Name: microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus
Uploaded: 2022-12-16T14:10:00
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この研究は、ベルギーアルツハイマー病研究財団(SAO、プロジェクト番号:20200032)、フランダース研究財団(FWO Vlaanderen、プロジェクト番号:1268823N、11D0520N、1195021N)、およびBaillet Latour基金の支援を受けました。VIBバイオイメージングコアのトレーニング、サポート、インストゥルメントパークへのアクセスに感謝します。

この研究に記載されているすべての動物実験は、国内(ベルギー法14/08/1986および22/12/2003、ベルギー王室令06/04/2010)および欧州法(EU指令2010/63 / EU、86/609 / EEC)に従って実施されました。マウスおよび動物プロトコルに関するすべての実験は、ゲント大学の倫理委員会によって承認されました(許可番号LA1400091およびEC 2017-026)。
1. 事前準備
<ol><li>麻酔薬:終末麻酔?...

<ol>
	<li>Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hidden+epithelial+barrier+in+the+brain+with+a+central+role+in+regulating+brain+homeostasis.+Implications+for+aging.">A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging.</a> Annals of the American Thoracic Society. 13, 407-410 (2016).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).</li><li>Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+central+nervous+system+inflammation.">Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation.</a> Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).</li><li>Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+movers+and+shapers+in+immune+privilege+of+the+CNS.">The movers and shapers in immune privilege of the CNS.</a> Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).</li><li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces:+a+role+for+connexins.">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins.</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li><li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules.">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).</li><li>Redzic, Z. B., Segal, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+choroid+plexus+and+the+physiology+of+the+choroid+plexus+epithelium.">The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).</li><li>Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+anatomy+and+functions+of+the+choroid+plexus+in+healthy+and+diseased+brain.">The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430 (2020).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+leukocyte+infiltration+at+the+choroid+plexus+in+(neuro)inflammatory+disorders.">Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders.</a> Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).</li><li>Brkic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;oligomers+disrupt+blood-CSF+barrier+integrity+by+activating+matrix+metalloproteinases.">Amyloid &#946;oligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases.</a> Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).</li><li>Vandenbroucke, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloprotease+8-dependent+extracellular+matrix+cleavage+at+the+blood-CSF+barrier+contributes+to+lethality+during+systemic+inflammatory+diseases.">Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases.</a> Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+response+to+a+repeated+peripheral+inflammatory+stimulus.">The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus.</a> BMC Neuroscience. 10, 135 (2009).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease:+dialogues+into+and+out+of+the+brain.">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li><li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system.">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li><li>Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balanced+view+of+choroid+plexus+structure+and+function:+Focus+on+adult+humans.">A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans.</a> Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).</li><li>Lehtinen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+and+cerebrospinal+fluid:+emerging+roles+in+development,+disease,+and+therapy.">The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy.</a> Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).</li><li>Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+Alzheimer's+disease:+more+than+just+a+barrier.">The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier.</a> Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+implications+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+neuropsychiatric+disorders.">Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).</li><li>Simon, M. J., Iliff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebrospinal+fluid+(CSF)+flow+in+neurodegenerative,+neurovascular+and+neuroinflammatory+disease.">Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).</li><li>Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+role+for+CSF+turnover+and+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+late+onset+Alzheimer's+disease.">A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+iron+metabolism+is+part+of+the+choroid+plexus+response+to+peripheral+inflammation.">Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation.</a> Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).</li><li>Thouvenot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteomic+analysis+of+mouse+choroid+plexus+secretome+reveals+a+high+protein+secretion+capacity+of+choroidal+epithelial+cells.">The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells.</a> Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).</li><li>Vandendriessche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+extracellular+vesicle+secretion+at+the+blood-cerebrospinal+fluid+interface+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143 (2021).</li><li>Bowyer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+description+of+the+dissection+of+the+cerebral+surface+vasculature+and+associated+meninges+and+the+choroid+plexus+from+rat+brain.">A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4285 (2012).</li><li>Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+the+ciliary+movement+of+choroid+plexus+epithelial+cells+ex+vivo.">Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52991 (2015).</li><li>Dani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+and+spatial+map+of+the+choroid+plexus+across+brain+ventricles+and+ages.">A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages.</a> Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).</li><li>Carloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+choroid+plexus+vascular+barrier+closing+during+intestinal+inflammation.">Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation.</a> Science. 374 (6566), 439-448 (2021).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+Niemann-Pick+disease+type.">Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type.</a> C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482 (2021).</li><li>Shipley, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+calcium+dynamics+and+immune+surveillance+at+the+choroid+plexus+blood-cerebrospinal+fluid+interface.">Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface.</a> Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).</li><li>Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+studies+using+serial+block+face+and+focused+ion+beam+scan+electron+microscopy.">Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e59480 (2019).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+(SEM).">Scanning Electron Microscopy (SEM).</a> JoVE Science Education Database. , (2022).</li><li>Pauwels, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus+derived+extracelular+vesicles+exhibit+brain+targeting+characteristics).">Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics).</a> Biomaterials. 290, 121830 (2022).</li></ol>

