Name: microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus
Uploaded: 2022-12-16T14:10:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione belga per la ricerca sull'Alzheimer (SAO; numero di progetto: 20200032), dalla Fondazione di ricerca Fiandre (FWO Vlaanderen; numeri di progetto: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) e dal Fondo Baillet Latour. Ringraziamo il VIB BioImaging Core per la formazione, il supporto e l'accesso al parco strumenti.

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti in questo studio sono stati condotti secondo la legislazione nazionale (legge belga 14/08/1986 e 22/12/2003, regio decreto belga 06/04/2010) ed europea (direttive UE 2010/63/UE, 86/609/CEE). Tutti gli esperimenti su topi e protocolli animali sono stati approvati dal comitato etico dell'Università di Gand (numero di permesso LA1400091 e CE 2017-026).
1. Preparazione
<ol><li>Anestetici: preparare un anestetico terminale. Ad esempi...

<ol>
	<li>Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hidden+epithelial+barrier+in+the+brain+with+a+central+role+in+regulating+brain+homeostasis.+Implications+for+aging.">A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging.</a> Annals of the American Thoracic Society. 13, 407-410 (2016).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).</li><li>Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+central+nervous+system+inflammation.">Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation.</a> Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).</li><li>Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+movers+and+shapers+in+immune+privilege+of+the+CNS.">The movers and shapers in immune privilege of the CNS.</a> Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).</li><li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces:+a+role+for+connexins.">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins.</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li><li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules.">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).</li><li>Redzic, Z. B., Segal, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+choroid+plexus+and+the+physiology+of+the+choroid+plexus+epithelium.">The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).</li><li>Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+anatomy+and+functions+of+the+choroid+plexus+in+healthy+and+diseased+brain.">The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430 (2020).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+leukocyte+infiltration+at+the+choroid+plexus+in+(neuro)inflammatory+disorders.">Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders.</a> Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).</li><li>Brkic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;oligomers+disrupt+blood-CSF+barrier+integrity+by+activating+matrix+metalloproteinases.">Amyloid &#946;oligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases.</a> Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).</li><li>Vandenbroucke, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloprotease+8-dependent+extracellular+matrix+cleavage+at+the+blood-CSF+barrier+contributes+to+lethality+during+systemic+inflammatory+diseases.">Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases.</a> Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+response+to+a+repeated+peripheral+inflammatory+stimulus.">The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus.</a> BMC Neuroscience. 10, 135 (2009).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease:+dialogues+into+and+out+of+the+brain.">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li><li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system.">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li><li>Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balanced+view+of+choroid+plexus+structure+and+function:+Focus+on+adult+humans.">A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans.</a> Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).</li><li>Lehtinen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+and+cerebrospinal+fluid:+emerging+roles+in+development,+disease,+and+therapy.">The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy.</a> Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).</li><li>Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+Alzheimer's+disease:+more+than+just+a+barrier.">The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier.</a> Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+implications+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+neuropsychiatric+disorders.">Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).</li><li>Simon, M. J., Iliff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebrospinal+fluid+(CSF)+flow+in+neurodegenerative,+neurovascular+and+neuroinflammatory+disease.">Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).</li><li>Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+role+for+CSF+turnover+and+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+late+onset+Alzheimer's+disease.">A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+iron+metabolism+is+part+of+the+choroid+plexus+response+to+peripheral+inflammation.">Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation.</a> Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).</li><li>Thouvenot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteomic+analysis+of+mouse+choroid+plexus+secretome+reveals+a+high+protein+secretion+capacity+of+choroidal+epithelial+cells.">The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells.</a> Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).</li><li>Vandendriessche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+extracellular+vesicle+secretion+at+the+blood-cerebrospinal+fluid+interface+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143 (2021).</li><li>Bowyer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+description+of+the+dissection+of+the+cerebral+surface+vasculature+and+associated+meninges+and+the+choroid+plexus+from+rat+brain.">A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4285 (2012).</li><li>Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+the+ciliary+movement+of+choroid+plexus+epithelial+cells+ex+vivo.">Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52991 (2015).</li><li>Dani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+and+spatial+map+of+the+choroid+plexus+across+brain+ventricles+and+ages.">A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages.</a> Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).</li><li>Carloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+choroid+plexus+vascular+barrier+closing+during+intestinal+inflammation.">Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation.</a> Science. 374 (6566), 439-448 (2021).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+Niemann-Pick+disease+type.">Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type.</a> C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482 (2021).</li><li>Shipley, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+calcium+dynamics+and+immune+surveillance+at+the+choroid+plexus+blood-cerebrospinal+fluid+interface.">Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface.</a> Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).</li><li>Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+studies+using+serial+block+face+and+focused+ion+beam+scan+electron+microscopy.">Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e59480 (2019).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+(SEM).">Scanning Electron Microscopy (SEM).</a> JoVE Science Education Database. , (2022).</li><li>Pauwels, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus+derived+extracelular+vesicles+exhibit+brain+targeting+characteristics).">Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics).</a> Biomaterials. 290, 121830 (2022).</li></ol>

