Name: microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus
Uploaded: 2022-12-16T14:10:00
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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Belga de Investigação da Alzheimer (SAO; número do projecto: 20200032), pela Fundação de Investigação da Flandres (FWO Vlaanderen; números do projecto: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) e pelo Fundo Baillet Latour. Agradecemos ao VIB BioImaging Core pelo treinamento, suporte e acesso ao parque de instrumentos.

Todos os experimentos com animais descritos neste estudo foram conduzidos de acordo com a legislação nacional (Lei belga 14/08/1986 e 22/12/2003, Decreto Real Belga 06/04/2010) e europeia (Diretivas UE 2010/63/UE, 86/609/CEE). Todos os experimentos em camundongos e protocolos em animais foram aprovados pelo comitê de ética da Universidade de Ghent (números de licença LA1400091 e EC 2017-026).
1. Preparo
<ol><li>Anestésicos: Preparar um anestésico terminal. Por exempl...

<ol>
	<li>Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hidden+epithelial+barrier+in+the+brain+with+a+central+role+in+regulating+brain+homeostasis.+Implications+for+aging.">A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging.</a> Annals of the American Thoracic Society. 13, 407-410 (2016).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).</li><li>Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+central+nervous+system+inflammation.">Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation.</a> Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).</li><li>Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+movers+and+shapers+in+immune+privilege+of+the+CNS.">The movers and shapers in immune privilege of the CNS.</a> Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).</li><li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces:+a+role+for+connexins.">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins.</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li><li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules.">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).</li><li>Redzic, Z. B., Segal, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+choroid+plexus+and+the+physiology+of+the+choroid+plexus+epithelium.">The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).</li><li>Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+anatomy+and+functions+of+the+choroid+plexus+in+healthy+and+diseased+brain.">The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430 (2020).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+leukocyte+infiltration+at+the+choroid+plexus+in+(neuro)inflammatory+disorders.">Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders.</a> Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).</li><li>Brkic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;oligomers+disrupt+blood-CSF+barrier+integrity+by+activating+matrix+metalloproteinases.">Amyloid &#946;oligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases.</a> Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).</li><li>Vandenbroucke, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloprotease+8-dependent+extracellular+matrix+cleavage+at+the+blood-CSF+barrier+contributes+to+lethality+during+systemic+inflammatory+diseases.">Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases.</a> Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+response+to+a+repeated+peripheral+inflammatory+stimulus.">The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus.</a> BMC Neuroscience. 10, 135 (2009).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease:+dialogues+into+and+out+of+the+brain.">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li><li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system.">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li><li>Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balanced+view+of+choroid+plexus+structure+and+function:+Focus+on+adult+humans.">A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans.</a> Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).</li><li>Lehtinen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+and+cerebrospinal+fluid:+emerging+roles+in+development,+disease,+and+therapy.">The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy.</a> Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).</li><li>Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+Alzheimer's+disease:+more+than+just+a+barrier.">The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier.</a> Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+implications+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+neuropsychiatric+disorders.">Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).</li><li>Simon, M. J., Iliff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebrospinal+fluid+(CSF)+flow+in+neurodegenerative,+neurovascular+and+neuroinflammatory+disease.">Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).</li><li>Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+role+for+CSF+turnover+and+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+late+onset+Alzheimer's+disease.">A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+iron+metabolism+is+part+of+the+choroid+plexus+response+to+peripheral+inflammation.">Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation.</a> Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).</li><li>Thouvenot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteomic+analysis+of+mouse+choroid+plexus+secretome+reveals+a+high+protein+secretion+capacity+of+choroidal+epithelial+cells.">The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells.</a> Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).</li><li>Vandendriessche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+extracellular+vesicle+secretion+at+the+blood-cerebrospinal+fluid+interface+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143 (2021).</li><li>Bowyer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+description+of+the+dissection+of+the+cerebral+surface+vasculature+and+associated+meninges+and+the+choroid+plexus+from+rat+brain.">A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4285 (2012).</li><li>Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+the+ciliary+movement+of+choroid+plexus+epithelial+cells+ex+vivo.">Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52991 (2015).</li><li>Dani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+and+spatial+map+of+the+choroid+plexus+across+brain+ventricles+and+ages.">A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages.</a> Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).</li><li>Carloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+choroid+plexus+vascular+barrier+closing+during+intestinal+inflammation.">Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation.</a> Science. 374 (6566), 439-448 (2021).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+Niemann-Pick+disease+type.">Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type.</a> C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482 (2021).</li><li>Shipley, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+calcium+dynamics+and+immune+surveillance+at+the+choroid+plexus+blood-cerebrospinal+fluid+interface.">Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface.</a> Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).</li><li>Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+studies+using+serial+block+face+and+focused+ion+beam+scan+electron+microscopy.">Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e59480 (2019).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+(SEM).">Scanning Electron Microscopy (SEM).</a> JoVE Science Education Database. , (2022).</li><li>Pauwels, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus+derived+extracelular+vesicles+exhibit+brain+targeting+characteristics).">Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics).</a> Biomaterials. 290, 121830 (2022).</li></ol>