ここでは、脈絡叢(CP)をマウス脳の側脳室及び第四脳室から分離する方法について説明する。CPのこの全体のマウント方法は、CPの形態、細胞組成、トランスクリプトーム、プロテオーム、およびセクレトームの完全なビューを取得するための技術のレパートリーを使用したさらなる分析を容易にします。このような分析は、脳室から突き出ているこの驚くべき構造をよりよく理解するために?...

タイトなバリアは、血液脳関門(BBB)や血液脳脊髄液(CSF)バリアなど、中枢神経系(CNS)を末梢から分離します。これらの障壁は、CNSを外部の侮辱から保護し、バランスのとれた制御された微小環境を保証します1,2,3。BBBは時間をかけて広く研究されてきましたが、脈絡叢(CP)にある血液CSFバリアは、過去10年間で研究の関心が高まっています。この後者の障壁は、脳の4つの脳室に見られ(図1A、B)、中心間質、漏出毛細血管、線維芽細胞、およびリンパ系および骨髄系細胞集団を取り巻く脈絡叢上皮(CPE)細胞の単層によって特徴付けられます(図1C)4,5,6 .CPE細胞はタイトジャンクションによってしっかりと相互接続されているため、下にある開窓毛細血管からCSFと脳への漏れを防ぎます。さらに、CPE細胞を横切る輸送は、血液からCSFへの有益な化合物(例えば、栄養素およびホルモン)の流入および有害分子(例えば、代謝廃棄物、過剰な神経伝達物質)の流出を他の方向へ管理する多数の内向きおよび外向き輸送システムによって調節される1,6。CPE細胞は、その能動輸送機能を発揮するために、細胞質内に多数のミトコンドリアを含む7。さらに、CPはCSFの主な供給源であり、常在する炎症細胞の存在によって脳のゲートキーパーとして機能します1。血液と脳の間のその独特の位置のために、CPはまた、免疫監視を実行するのに最適な位置にあります8。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig01.jpg"> 図1:脈絡叢(CP)の位置と組成の概略概要 。 (A,B)CP組織は、(A)ヒトおよび(B)マウス脳の2つの側方脳室、第3脳室、および第4脳室内に見出される。(C)CP組織は、開窓毛細血管、緩い結合組織、リンパ系および骨髄系細胞を取り囲む緊密に接続された直方体CP上皮(CPE)細胞の単層からなり、血液脳脊髄液バリアを形成する(参考文献23から適応および修正)。Biorender.com で作成した図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
過去10年間で、私たちの研究グループからのいくつかの報告を含むますます多くの証拠が、CPが健康と病気の中心的な役割を果たしていることが明らかになりました9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 .例えば、老化した血液-CSFバリアは、とりわけ、核、微絨毛、および基底膜に形態学的変化を示すことが知られている1,19。さらに、アルツハイマー病の状況では、全体的なバリアの完全性が損なわれ、これらの加齢に伴う変化はすべてさらに顕著であるように見えます1、8、20。形態学的変化に加えて、CPのトランスクリプトーム、プロテオーム、およびセクレトームは、疾患12、21、22、23の間に変化します。したがって、CPの高度な知識は、神経疾患におけるCPの役割をよりよく理解し、新しい治療戦略を開発するために不可欠です。
脳室からのCPの正確なマイクロダイセクションのための効率的な方法は、この小さな脳構造の適切な調査を可能にする最初の貴重なステップです。その高度に血管新生した性質(図2B)のために、脳の心室腔内に浮かぶCPは双眼顕微鏡を使用して識別することができます。しかし、下流の分析には経心灌流が必要になることが多く、CP組織の適切な同定と分離が複雑になります(図2C)。さらなる処理ステップが許す場合(例えば、RNAおよびタンパク質分析の場合)、CPはブロモフェノールブルーによる経心灌流 を介して 視覚化することができる(図2A)。いくつかの刊行物は、ラット24 およびマウス仔の脳25からのCPの単離を既に記載している。ここでは、成体マウスからCPを単離するための微小解剖単離技術について説明する。重要なことに、この単離技術は、CP内の細胞の生存率、機能、および構造を維持します。ここでは、第4脳室および側脳室に浮遊するCPの単離について説明する。要するに、マウスは終末麻酔され、必要に応じて経心灌流される。しかしながら、灌流はCP内の細胞の構造を損傷する可能性があることに注意すべきである。したがって、透過型電子顕微鏡(TEM)、シリアルブロック面走査電子顕微鏡(SBF-SEM)、または集束イオンビームSEM(FIB-SEM)を使用してサンプルを分析する場合は、灌流を実行しないでください。次に、脳全体を隔離し、鉗子を使用して脳を矢状に半解します。ここから、側脳室に浮遊するCPを特定して解剖し、第4脳室のCPを脳の小脳側から分離することができます。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig02.jpg"> 図2:(A,D)ブロモフェノールブルー灌流後の(A-C)第4および(D-F)側脳室脈絡叢(CP)の可視化、(B,E)灌流なし、および(C,F)PBS /ヘパリンによる灌流。 画像は実体顕微鏡(8倍〜32倍の倍率)で撮影されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
