Name: microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus
Uploaded: 2022-12-16T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Belgian Foundation of Alzheimer's Research (SAO; prosjektnummer: 20200032), Research Foundation Flanders (FWO Vlaanderen; prosjektnummer: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) og Baillet Latour Fund. Vi takker VIB BioImaging Core for opplæring, support og tilgang til instrumentparken.

Alle dyreforsøk beskrevet i denne studien ble utført i henhold til nasjonal (belgisk lov 14/08/1986 og 22/12/2003, belgisk kongelig dekret 06/04/2010) og europeisk lovgivning (EU-direktiver 2010/63 / EU, 86/609 / EØF). Alle eksperimenter på mus og dyreprotokoller ble godkjent av etikkomiteen ved Ghent University (tillatelsesnummer LA1400091 og EC 2017-026).
1. Forberedelse
<ol><li>Bedøvelse: Forbered en terminal bedøvelse. For eksempel kan en natriumpentobarbital (≥1...

<ol>
	<li>Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hidden+epithelial+barrier+in+the+brain+with+a+central+role+in+regulating+brain+homeostasis.+Implications+for+aging.">A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging.</a> Annals of the American Thoracic Society. 13, 407-410 (2016).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).</li><li>Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+central+nervous+system+inflammation.">Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation.</a> Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).</li><li>Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+movers+and+shapers+in+immune+privilege+of+the+CNS.">The movers and shapers in immune privilege of the CNS.</a> Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).</li><li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces:+a+role+for+connexins.">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins.</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li><li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules.">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).</li><li>Redzic, Z. B., Segal, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+choroid+plexus+and+the+physiology+of+the+choroid+plexus+epithelium.">The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).</li><li>Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+anatomy+and+functions+of+the+choroid+plexus+in+healthy+and+diseased+brain.">The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430 (2020).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+leukocyte+infiltration+at+the+choroid+plexus+in+(neuro)inflammatory+disorders.">Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders.</a> Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).</li><li>Brkic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;oligomers+disrupt+blood-CSF+barrier+integrity+by+activating+matrix+metalloproteinases.">Amyloid &#946;oligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases.</a> Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).</li><li>Vandenbroucke, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloprotease+8-dependent+extracellular+matrix+cleavage+at+the+blood-CSF+barrier+contributes+to+lethality+during+systemic+inflammatory+diseases.">Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases.</a> Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+response+to+a+repeated+peripheral+inflammatory+stimulus.">The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus.</a> BMC Neuroscience. 10, 135 (2009).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease:+dialogues+into+and+out+of+the+brain.">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li><li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system.">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li><li>Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balanced+view+of+choroid+plexus+structure+and+function:+Focus+on+adult+humans.">A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans.</a> Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).</li><li>Lehtinen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+and+cerebrospinal+fluid:+emerging+roles+in+development,+disease,+and+therapy.">The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy.</a> Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).</li><li>Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+Alzheimer's+disease:+more+than+just+a+barrier.">The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier.</a> Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+implications+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+neuropsychiatric+disorders.">Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).</li><li>Simon, M. J., Iliff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebrospinal+fluid+(CSF)+flow+in+neurodegenerative,+neurovascular+and+neuroinflammatory+disease.">Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).</li><li>Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+role+for+CSF+turnover+and+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+late+onset+Alzheimer's+disease.">A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+iron+metabolism+is+part+of+the+choroid+plexus+response+to+peripheral+inflammation.">Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation.</a> Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).</li><li>Thouvenot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteomic+analysis+of+mouse+choroid+plexus+secretome+reveals+a+high+protein+secretion+capacity+of+choroidal+epithelial+cells.">The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells.</a> Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).</li><li>Vandendriessche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+extracellular+vesicle+secretion+at+the+blood-cerebrospinal+fluid+interface+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143 (2021).</li><li>Bowyer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+description+of+the+dissection+of+the+cerebral+surface+vasculature+and+associated+meninges+and+the+choroid+plexus+from+rat+brain.">A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4285 (2012).</li><li>Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+the+ciliary+movement+of+choroid+plexus+epithelial+cells+ex+vivo.">Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52991 (2015).</li><li>Dani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+and+spatial+map+of+the+choroid+plexus+across+brain+ventricles+and+ages.">A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages.</a> Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).</li><li>Carloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+choroid+plexus+vascular+barrier+closing+during+intestinal+inflammation.">Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation.</a> Science. 374 (6566), 439-448 (2021).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+Niemann-Pick+disease+type.">Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type.</a> C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482 (2021).</li><li>Shipley, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+calcium+dynamics+and+immune+surveillance+at+the+choroid+plexus+blood-cerebrospinal+fluid+interface.">Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface.</a> Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).</li><li>Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+studies+using+serial+block+face+and+focused+ion+beam+scan+electron+microscopy.">Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e59480 (2019).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+(SEM).">Scanning Electron Microscopy (SEM).</a> JoVE Science Education Database. , (2022).</li><li>Pauwels, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus+derived+extracelular+vesicles+exhibit+brain+targeting+characteristics).">Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics).</a> Biomaterials. 290, 121830 (2022).</li></ol>