Aqui é descrito um método para isolar o plexo coroide (PC) do ventrículo lateral e do quarto ventrículo de um cérebro de camundongo. Todo esse método de montagem do CP facilita análises posteriores utilizando um repertório de técnicas para obter uma visão completa da morfologia, composição celular, transcriptoma, proteoma e secretoma do CP. Tais análises são cruciais para obter uma melhor compreensão dessa notável estrutura que se projeta dos ventrículos do cérebro. Esse conhecimento é de imenso intere...

Barreiras apertadas separam o sistema nervoso central (SNC) da periferia, incluindo a barreira hematoencefálica (BHE) e a barreira sangue-líquido cefalorraquidiano (LCR). Essas barreiras protegem o SNC contra insultos externos e garantem um microambiente equilibrado e controlado 1,2,3. Embora a BHE tenha sido extensivamente estudada ao longo do tempo, a barreira sangue-LCR localizada no plexo coroide (CP) só ganhou crescente interesse de pesquisa durante a última década. Esta última barreira pode ser encontrada nos quatro ventrículos cerebrais (Figura 1A, B) e é caracterizada por uma única camada de células epiteliais do plexo coroide (ECP) ao redor de um estroma central, capilares vazados, fibroblastos e uma população de células linfoides e mieloides (Figura 1C)4,5,6. As células CPE estão firmemente interconectadas por tight junctions, evitando assim o vazamento dos capilares sanguíneos fenestrados subjacentes para o LCR e o cérebro. Além disso, o transporte através das células CPE é regulado por uma série de sistemas de transporte para dentro e para fora que gerenciam o influxo de compostos benéficos (por exemplo, nutrientes e hormônios) do sangue para o LCR e o efluxo de moléculas nocivas (por exemplo, resíduos metabólicos, excesso de neurotransmissores) na outra direção 1,6. Para poderem exercer sua função de transporte ativo, as células CPE contêm numerosas mitocôndrias em seu citoplasma7. Além disso, o PC é a principal fonte de LCR e atua como gatekeeper do cérebro pela presença de células inflamatóriasresidentes1. Devido à sua localização única entre o sangue e o cérebro, o PC também está perfeitamente posicionado para realizar vigilância imunológica8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral esquemática da localização e composição do plexo coroide (PC). (A,B) O tecido CP é encontrado nos dois ventrículos laterais, o terceiro e o quarto ventrículos de (A) cérebro humano e (B) de camundongo. (C) O tecido do PC consiste de uma única camada de células do epitélio cuboidal do CP (EPC) firmemente conectadas ao redor de capilares fenestrados, tecido conjuntivo frouxo e células linfoides e mieloides, e forma a barreira hemato-liquórica (adaptada e modificada da referência23). Figura criada com Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Na última década, evidências crescentes, incluindo vários relatos de nosso grupo de pesquisa, têm revelado que a PC desempenha um papel central na saúde ena doença9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Por exemplo, sabe-se que a barreira sangue-LCR do envelhecimento apresenta alterações morfológicas, entre outras, nos núcleos, microvilosidades e membrana basal 1,19. Além disso, no contexto da doença de Alzheimer, a integridade global da barreira está comprometida e todas essas mudanças relacionadas à idade parecem ser ainda mais pronunciadas 1,8,20. Além das alterações morfológicas, o transcriptoma, proteoma e secretoma da PC são alterados durante a doença 12,21,22,23. Assim, o conhecimento avançado da PC é essencial para melhor compreender seu papel nas doenças neurológicas e potencialmente desenvolver novas estratégias terapêuticas.
Um método eficiente para a microdissecção precisa do PC para fora dos ventrículos cerebrais é o primeiro passo inestimável para permitir a investigação adequada desta minúscula estrutura cerebral. Devido à sua natureza altamente vascularizada (Figura 2B), o CP flutuando dentro das cavidades ventriculares do encéfalo pode ser identificado por meio de um microscópio binocular. No entanto, a perfusão transcárdica é frequentemente necessária para análise a jusante, dificultando a identificação e o isolamento adequados do tecido do PC (Figura 2C). Se as etapas adicionais de processamento permitirem (por exemplo, no caso de análise de RNA e proteínas), o CP pode ser visualizado via perfusão transcárdica com azul de bromofenol (Figura 2A). Várias publicações já descrevem o isolamento do PC do cérebro de ratos24 e filhotes de camundongos25. Aqui, uma técnica de