CPが脳室から適切に解剖されると、この構造の機能についてさらに理解するために、技術のレパートリー全体を適用することができます。例えば、フローサイトメトリーまたはシングルセルRNAシーケンシングは、特定の疾患条件下で浸潤炎症細胞を定量および表現型的に分析するために行うことができる26、27。細胞組成に加えて、CPの分子組成を分析して、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、イムノブロット を介して 、またはサイトカインビーズアレイ28を用いた複数のサイトカインの同時分析を通じて、サイトカインおよびケモカインの存在を評価することができる。さらに、トランスクリプトーム、血管、免疫細胞組織学、およびセクレトーム解析は、微小解剖されたCP外植片29に対して行うことができる。ここでは、CP全体のマウントCP上の走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して、CP構造の全体像を取得します。SEMは、集束された電子のビームを使用して表面をスキャンし、表面の地形と組成の画像を作成します。電子の波長は光よりもはるかに小さいため、SEMの分解能はナノメートル範囲であり、光学顕微鏡よりも優れています。その結果、細胞内レベルでの形態学的研究は SEMを介して 行うことができる。 簡単に言えば、解剖されたCPは、一晩固定するためにグルタルアルデヒド含有固定液に直ちに移され、続いてオスミケーションおよび酢酸ウラニル染色が行われる。次に、サンプルをアスパラギン酸鉛染色で処理し、脱水し、最終的にイメージング用に埋め込みます。
したがって、このプロトコルは、マウス脳室からのCPの効率的な単離を容易にし、その構造および機能を調査するために様々な下流技術を用いてさらに分析することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G x 1/2 needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium specimen mounts</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel surgial blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0210</td>
			<td>size: 0.45 mm x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon adhesive tabs -12 mm</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>77825-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer&#160;</td>
			<td>Bal-Tec&#160;</td>
			<td>CPD030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossbeam 540</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SEM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel</td>
			<td>Metrohm Belgium N.V</td>
			<td>CPA-7800160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide&#160;</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#160;</td>
			<td>Quorum&#160;</td>
			<td>Q150T ES</td>
			<td>PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kela NV</td>
			<td>514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Basket Stainless Steel</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>70190-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi DV4 Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus

脈絡叢(CP)は、脳の心室に突き出た高度に血管新生した構造であり、神経科学で最も研究されていない組織の1つです。この小さな構造が中枢神経系(CNS)の健康と病気に重要な役割を果たしていることがますます明らかになるにつれて、機能解析から構造解析に至るまで、下流の処理を可能にする方法で脳室からCPを適切に解剖することが最も重要です。ここでは、特殊なツールまたは機器を必要としない側脳室および第4脳室マウスCPの単離について説明する。この単離技術は、CP内の細胞の生存率、機能、および構造を維持します。その高い血管新生のために、CPは双眼顕微鏡を使用して脳の心室腔内に浮かんでいるのを視覚化することができる。しかしながら、下流の分析に必要な経心的灌流は、CP組織の同定を複雑にする可能性がある。さらなる処理ステップ(RNAおよびタンパク質分析など)に応じて、これはブロモフェノールブルーとの経心灌流 を介して CPを視覚化することによって解決することができる。単離後、CPは、RNA、タンパク質、または単一細胞分析を含むいくつかの技術を使用して処理され、この特別な脳構造の機能についてさらに理解することができます。ここでは、マウントCP全体の走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して、構造の全体像を把握します。

記載されたプロトコルは、マウス脳外側(図2A−C)および第4脳室(図2D−F)からのCPの効率的な単離を容易にする。脳全体を隔離した後、鉗子を使用して脳を矢状に半解し、側脳室に浮かぶCPを識別します。第4脳室からのCPは、脳の小脳側から単離することができる。ブロモフェノールブルーとの灌流?...

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Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

神経科学で十分に研究されていない組織である脈絡叢(CP)は、中枢神経系の健康と病気に重要な役割を果たしています。このプロトコルは、CPを単離するためのマイクロダイセクション技術と、その細胞構造の全体像を得るための走査型電子顕微鏡の使用について説明しています。

マイクロダイセクションとホールマウント走査型電子顕微鏡によるマウス脈絡叢の可視化

The choroid plexus (CP), a highly vascularized structure protruding into the ventricles of the brain, is one of the most understudied tissues in ...