Qui viene descritto un metodo per isolare il plesso coroideo (CP) dal ventricolo laterale e dal quarto ventricolo di un cervello di topo. L'intero metodo di montaggio del CP facilita ulteriori analisi utilizzando un repertorio di tecniche per ottenere una visione completa della morfologia CP, della composizione cellulare, del trascrittoma, del proteoma e del secretoma. Tali analisi sono cruciali per ottenere una migliore comprensione di questa straordinaria struttura che sporge dai ventricoli del cervello. Questa conosce...

Barriere strette separano il sistema nervoso centrale (SNC) dalla periferia, compresa la barriera emato-encefalica (BBB) e la barriera sangue-liquido cerebrospinale (CSF). Queste barriere proteggono il SNC dagli insulti esterni e garantiscono un microambiente equilibrato e controllato 1,2,3. Mentre la BBB è stata ampiamente studiata nel tempo, la barriera emato-liquorale situata nel plesso coroideo (CP) ha guadagnato solo un crescente interesse di ricerca nell'ultimo decennio. Quest'ultima barriera può essere trovata nei quattro ventricoli del cervello (Figura 1A, B) ed è caratterizzata da un singolo strato di cellule epiteliali del plesso coroideo (CPE) che circondano uno stroma centrale, capillari permeabili, fibroblasti e una popolazione di cellule linfoidi e mieloidi (Figura 1C)4,5,6. Le cellule CPE sono saldamente interconnesse da giunzioni strette, impedendo così la fuoriuscita dai capillari sanguigni fenestrati sottostanti nel liquido cerebrospinale e nel cervello. Inoltre, il trasporto attraverso le cellule CPE è regolato da una serie di sistemi di trasporto verso l'interno e verso l'esterno che gestiscono l'afflusso di composti benefici (ad esempio, nutrienti e ormoni) dal sangue al liquido cerebrospinale e l'efflusso di molecole nocive (ad esempio, rifiuti metabolici, neurotrasmettitori in eccesso) nella direzione opposta 1,6. Per essere in grado di esercitare la loro funzione di trasporto attivo, le cellule CPE contengono numerosi mitocondri nel loro citoplasma7. Inoltre, il CP è la principale fonte di CSF e agisce come il guardiano del cervello dalla presenza di cellule infiammatorie residenti1. Grazie alla sua posizione unica tra il sangue e il cervello, il CP è anche perfettamente posizionato per effettuare la sorveglianza immunitaria8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica schematica della posizione e della composizione del plesso coroideo (CP). (A,B) Il tessuto CP si trova all'interno dei due ventricoli laterali, terzi e quarti del cervello (A) umano e (B) del topo. (C) Il tessuto CP è costituito da un singolo strato di cellule dell'epitelio CP cuboide (CPE) strettamente connesse che circondano i capillari fenestrati, il tessuto connettivo sciolto e le cellule linfoidi e mieloidi, e forma la barriera emato-liquido cerebrospinale (adattata e modificata dal riferimento23). Figura creata con Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Negli ultimi dieci anni, prove crescenti, tra cui diversi rapporti del nostro gruppo di ricerca, hanno rivelato che il CP svolge un ruolo centrale nella salute e nella malattia 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Ad esempio, è noto che la barriera emato-CSF che invecchia mostra alterazioni morfologiche, tra gli altri, nei nuclei, nei microvilli e nella membrana basale 1,19. Inoltre, nel contesto della malattia di Alzheimer, l'integrità complessiva della barriera è compromessa e tutti questi cambiamenti legati all'età sembrano essere ancora più pronunciati 1,8,20. Oltre ai cambiamenti morfologici, il trascrittoma, il proteoma e il secretoma della CP sono alterati durante la malattia 12,21,22,23. Pertanto, la conoscenza avanzata della CP è essenziale per comprendere meglio il suo ruolo nelle malattie neurologiche e potenzialmente sviluppare nuove strategie terapeutiche.
Un metodo efficiente per una microdissezione accurata del CP dai ventricoli cerebrali è il primo passo inestimabile per consentire una corretta indagine di questa piccola struttura cerebrale. A causa della sua natura altamente vascolarizzata (Figura 2B), il CP fluttuante all'interno delle cavità ventricolari del cervello può essere identificato utilizzando un microscopio binoculare. Tuttavia, la perfusione transcardica è spesso richiesta per l'analisi a valle, complicando la corretta identificazione e isolamento del tessuto CP (Figura 2C). Se le ulteriori fasi di elaborazione lo consentono (ad esempio, nel caso dell'analisi dell'RNA e delle proteine), la CP può essere visualizzata tramite perfusione transcardica con blu di bromofenolo (Figura 2A). Diverse pubblicazioni descrivono già l'isolamento del CP dal cervello del ratto24 e del topo25. Qui, viene descritta una tecnica