח בצלחת פטרי קרה כקרח, והוסיפו מיליליטר אחד של PBS קר כקרח לרקמת המוח. כדי לבודד את מקלעת הכורואיד הצף בחדר הרביעי, חתכו בעדינות את המוח הקטן מהמוח באמצעות אזמל.הסר את חלקי רקמת גזע המוח הנותרים מהמוח הקטן. סובבו את המוח כך שקו החיתוך פונה כלפי מעלה, וודאו שחלל החדר הרביעי נראה באמצע הקטע עם מקלעת הכורואיד השוכבת באתר הגב. במידת הצורך, פתח את החדר על ידי משיכת רקמת החיבור במלקחיים חדים.קורעים בעדינות את מקלעת הכורואיד מדופן החדר באמצעות מלקחיים זעירים וחדים. כדי לבודד את מקלעת הכורואיד מהחדר הצידי, חתכו את המוח לשתי המיספרות באמצעות מלקחיים חדים זעירים. סובבו חצי כדור מוח אחד כך שקו החיתוך יהיה כלפי מעלה.כדי לחשוף את החדר הצידי, למשוך בעדינות את קליפת המוח מן התלמוס. משכו את ההיפוקמפוס לקו החיתוך האמצעי. החדר הצידי נראה כעת כאשר מקלעת הכורואיד מונחת בתחתית החדר.במידת הצורך, לפתוח את החדר קצת על ידי משיכת רקמת החיבור עם מלקחיים חדים. השתמשו במלקחיים זעירות וחדות כדי לקרוע בעדינות את מקלעת הכורואיד מדופן החדר. כדי לבצע את הכנת הדגימה עבור SEM להעביר את מקלעת כורואיד מבודד טרי לתוך פתרון קיבוע טרי לדגור במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.לאחר שתסיים, שטוף את הדגימה שלוש פעמים באמצעות שלושה עד חמישה מיליליטר של חיץ נתרן cacodylate מולארי 0.1 במשך חמש דקות כל אחד. לאחר תיקון הדגימות בשלושה עד חמישה מיליליטר של 2%osmium tetroxide ב 0.1 טוחן נתרן cacodylate חיץ במשך 30 דקות. לאחר מכן שטפו את הדגימות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת באמצעות שלושה עד חמישה מיליליטר מים טהורים במיוחד.לאחר מכן, יש לייבש את הדגימות בסדרה הולכת וגדלה של ריכוזי אלכוהול אתילי קר כקרח עם 15 דקות לכל תמיסת אתיל אלכוהול. השתמשו במייבש נקודתי קריטי כדי לייבש את הדגימה כראוי. מקם את הדגימה בזהירות על תושבת דגימה עם מדבקת פחמן ודמיין את דגימות מקלעת הכורואיד באמצעות SEM.הפרוטוקול הנוכחי אפשר בידוד יעיל של מקלעת הכורואיד מהמוח של העכבר מהחדר הצידי והחדר הרביעי. זילוח עם ברומופנול כחול הביא להדמיה של מקלעת הכורואידים. כאשר ברומופנול כחול לא הורשה בשלבי עיבוד נוספים, זילוח עם PBS-הפרין או לא בוצע זילוח לעיבוד.ניתוח מורפולוגי SEM של פני השטח של אפיתל מקלעת כורואידים, או CPE, תאים מראה בבירור את מבנה שתי הזרועות של החדר הרביעי ואת הצורה האופיינית בצורת C של מקלעת כורואיד לרוחב מבודד מהחדר הצידי. הגדלה גבוהה יותר של SEM חשפה מבנים דמויי שלפוחית בצד האפי של תאי CPE ומיקרוווילי, דבר המצביע על כך שניתן לחקור שינויים מורפולוגיים של תאי CPE בתנאי מחלה באמצעות SEM. חשוב רק לגעת ולהוציא את רקמת מקלעת הכורואיד על מנת לא לזהם את הדגימה ברקמה שמסביב.השתמש בזהירות הנדרשת כדי לשמר את המבנה של מקלעת כורואידים. ניתן ליישם מגוון טכניקות במורד הזרם על מקלעת הכורואיד המבודדת כדי לחקור את המבנה והתפקוד שלה, החל מניתוח מיקרוסקופ על ניתוח שעתוק ועד ציטומטריית זרימה. ניתוח מיקרו-כירורגי של מקלעת הכורואיד מחוץ למוח מאפשר לנו לקבל תובנה טובה יותר לגבי המבנה והתפקוד של רקמת המוח הזעירה הזו.ידע זה חיוני כדי להבין טוב יותר את תפקידו במחלות נוירולוגיות.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

תיאור חזותי של Dissection של מערכת כלי הדם המוחית ומשטח קרום המוח הקשורים ודמה עין המקלעת ממוח חולדה

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

הדמיה הר-כל תחזיות החושיות אקסון העובר העכבר

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

תצפית של תנועת ריסי תאי אפיתל דמית העין מקלעת<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

ניתוח של המוח המיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופ סידורי בלוק פן אלקטרונים סורק

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...