Her beskrives en metode for å isolere choroid plexus (CP) ut av lateral ventrikkel og fjerde ventrikkel i en musehjerne. Hele denne monteringsmetoden til CP muliggjør videre analyse ved hjelp av et repertoar av teknikker for å få en fullstendig oversikt over CP-morfologi, cellulær sammensetning, transkriptom, proteom og sekretom. Slike analyser er avgjørende for å få en bedre forståelse av denne bemerkelsesverdige strukturen som stikker ut fra hjernens ventrikler. Denne kunnskapen er av enorm forskningsinteresse...

Tette barrierer skiller sentralnervesystemet (CNS) fra periferien, inkludert blod-hjernebarrieren (BBB) og blod-cerebrospinalvæsken (CSF) barrieren. Disse barrierene beskytter CNS mot eksterne fornærmelser og sikrer et balansert og kontrollert mikromiljø 1,2,3. Mens BBB har blitt grundig studert over tid, har blod-CSF-barrieren som ligger ved choroid plexus (CP) bare fått økende forskningsinteresse i løpet av det siste tiåret. Denne sistnevnte barrieren finnes i hjernens fire ventrikler (figur 1A, B) og er preget av et enkelt lag av choroid plexus epitelceller (CPE) som omgir en sentral stroma, lekkende kapillærer, fibroblaster og en lymfoid og myeloid cellepopulasjon (figur 1C) 4,5,6. CPE-cellene er godt forbundet med stramme kryss, og forhindrer dermed lekkasje fra de underliggende fenestrerte blodkapillærene inn i CSF og hjernen. I tillegg reguleres transport over CPE-cellene av en rekke transportsystemer innover og utover som styrer tilstrømningen av gunstige forbindelser (f.eks. næringsstoffer og hormoner) fra blodet til CSF og utstrømningen av skadelige molekyler (f.eks. metabolsk avfall, overflødige nevrotransmittere) i den andre retningen 1,6. For å kunne utøve sin aktive transportfunksjon inneholder CPE-cellene mange mitokondrier i deres cytoplasma7. Videre er CP den viktigste kilden til CSF og fungerer som gatekeeper av hjernen ved tilstedeværelse av bosatt inflammatoriske celler1. På grunn av sin unike beliggenhet mellom blodet og hjernen, er CP også perfekt posisjonert for å utføre immunovervåking8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig01.jpg"> Figur 1 Skjematisk oversikt over lokalisasjon og sammensetning av choroid plexus (CP). (A,B) CP-vev finnes i de to laterale, tredje og fjerde ventriklene til (A) menneskelige og (B) musehjerner. (C) CP-vevet består av et enkelt lag av tett koblede kuboidale CP-epitelceller (CPE) som omgir fenestrerte kapillærer, løst bindevev og lymfoide og myeloide celler, og danner blod-cerebrospinalvæskebarrieren (tilpasset og modifisert fra referanse23). Figur opprettet med Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
I løpet av det siste tiåret har økende bevis, inkludert flere rapporter fra vår forskningsgruppe, avslørt at CP spiller en sentral rolle i helse og sykdom 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . For eksempel er det kjent at den aldrende blod-CSF-barrieren viser morfologiske endringer i blant annet kjernene, mikrovilli og kjellermembranen 1,19. I tillegg, i sammenheng med Alzheimers sykdom, er den generelle barriereintegriteten kompromittert, og alle disse aldersrelaterte endringene ser ut til å være enda mer uttalt 1,8,20. I tillegg til morfologiske endringer endres transkriptomet, proteomet og sekretomet til CP under sykdom 12,21,22,23. Dermed er avansert kunnskap om CP avgjørende for å bedre forstå sin rolle i nevrologiske sykdommer og potensielt utvikle nye terapeutiske strategier.
En effektiv metode for nøyaktig mikrodisseksjon av CP ut av hjerneventriklene er det første uvurderlige skrittet for å tillate riktig undersøkelse av denne lille hjernestrukturen. På grunn av sin sterkt vaskulariserte natur (figur 2B) kan CP som flyter inne i hjernens ventrikulære hulrom identifiseres ved hjelp av et kikkertmikroskop. Imidlertid er transkardial perfusjon ofte nødvendig for nedstrømsanalyse, noe som kompliserer riktig identifisering og isolering av CP-vevet (figur 2C). Hvis de videre behandlingstrinnene tillater det (f.eks. ved RNA- og proteinanalyse), kan CP visualiseres via transkardial perfusjon med bromfenolblått (figur 2A). Flere publikasjoner beskriver allerede isoleringen av CP fra rotte24 og musevalpehjerner25. Her beskrives en