di isolamento della microdissezione per isolare il CP dai topi adulti. È importante sottolineare che questa tecnica di isolamento preserva la vitalità, la funzione e la struttura delle cellule all'interno del CP. L'isolamento del CP galleggiante nel quarto ventricolo laterale è descritto qui. In breve, i topi sono anestetizzati terminalmente e, se necessario, perfusi transcardialmente. Tuttavia, va notato che la perfusione può danneggiare la struttura delle cellule all'interno del CP. Di conseguenza, se il campione deve essere analizzato utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), la microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBF-SEM) o il fascio ionico focalizzato SEM (FIB-SEM), la perfusione non deve essere eseguita. Successivamente, l'intero cervello è isolato e il forcipe viene utilizzato per emisecare sagittalmente il cervello. Da qui, i CP che galleggiano nei ventricoli laterali possono essere identificati e sezionati, mentre i CP dal quarto ventricolo possono essere isolati dal lato cerebellare del cervello.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig02.jpg"> Figura 2: Visualizzazione del quarto plesso coroideo (A-C) e (D-F) ventricolo laterale (CP) dopo (A,D) perfusione blu di bromofenolo, (B,E) nessuna perfusione e (C,F) perfusione con PBS/eparina. Le immagini sono prese con un microscopio stereo (ingrandimento 8x-32x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Una volta che il CP è correttamente sezionato dai ventricoli cerebrali, un intero repertorio di tecniche può essere applicato per ottenere ulteriori informazioni sulla funzione di questa struttura. Ad esempio, la citometria a flusso o il sequenziamento dell'RNA a singola cellula possono essere eseguiti per quantificare e analizzare fenotipicamente le cellule infiammatorie infiltranti in determinate condizioni di malattia26,27. Oltre alla composizione cellulare, la composizione molecolare del CP può essere analizzata per valutare la presenza di citochine e chemochine tramite saggio immunoassorbente enzimatico (ELISA), immunoblot o attraverso l'analisi simultanea di più citochine utilizzando il citokine bead array28. Inoltre, le analisi del trascrittoma, vascolare, dell'istologia delle cellule immunitarie e del secretoma possono essere eseguite sugli espianti CP microdissecati29. Qui, la microscopia elettronica a scansione (SEM) su CP a montaggio intero viene utilizzata per ottenere una visione d'insieme della struttura CP. SEM utilizza un fascio di elettroni focalizzati per scansionare la superficie e creare un'immagine della topografia e della composizione della superficie. Poiché la lunghezza d'onda degli elettroni è molto più piccola di quella della luce, la risoluzione del SEM è nell'intervallo nanometrico e superiore a quella di un microscopio ottico. Di conseguenza, gli studi morfologici a livello subcellulare possono essere eseguiti tramite SEM. In breve, il CP sezionato viene immediatamente trasferito in un fissativo contenente glutaraldeide per una fissazione notturna, seguita da osmicazione e colorazione dell'acetato di uranile. I campioni vengono quindi trattati con macchie di aspartato di piombo, disidratati e infine incorporati per l'imaging.
Pertanto, questo protocollo facilita l'isolamento efficiente del CP dai ventricoli cerebrali del topo, che può essere ulteriormente analizzato utilizzando una varietà di tecniche a valle per studiarne la struttura e la funzione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G x 1/2 needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium specimen mounts</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel surgial blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0210</td>
			<td>size: 0.45 mm x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon adhesive tabs -12 mm</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>77825-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer&#160;</td>
			<td>Bal-Tec&#160;</td>
			<td>CPD030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossbeam 540</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SEM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel</td>
			<td>Metrohm Belgium N.V</td>
			<td>CPA-7800160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide&#160;</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#160;</td>
			<td>Quorum&#160;</td>
			<td>Q150T ES</td>
			<td>PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kela NV</td>
			<td>514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Basket Stainless Steel</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>70190-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi DV4 Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus

Il plesso coroideo (CP), una struttura altamente vascolarizzata che sporge nei ventricoli del cervello, è uno dei tessuti più poco studiati nelle neuroscienze. Poiché sta diventando sempre più chiaro che questa piccola struttura svolge un ruolo cruciale nella salute e nella malattia del sistema nervoso centrale (SNC), è della massima importanza sezionare correttamente il CP dai ventricoli cerebrali in modo da consentire l'elaborazione a valle, che va dall'analisi funzionale a quella strutturale. Qui viene descritto l'isolamento del CP del topo del ventricolo cerebrale laterale e del quarto senza la necessità di strumenti o attrezzature specializzate. Questa tecnica di isolamento preserva la vitalità, la funzione e la struttura delle cellule all'interno del CP. A causa della sua elevata vascolarizzazione, la CP può essere visualizzata fluttuante all'interno delle cavità ventricolari del cervello utilizzando un microscopio binoculare. Tuttavia, la perfusione transcardica necessaria per l'analisi a valle può complicare l'identificazione del tessuto CP. A seconda delle ulteriori fasi di elaborazione (ad esempio, analisi dell'RNA e delle proteine), questo può essere risolto visualizzando la CP tramite perfusione transcardica con blu di bromofenolo. Dopo l'isolamento, la CP può essere elaborata utilizzando diverse tecniche, tra cui RNA, proteine o analisi di singole cellule, per ottenere ulteriori informazioni sulla funzione di questa speciale struttura cerebrale. Qui, la microscopia elettronica a scansione (SEM) su CP a montaggio intero viene utilizzata per ottenere una visione d'insieme della struttura.

Il protocollo descritto facilita l'isolamento efficiente del CP dal cervello del topo nei ventricoli laterali (Figura 2A-C) e quarti (Figura 2D-F). Dopo aver isolato l'intero cervello, le pinze vengono utilizzate per emisecare sagittalmente il cervello e identificare i CP che galleggiano nei ventricoli laterali. Il CP dal quarto ventricolo può essere isolato dal lato cerebellare del cervello. L...

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Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

Il plesso coroideo (CP), un tessuto poco studiato nelle neuroscienze, svolge un ruolo chiave nella salute e nella malattia del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive una tecnica di microdissezione per isolare il CP e l'uso della microscopia elettronica a scansione per ottenere una visione d'insieme della sua struttura cellulare.

Visualizzazione della microscopia elettronica a scansione di microdissezione e montaggio intero del plesso coroideo del topo

The choroid plexus (CP), a highly vascularized structure protruding into the ventricles of the brain, is one of the most understudied tissues in ...