isolamento por microdissecção é descrita para isolar o PC de camundongos adultos. É importante ressaltar que essa técnica de isolamento preserva a viabilidade, a função e a estrutura das células dentro do PC. O isolamento do CP flutuando no quarto e nos ventrículos laterais é descrito aqui. Em suma, os camundongos são anestesiados terminalmente e, se necessário, perfundidos transcardialmente. No entanto, deve-se notar que a perfusão pode danificar a estrutura das células dentro do PC. Consequentemente, se a amostra for analisada usando microscopia eletrônica de transmissão (MET), microscopia eletrônica de varredura de face serial block (SBF-SEM) ou MEV por feixe de íons focalizado (MEV-FIB), a perfusão não deve ser realizada. Em seguida, todo o cérebro é isolado, e fórceps são usados para hemissectar sagitalmente o cérebro. A partir daí, os CPs que flutuam nos ventrículos laterais podem ser identificados e dissecados, enquanto os CP do quarto ventrículo podem ser isolados do lado cerebelar do cérebro.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig02.jpg"> Figura 2: Visualização do plexo coroide (CP) do quarto e (D-F) ventrículo lateral (CP) após (A,D) perfusão com azul de bromofenol, (B,E) sem perfusão e (C,F) perfusão com PBS/heparina. As imagens são obtidas com estereomicroscópio (aumento de 8x-32x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Uma vez que o PC é adequadamente dissecado para fora dos ventrículos cerebrais, todo um repertório de técnicas pode ser aplicado para obter maior compreensão sobre a função dessa estrutura. Por exemplo, citometria de fluxo ou sequenciamento de RNA de célula única podem ser realizados para quantificar e analisar fenotipicamente as células inflamatórias infiltrantes sob determinadas condições de doença26,27. Além da composição celular, a composição molecular do CP pode ser analisada para avaliar a presença de citocinas e quimiocinas via ensaio imunoenzimático (ELISA), immunoblot, ou através da análise simultânea de múltiplas citocinas utilizando o arranjo de esferas de citocinas28. Além disso, análises de transcriptoma, vascular, histologia de células imunes e secretoma podem ser realizadas nos explantes de CPmicrodissecados29. Aqui, a microscopia eletrônica de varredura (MEV) em CP de montagem inteira é usada para obter uma visão geral da estrutura do CP. O MEV usa um feixe de elétrons focalizados para varrer a superfície e criar uma imagem da topografia e composição da superfície. Como o comprimento de onda dos elétrons é muito menor do que o da luz, a resolução do MEV está na faixa nanométrica e é superior à de um microscópio de luz. Consequentemente, estudos morfológicos em nível subcelular podem ser realizados via MEV. Resumidamente, o CP dissecado é imediatamente transferido para um fixador contendo glutaraldeído para uma fixação noturna, seguida de osmicação e coloração com acetato de uranila. As amostras são então tratadas com coloração de aspartato de chumbo, desidratadas e, finalmente, incluídas para aquisição de imagens.
Assim, este protocolo facilita o isolamento eficiente do PC dos ventrículos cerebrais de camundongos, o que pode ser posteriormente analisado usando uma variedade de técnicas a jusante para investigar sua estrutura e função.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G x 1/2 needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium specimen mounts</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel surgial blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0210</td>
			<td>size: 0.45 mm x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon adhesive tabs -12 mm</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>77825-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer&#160;</td>
			<td>Bal-Tec&#160;</td>
			<td>CPD030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossbeam 540</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SEM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel</td>
			<td>Metrohm Belgium N.V</td>
			<td>CPA-7800160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide&#160;</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#160;</td>
			<td>Quorum&#160;</td>
			<td>Q150T ES</td>
			<td>PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kela NV</td>
			<td>514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Basket Stainless Steel</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>70190-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi DV4 Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus

O plexo coroide (PC), uma estrutura altamente vascularizada que se projeta para os ventrículos do cérebro, é um dos tecidos mais pouco estudados na neurociência. Como está ficando cada vez mais claro que essa minúscula estrutura desempenha um papel crucial na saúde e na doença do sistema nervoso central (SNC), é de extrema importância dissecar adequadamente o PC para fora dos ventrículos cerebrais de uma forma que permita o processamento a jusante, desde a análise funcional até a estrutural. Aqui é descrito o isolamento da PC lateral e do quarto ventrículo cerebral de camundongos sem a necessidade de ferramentas ou equipamentos especializados. Essa técnica de isolamento preserva a viabilidade, a função e a estrutura das células dentro do PC. Devido à sua alta vascularização, o PC pode ser visualizado flutuando dentro das cavidades ventriculares do cérebro usando um microscópio binocular. Entretanto, a perfusão transcárdica necessária para análise a jusante pode dificultar a identificação do tecido do PC. Dependendo das etapas de processamento adicionais (por exemplo, análise de RNA e proteínas), isso pode ser resolvido visualizando o CP via perfusão transcárdica com azul de bromofenol. Após o isolamento, o PC pode ser processado usando várias técnicas, incluindo análise de RNA, proteína ou célula única, para obter maior compreensão sobre a função dessa estrutura cerebral especial. Aqui, a microscopia eletrônica de varredura (MEV) em todo o CP de montagem é usada para obter uma visão geral da estrutura.

O protocolo descrito facilita o isolamento eficiente do CP dos ventrículos lateral (Figura 2A-C) e quarto (Figura 2D-F) do cérebro de camundongos. Após o isolamento de todo o cérebro, fórceps são usados para hemisseccionalmente o cérebro e identificar os CPs flutuando nos ventrículos laterais. A PC do quarto ventrículo pode ser isolada do lado cerebelar do cérebro. A perfusão com azul...

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Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

O plexo coroide (PC), um tecido pouco estudado em neurociência, desempenha um papel fundamental na saúde e doença do sistema nervoso central. Este protocolo descreve uma técnica de microdissecção para isolamento do CP e o uso de microscopia eletrônica de varredura para obter uma visão global de sua estrutura celular.

Microdissecção e Visualização por Microscopia Eletrônica de Varredura de Montagem Completa do Plexo Coroide de Camundongos

The choroid plexus (CP), a highly vascularized structure protruding into the ventricles of the brain, is one of the most understudied tissues in ...