mikrodisseksjonsisolasjonsteknikk for å isolere CP fra voksne mus. Det er viktig at denne isolasjonsteknikken bevarer levedyktigheten, funksjonen og strukturen til cellene i CP. Isoleringen av CP flytende i fjerde og laterale ventrikler er beskrevet her. Kort sagt, musene er terminalt bedøvet og om nødvendig transkardialt perfusert. Det skal imidlertid bemerkes at perfusjon kan skade strukturen til cellene i CP. Følgelig, hvis prøven skal analyseres ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM), seriell blokk ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM), eller fokusert ionstråle SEM (FIB-SEM), bør perfusjon ikke utføres. Deretter isoleres hele hjernen, og tang brukes til å sagittalt hemisect hjernen. Herfra kan CP-ene som flyter i laterale ventrikler identifiseres og dissekeres, mens CP fra fjerde ventrikkel kan isoleres fra hjernesiden.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig02.jpg"> Figur 2 Visualisering av (A-C) fjerde og (D-F) laterale ventrikkel choroid plexus (CP) etter (A,D) bromfenolblå perfusjon, (B,E) ingen perfusjon og (C,F) perfusjon med PBS/heparin. Bildene er tatt med stereomikroskop (8x-32x forstørrelse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Når CP er riktig dissekert ut av hjerneventriklene, kan et helt repertoar av teknikker brukes for å få ytterligere forståelse av funksjonen til denne strukturen. For eksempel kan flowcytometri eller enkeltcelle RNA-sekvensering utføres for å kvantifisere og fenotypisk analysere de infiltrerende inflammatoriske cellene under visse sykdomstilstander26,27. I tillegg til den cellulære sammensetningen kan den molekylære sammensetningen av CP analyseres for å vurdere tilstedeværelsen av cytokiner og kjemokiner via enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA), immunoblot, eller gjennom samtidig analyse av flere cytokiner ved bruk av cytokinperlematrisen28. Videre kan transkriptom-, vaskulær-, immuncellehistologi- og sekretomanalyser utføres på de mikrodissekerte CP-eksplantene29. Her brukes skanning elektronmikroskopi (SEM) på hele mount CP for å få en samlet oversikt over CP-strukturen. SEM bruker en stråle av fokuserte elektroner til å skanne over overflaten og skape et bilde av overflatens topografi og sammensetning. Siden bølgelengden til elektroner er mye mindre enn lyset, er oppløsningen av SEM i nanometerområdet og overlegen til et lysmikroskop. Følgelig kan morfologiske studier på subcellulært nivå utføres via SEM. Kort fortalt overføres den dissekerte CP umiddelbart til et glutaraldehydholdig fikseringsmiddel for en fiksering over natten, etterfulgt av osmikyring og uranylacetatfarging. Prøvene blir deretter behandlet med bly aspartat flekk, dehydrert, og til slutt innebygd for avbildning.
Dermed letter denne protokollen effektiv isolering av CP fra musens hjerneventrikler, som kan analyseres videre ved hjelp av en rekke nedstrøms teknikker for å undersøke dens struktur og funksjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G x 1/2 needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium specimen mounts</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel surgial blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0210</td>
			<td>size: 0.45 mm x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon adhesive tabs -12 mm</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>77825-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer&#160;</td>
			<td>Bal-Tec&#160;</td>
			<td>CPD030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossbeam 540</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SEM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel</td>
			<td>Metrohm Belgium N.V</td>
			<td>CPA-7800160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide&#160;</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#160;</td>
			<td>Quorum&#160;</td>
			<td>Q150T ES</td>
			<td>PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kela NV</td>
			<td>514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Basket Stainless Steel</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>70190-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi DV4 Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus

Choroid plexus (CP), en svært vaskularisert struktur som stikker ut i hjernens ventrikler, er et av de mest understuderte vevene i nevrovitenskap. Ettersom det blir stadig tydeligere at denne lille strukturen spiller en avgjørende rolle i helse og sykdom i sentralnervesystemet (CNS), er det av største betydning å dissekere CP riktig ut av hjerneventriklene på en måte som tillater nedstrøms behandling, alt fra funksjonell til strukturell analyse. Her beskrives isolering av lateral og fjerde hjerneventrikkelmus CP uten behov for spesialiserte verktøy eller utstyr. Denne isolasjonsteknikken bevarer levedyktigheten, funksjonen og strukturen til celler i CP. På grunn av sin høye vaskularisering kan CP visualiseres flytende inne i hjernens ventrikulære hulrom ved hjelp av et kikkertmikroskop. Imidlertid kan transkardial perfusjon som kreves for nedstrøms analyse komplisere identifiseringen av CP-vevet. Avhengig av de videre behandlingstrinnene (f.eks. RNA og proteinanalyse), kan dette løses ved å visualisere CP via transkardial perfusjon med bromfenolblått. Etter isolasjon kan CP behandles ved hjelp av flere teknikker, inkludert RNA, protein eller enkeltcelleanalyse, for å få ytterligere forståelse av funksjonen til denne spesielle hjernestrukturen. Her brukes skanning elektronmikroskopi (SEM) på hele mount CP for å få en samlet oversikt over strukturen.

Den beskrevne protokollen letter effektiv isolering av CP fra musehjernens laterale (figur 2A-C) og fjerde (figur 2D-F) ventrikler. Etter å ha isolert hele hjernen, brukes tang til å sagittalt hemisect hjernen og identifisere CPene som flyter i laterale ventrikler. CP fra fjerde ventrikkel kan isoleres fra lillehjernen side. Perfusjon med bromfenolblått kan brukes til å visualisere CP (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus at JoVE.com

Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

Choroid plexus (CP), et understudert vev i nevrovitenskap, spiller en nøkkelrolle i helse og sykdom i sentralnervesystemet. Denne protokollen beskriver en mikrodisseksjonsteknikk for å isolere CP og bruk av skanningelektronmikroskopi for å få en samlet oversikt over dens cellulære struktur.

Mikrodisseksjon og helmontert skanning elektronmikroskopi visualisering av mus choroid plexus

The choroid plexus (CP), a highly vascularized structure protruding into the ventricles of the brain, is one of the most understudied tissues in ...