脈絡叢の構成と構造についてより良い洞察を得るために、脈絡叢を脳室から分離する効率的な方法は、最初の非常に貴重なステップです。このマイクロダイセクション技術により、脈絡叢を周囲の組織で汚染することなく、その機能、生存率、および構造を含みながら、脈絡叢を脳室から解剖することが可能です。脈絡叢の分離における重要なハードルは、脳室に浮かんでいる構造を特定することです。脈絡叢をブロモフェノールブルーで染色すると、単離が容易になります。手順を実演するのは、ラボマネージャーのエリエン・ヴァン・ウォンターゲムです。終末麻酔薬、経心灌流液、走査型電子顕微鏡(SEM)に必要な溶液、および本文に記載されているその他の溶液を準備することから始めます。マウスの脳を隔離するために、終末麻酔された動物を背側褥瘡位置に置き、四肢をプレートに固定してマウスを固定する。70%エタノールをスプレーして胸部を消毒し、炭素鋼製の手術刃を使用して横隔膜のすぐ下を約4センチメートル切開します。皮膚を開き、外科用ハサミを使用して胸部を露出させます。横隔膜を完全に開き、胸部を分離して肺と鼓動する心臓を露出させます。灌流ポンプを使用して、毎分4.5ミリリットルの速度で10ミリリットルの灌流溶液をマウスに経心灌流する。左心室に26ゲージの針を挿入して、溶液を全身回路に送り込みます。外科用ハサミを使用して、血液が循環しないように右心房を切ります。マウスの断頭後、耳の間から目の上に切開を行うことによって頭皮を切り開いた。皮膚を横方向に引っ張って頭蓋骨を露出させます。次に、鼻の部分に向かって扁平上皮縫合糸をたどって頭蓋骨を切り開きます。完了したら、脳を氷のように冷たいペトリ皿に入れ、1ミリリットルの氷冷PBSを脳組織に加えます。第四脳室に浮遊する脈絡叢を分離するために、メスを使用して小脳を大脳から静かに切断します。小脳から残りの脳幹組織部分を取り除きます。切断線が上を向くように脳を回転させ、脈絡叢が背側にあるセクションの中央に第4脳室腔が見えるようにします。必要に応じて、鋭い鉗子で結合組織を引っ張って心室を開きます。小さな鋭い鉗子を使用して、脈絡叢を心室壁からそっと引き裂きます。脈絡叢を側脳室から分離するために、小さな鋭い鉗子を使用して脳を2つの半球に矢状に切断します。切断線が上になるように1つの脳半球を回転させます。側脳室を明らかにするために、視床から皮質をそっと引き離します。海馬を矢状中央切断線まで引っ込めます。側脳室が見えるようになり、脈絡叢が心室の下部にあります。必要に応じて、鋭い鉗子で結合組織を引き開いて心室を少し開きます。小さな鋭い鉗子を使用して、脈絡叢を心室壁からそっと引き裂きます。SEM用のサンプル調製を行うには、新たに単離した脈絡叢を新たに作られた固定溶液に移し、摂氏4度で一晩インキュベートします。完了したら、3〜5ミリリットルの0.1モルカコジル酸ナトリウムバッファーを使用してサンプルをそれぞれ5分間3回洗浄します。サンプルを0.1モルのカコジル酸ナトリウムバッファー中の3〜5ミリリットルの四酸化2%オスミウムに30分間ポストフィックスします。次に、3〜5ミリリットルの超純水を使用して、サンプルをそれぞれ5分間3回洗浄します。次に、エチルアルコール溶液あたり15分間、氷冷エチルアルコール濃度の増加シリーズでサンプルを脱水します。臨界点乾燥機を使用して、サンプルを適切に乾燥させます。カーボンステッカーで標本台紙にサンプルを注意深く配置し、SEMを使用して脈絡叢サンプルを視覚化します。本プロトコルは、マウス脳外側および第4脳室からの脈絡叢の効率的な単離を容易にした。ブロモフェノールブルーとの灌流は脈絡叢の可視化をもたらした。ブロモフェノールブルーがさらなる処理工程で許可されなかった場合には、PBS−ヘパリンによる灌流または灌流なしが処理のために行われた。脈絡叢上皮(CPE)細胞の表面のSEM形態学的分析は、第4脳室の2つの腕構造と、側脳室から分離された側脈絡叢の典型的なC字型形態を明確に示しています。SEM倍率を上げると、CPE細胞と微絨毛の頂端側に小胞様構造が認められ、SEMを用いてCPE細胞の病態変化を調査できることが示唆された。サンプルを周囲の組織と汚染しないように、脈絡叢組織に触れて取り出すだけです。脈絡叢の構造を維持するために必要な注意を払ってください。単離された脈絡叢には、顕微鏡分析からトランスクリプトーム解析、フローサイトメトリーまで、さまざまな下流技術を適用してその構造と機能を調査できます。脈絡叢を脳からマイクロディスケーンすることで、この小さな脳組織の構造と機能についてより良い洞察を得ることができます。この知識は、神経疾患におけるその役割をよりよく理解するために不可欠です。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

ホールマウントの胎児神経系の可視化ショウジョウバエ胚

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

網膜色素上皮の全マウントするためのマウスの眼の解剖

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Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

集束イオンビームは、粉砕し、脳組織の走査型電子顕微鏡

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

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ホールマウントマッスル分析による再現性のあるマウスの坐骨神経クラッシュと再生のその後の評価

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

ラットの脳から脳表面血管系および関連髄膜の解剖と脈絡叢のビジュアル解説

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

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Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

マウスの胚感覚軸索投影のホールマウントイメージング

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

脈絡叢上皮細胞の繊毛運動の観測<em&gt;エクスビボ</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

成体マウス蝸牛のホールマウント解剖および免疫蛍光

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Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

シリアルブロック・フェイス走査型電子顕微鏡を用いて脳ミトコンドリアの解析

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...