Para obter uma melhor compreensão da composição e estrutura do plexo coroide, um método eficiente para isolar o plexo coroide fora dos ventrículos cerebrais é um primeiro passo inestimável. Com esta técnica de microdissecção é possível dissecar o plexo coroide para fora dos ventrículos cerebrais, contendo sua função, viabilidade e estrutura sem contaminar o plexo coroide com o tecido circundante. Um obstáculo significativo no isolamento do plexo coroide é a identificação da estrutura que ainda flutua nos ventrículos cerebrais.A coloração do plexo coroide com azul de bromofenol facilita o isolamento. Quem demonstrará o procedimento será Elien Van Wonterghem, nosso gerente de laboratório. Comece com a preparação de um anestésico terminal, solução de perfusão transcárdica e uma solução necessária para microscopia eletrônica de varredura, ou MEV, e outras soluções como mencionado no texto.Para isolar o cérebro do camundongo, coloque o animal anestesiado terminalmente na posição de decúbito dorsal e fixe o camundongo fixando os membros em uma placa. Desinfetar o tórax borrifando etanol a 70% antes de fazer uma incisão de aproximadamente quatro centímetros logo abaixo do diafragma usando uma lâmina cirúrgica de aço carbono. Abra a pele e exponha o tórax com tesoura cirúrgica.Corte o diafragma completamente aberto e separe o tórax para expor os pulmões e o coração batendo. Com uma bomba de perfusão, o camundongo perfunde transcardialmente 10 mililitros da solução de perfusão a uma taxa de 4,5 mililitros por minuto. Insira uma agulha de calibre 26 no ventrículo esquerdo para bombear a solução para o circuito sistêmico.Usando tesoura cirúrgica, corte o átrio direito para o sangue sair da circulação. Após a decapitação do rato, abra o couro cabeludo fazendo uma incisão começando entre as orelhas até a parte superior dos olhos. Puxe a pele lateralmente para expor o crânio.Em seguida, abra o crânio seguindo as suturas escamosas em direção à parte nasal. Uma vez feito, coloque o cérebro em uma placa de Petri gelada e adicione um mililitro de PBS gelado ao tecido cerebral. Para isolar o plexo coroide flutuando no quarto ventrículo, corte suavemente o cerebelo do cérebro usando um bisturi.Remova as partes restantes do tecido do tronco cerebral do cerebelo. Gire o cérebro para que a linha de corte esteja voltada para cima, garantindo que a cavidade do quarto ventrículo seja visível no meio da seção com o plexo coroide situado no local dorsal. Se necessário, abra o ventrículo puxando o tecido conjuntivo com pinças afiadas.Rasgue suavemente o plexo coroide para fora da parede do ventrículo usando pinças minúsculas e afiadas. Para isolar o plexo coroide do ventrículo lateral, corte sagitalmente o cérebro em dois hemisférios usando pinças minúsculas e afiadas. Gire um hemisfério cerebral para que a linha de corte seja para cima.Para revelar o ventrículo lateral, afaste suavemente o córtex do tálamo. Retrair o hipocampo para a linha de corte sagital média. O ventrículo lateral é agora visível com o plexo coroide situado na parte inferior do ventrículo.Se necessário, abra um pouco o ventrículo puxando o tecido conjuntivo com pinças afiadas. Use pinças minúsculas e afiadas para arrancar suavemente o plexo coroide da parede do ventrículo. Para realizar o preparo da amostra para MEV, transfira o plexo coroide recém-isolado para uma solução de fixação recém-feita e incube durante a noite a quatro graus Celsius.Uma vez feito, lavar a amostra três vezes usando três a cinco mililitros de tampão cacodilato de sódio 0,1 molar por cinco minutos cada. Postfixar as amostras em três a cinco mililitros de tetróxido de ósmio a 2% em tampão cacodilato de sódio 0,1 molar por 30 minutos. Em seguida, lave as amostras três vezes por cinco minutos cada usando três a cinco mililitros de água ultrapura.Em seguida, desidratar as amostras em uma série crescente de concentrações de álcool etílico geladas com 15 minutos por solução de álcool etílico. Use um secador de ponto crítico para secar a amostra corretamente. Posicione a amostra cuidadosamente em um suporte de amostra com um adesivo de carbono e visualize as amostras de plexo coroide usando MEV.O presente protocolo facilitou o eficiente isolamento do plexo coroide do encéfalo lateral e do quarto ventrículo de camundongos. A perfusão com azul de bromofenol resultou na visualização do plexo coroide. Quando o azul de bromofenol não era permitido nas etapas posteriores de processamento, a perfusão com PBS-heparina ou nenhuma perfusão era realizada para o processamento.A análise morfológica da microscopia eletrônica de varredura da superfície das células epiteliais do plexo coroide, ou ECP, mostra claramente a estrutura dos dois braços do quarto ventrículo e a forma típica em forma de C do plexo coroide lateral isolado do ventrículo lateral. Um maior aumento da MEV revelou estruturas vesiculais no lado apical das células CPE e microvilosidades, indicando que alterações morfológicas das células CPE em condições de doença podem ser investigadas usando MEV. É importante apenas tocar e retirar o tecido do plexo coroide para não contaminar a amostra com o tecido circundante.Use o cuidado necessário para preservar a estrutura do plexo coroide. Uma variedade de técnicas a jusante pode ser aplicada no plexo coroide isolado para investigar sua estrutura e função, desde a análise microscópica sobre a análise do transcriptoma até a citometria de fluxo. Microdissecar o plexo coroide para fora do cérebro nos permite obter uma melhor visão sobre a estrutura e função deste minúsculo tecido cerebral.Esse conhecimento é essencial para melhor compreender seu papel nas doenças neurológicas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

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Visualização do Sistema Nervoso embrionárias no Whole-mount Drosophila Os embriões

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Neurociência

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Ion Beam centrada Fresagem e Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido Cerebral

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

A descrição visual do Dissecção da vasculatura cerebral Superfície e Meninges Associados e plexo coróide do cérebro de um rato

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Observação do movimento ciliar de células epiteliais do plexo coróide<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Análise do Cérebro mitocôndrias Usando Serial Block-cara Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...