Per ottenere una migliore comprensione della composizione e della struttura del plesso coroideo, un metodo efficace per isolare il plesso coroideo dai ventricoli cerebrali è un primo passo inestimabile. Con questa tecnica di microdissezione è possibile sezionare il plesso coroideo dai ventricoli cerebrali pur contenendone la funzione, la vitalità e la struttura senza contaminare il plesso coroideo con il tessuto circostante. Un ostacolo significativo nell'isolamento del plesso coroideo è identificare la struttura mentre galleggia ancora nei ventricoli cerebrali.Colorare il plesso coroideo con blu di bromofenolo facilita l'isolamento. A dimostrare la procedura sarà Elien Van Wonterghem, il nostro responsabile di laboratorio. Inizia con la preparazione di un anestetico terminale, una soluzione di perfusione transcardica e una soluzione necessaria per la microscopia elettronica a scansione, o SEM, e altre soluzioni come menzionato nel testo.Per isolare il cervello del topo, posizionare l'animale anestetizzato terminale nella posizione del decubito dorsale e fissare il topo bloccando gli arti su un piatto. Disinfettare il torace spruzzando il 70% di etanolo prima di praticare un'incisione di circa quattro centimetri appena sotto il diaframma utilizzando una lama chirurgica in acciaio al carbonio. Aprire la pelle ed esporre il torace usando le forbici chirurgiche.Tagliare completamente il diaframma e separare il torace per esporre i polmoni e il cuore pulsante. Utilizzando una pompa di perfusione transcardiare il mouse con 10 millilitri della soluzione di perfusione ad una velocità di 4,5 millilitri al minuto. Inserire un ago di calibro 26 nel ventricolo sinistro per pompare la soluzione nel circuito sistemico.Usando le forbici chirurgiche, tagliare l'atrio destro affinché il sangue esca dalla circolazione. Dopo la decapitazione del topo tagliare aprire il cuoio capelluto facendo un'incisione iniziando tra le orecchie verso la superiore agli occhi. Tirare la pelle lateralmente per esporre il cranio.Quindi tagliare il cranio seguendo le suture squamose verso la parte nasale. Una volta fatto, posizionare il cervello in una capsula di Petri ghiacciata e aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato al tessuto cerebrale. Per isolare il plesso coroideo che galleggia nel quarto ventricolo tagliare delicatamente il cervelletto dal cervello usando un bisturi.Rimuovere le restanti parti del tessuto del tronco cerebrale dal cervelletto. Ruotare il cervello in modo che la linea di taglio sia rivolta verso l'alto, assicurandosi che la quarta cavità ventricolare sia visibile nel mezzo della sezione con il plesso coroideo che giace nel sito dorsale. Se necessario, aprire il ventricolo tirando il tessuto connettivo con una pinza affilata.Strappare delicatamente il plesso coroideo dalla parete del ventricolo usando una piccola pinza affilata. Per isolare il plesso coroideo dal ventricolo laterale, tagliare sagittalmente il cervello in due emisferi usando una piccola pinza affilata. Ruota un emisfero cerebrale in modo che la linea di taglio sia verso l'alto.Per rivelare il ventricolo laterale allontanare delicatamente la corteccia dal talamo. Ritrarre l'ippocampo sulla linea di taglio medio-sagittale. Il ventricolo laterale è ora visibile con il plesso coroideo che giace nella parte inferiore del ventricolo.Se necessario, aprire un po 'il ventricolo aprendo il tessuto connettivo con una pinza affilata. Utilizzare piccole pinze affilate per strappare delicatamente il plesso coroideo dalla parete del ventricolo. Per eseguire la preparazione del campione per SEM, trasferire il plesso coroideo appena isolato in una soluzione di fissazione appena fatta e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius.Una volta fatto, lavare il campione tre volte utilizzando da tre a cinque millilitri di tampone di cacodilato di sodio 0,1 molare per cinque minuti ciascuno. Postfissare i campioni in tre-cinque millilitri di tetrossido di osmio al 2% in tampone di cacodilato di sodio da 0,1 molari per 30 minuti. Quindi lavare i campioni tre volte per cinque minuti ciascuno utilizzando da tre a cinque millilitri di acqua ultrapura.Successivamente, disidratare i campioni in una serie crescente di concentrazioni di alcol etilico ghiacciato con 15 minuti per soluzione di alcol etilico. Utilizzare un essiccatore di punti critici per asciugare correttamente il campione. Posizionare il campione con attenzione su un supporto per campioni con un adesivo carbone e visualizzare i campioni del plesso coroideo utilizzando SEM.Il presente protocollo ha facilitato l'isolamento efficiente del plesso coroideo dal cervello del topo lateralmente e dal quarto ventricolo. La perfusione con blu di bromofenolo ha portato alla visualizzazione del plesso coroideo. Quando il blu di bromofenolo non è stato consentito nelle ulteriori fasi di lavorazione, la perfusione con PBS-eparina o nessuna perfusione è stata eseguita per l'elaborazione.L'analisi morfologica SEM della superficie delle cellule epiteliali del plesso coroideo, o CPE, mostra chiaramente la struttura a due bracci del quarto ventricolo e la tipica forma a forma di C del plesso coroideo laterale isolato dal ventricolo laterale. Un maggiore ingrandimento del SEM ha rivelato strutture simili a vescicole sul lato apicale delle cellule CPE e dei microvilli, indicando che le alterazioni morfologiche delle cellule CPE in condizioni di malattia possono essere studiate utilizzando SEM. È importante toccare ed estrarre solo il tessuto del plesso coroideo per non contaminare il campione con il tessuto circostante.Utilizzare la necessaria cautela per preservare la struttura del plesso coroideo. Una varietà di tecniche a valle possono essere applicate sul plesso coroideo isolato per studiarne la struttura e la funzione, passando dall'analisi al microscopio all'analisi del trascrittoma alla citometria a flusso. La microdissezione del plesso coroideo dal cervello ci consente di ottenere una migliore comprensione della struttura e della funzione di questo piccolo tessuto cerebrale.Questa conoscenza è essenziale per comprendere meglio il suo ruolo nelle malattie neurologiche.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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