For å få et bedre innblikk i sammensetningen og strukturen av choroid plexus, er en effektiv metode for å isolere choroid plexus ut av hjerneventriklene et første uvurderlig skritt. Med denne mikrodisseksjonsteknikken er det mulig å dissekere choroid plexus ut av hjerneventriklene mens den inneholder dens funksjon, levedyktighet og struktur uten å forurense choroid plexus med omgivende vev. En betydelig hindring i choroid plexus isolasjon er å identifisere strukturen som den fortsatt flyter i hjerneventriklene.Farging av choroid plexus med bromfenolblå letter isolasjonen. Demonstrere prosedyren vil være Elien Van Wonterghem, vår lab manager. Begynn med å forberede en terminal bedøvelse, transkardial perfusjonsløsning, og en løsning som kreves for skanning elektronmikroskopi, eller SEM, og andre løsninger som nevnt i teksten.For å isolere musehjernen, plasser det terminalt bedøvede dyret i dorsal decubitus-posisjonen, og fest musen ved å feste lemmer på en tallerken. Desinfiser brystet ved å spraye 70% etanol før du gjør et snitt på omtrent fire centimeter like under membranen ved hjelp av et kirurgisk blad av karbonstål. Åpne huden og utsett brystet ved hjelp av kirurgisk saks.Klipp membranen helt åpen og skille brystkassen for å avsløre lungene og det bankende hjertet. Ved hjelp av en perfusjonspumpe perfeksjonerer musen transkardialt med 10 ml perfusjonsoppløsningen med en hastighet på 4, 5 milliliter per minutt. Sett inn en 26-gauge nål i venstre ventrikkel for å pumpe løsningen inn i den systemiske kretsen.Bruk kirurgisk saks, kutt høyre atrium for at blodet skal komme ut av sirkulasjonen. Etter halshugging av musen, kutt opp hodebunnen ved å lage et snitt som starter mellom ørene til overlegen øynene. Trekk huden sideveis for å avsløre skallen.Skjær deretter opp skallen ved å følge squamosalsuturene mot nesepartiet. Når du er ferdig, legg hjernen i en iskald petriskål, og tilsett en milliliter iskald PBS til hjernevevet. For å isolere choroid plexus som flyter i fjerde ventrikkel, kutt forsiktig av cerebellum fra storhjernen ved hjelp av en skalpell.Fjern de resterende hjernestammevevsdelene fra lillehjernen. Roter hjernen slik at skjærelinjen vender oppover, slik at det fjerde ventrikkelhulrommet er synlig i midten av seksjonen med choroid plexus som ligger på dorsalstedet. Åpne om nødvendig ventrikkelen ved å trekke bindevevet med skarpe tang.Riv forsiktig choroid plexus ut av ventrikkelveggen med små skarpe tang. For å isolere choroid plexus fra lateral ventrikkel, kutt sagittalt hjernen i to halvkule ved hjelp av små skarpe tang. Roter en hjernehalvdel slik at skjærelinjen er oppover.For å avsløre lateral ventrikkel, trekk forsiktig cortex fra thalamus. Trekk hippocampus tilbake til den midterste sagittale skjærelinjen. Lateral ventrikkel er nå synlig med choroid plexus liggende i bunnen av ventrikkelen.Om nødvendig, åpne ventrikkelen litt ved å trekke opp bindevevet med skarpe tang. Bruk små skarpe tang for å forsiktig rive choroid plexus ut av ventrikkelveggen. For å utføre prøvepreparatet for SEM, overfør den nylig isolerte choroid plexus til nylaget fikseringsløsning og inkuber over natten ved fire grader Celsius.Når du er ferdig, vask prøven tre ganger med tre til fem milliliter 0,1 molar natriumkakodylatbuffer i fem minutter hver. Postfix prøvene i tre til fem milliliter 2% osmiumtetroxid i 0,1 molar natriumkakodylatbuffer i 30 minutter. Vask deretter prøvene tre ganger i fem minutter, hver med tre til fem milliliter ultrarent vann.Deretter dehydrerer du prøvene i en økende serie iskalde etylalkoholkonsentrasjoner med 15 minutter per etylalkoholoppløsning. Bruk en tørketrommel for kritisk punkt for å tørke prøven ordentlig. Plasser prøven nøye på en prøvemontering med et karbonklistremerke og visualiser choroid plexus-prøvene ved hjelp av SEM.Den nåværende protokollen muliggjorde effektiv isolering av choroid plexus fra mus, hjerne, laterale og fjerde ventrikler. Perfusjon med bromfenolblått resulterte i visualisering av choroid plexus. Når bromfenolblått ikke var tillatt i de videre behandlingstrinnene, ble det utført perfusjon med PBS-heparin eller ingen perfusjon for behandling.SEM morfologisk analyse av overflaten av choroid plexus epitel, eller CPE, celler viser tydelig de to armstrukturen i fjerde ventrikkel og den typiske C-formede form av lateral choroid plexus isolert fra lateral ventrikkel. En høyere SEM-forstørrelse viste vesikkellignende strukturer på den apikale siden av CPE-celler og mikrovilli, noe som indikerer at morfologiske endringer av CPE-cellene ved sykdomstilstander kan undersøkes ved hjelp av SEM. Det er viktig å bare berøre og ta ut choroid plexusvevet for ikke å forurense prøven med omgivende vev.Vær nødvendig forsiktighet for å bevare strukturen i choroid plexus. En rekke nedstrøms teknikker kan brukes på den isolerte choroid plexus for å undersøke dens struktur og funksjon, fra mikroskopanalyse over transkriptomanalyse til flowcytometri. Ved å mikrodissekere choroid plexus ut av hjernen kan vi få et bedre innblikk i strukturen og funksjonen til dette lille hjernevevet.Denne kunnskapen er viktig for å bedre forstå sin rolle i nevrologiske sykdommer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Reproduserbar Mouse hoftenervene Crush og påfølgende vurdering av Regeneration av Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

A Visual Beskrivelse av Dissection av Cerebral Surface blodkar og Associated hjernehinnene og årehinnen plexus fra Rat Brain

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Hele Mount Immunofluorescent Farging av Neonatal Mouse Retina å etterforske Angiogenesis<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Hel-mount Imaging av Mouse Embryo Sensory Axon Anslag

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Observasjon av Ciliary Bevegelse av Choroid Plexus Epitelceller<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Hele Mount Dissection og Immunfluorescens av Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Analyse av Brain Mitokondrier Bruke Serial Block-Face Scanning elektronmikroskopi

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...