Name: microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus
Uploaded: 2022-12-16T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus at JoVE.com

Эта работа была поддержана Бельгийским фондом исследований болезни Альцгеймера (SAO; номер проекта: 20200032), Исследовательским фондом Фландрии (FWO Vlaanderen; номера проектов: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) и Фондом Байе Латура. Мы благодарим VIB BioImaging Core за обучение, поддержку и доступ к инструментальному парку.

Все эксперименты на животных, описанные в этом исследовании, были проведены в соответствии с национальным (Бельгийский закон 14/08/1986 и 22/12/2003, Бельгийский королевский указ 06/04/2010) и европейским законодательством (Директивы ЕС 2010/63/ЕС, 86/609/ЕЭС). Все эксперименты на мышах и животных были одоб?...

<ol>
	<li>Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hidden+epithelial+barrier+in+the+brain+with+a+central+role+in+regulating+brain+homeostasis.+Implications+for+aging.">A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging.</a> Annals of the American Thoracic Society. 13, 407-410 (2016).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).</li><li>Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+central+nervous+system+inflammation.">Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation.</a> Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).</li><li>Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+movers+and+shapers+in+immune+privilege+of+the+CNS.">The movers and shapers in immune privilege of the CNS.</a> Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).</li><li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces:+a+role+for+connexins.">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins.</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li><li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules.">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).</li><li>Redzic, Z. B., Segal, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+choroid+plexus+and+the+physiology+of+the+choroid+plexus+epithelium.">The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).</li><li>Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+anatomy+and+functions+of+the+choroid+plexus+in+healthy+and+diseased+brain.">The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430 (2020).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+leukocyte+infiltration+at+the+choroid+plexus+in+(neuro)inflammatory+disorders.">Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders.</a> Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).</li><li>Brkic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;oligomers+disrupt+blood-CSF+barrier+integrity+by+activating+matrix+metalloproteinases.">Amyloid &#946;oligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases.</a> Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).</li><li>Vandenbroucke, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloprotease+8-dependent+extracellular+matrix+cleavage+at+the+blood-CSF+barrier+contributes+to+lethality+during+systemic+inflammatory+diseases.">Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases.</a> Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+response+to+a+repeated+peripheral+inflammatory+stimulus.">The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus.</a> BMC Neuroscience. 10, 135 (2009).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease:+dialogues+into+and+out+of+the+brain.">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li><li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system.">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li><li>Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balanced+view+of+choroid+plexus+structure+and+function:+Focus+on+adult+humans.">A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans.</a> Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).</li><li>Lehtinen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+and+cerebrospinal+fluid:+emerging+roles+in+development,+disease,+and+therapy.">The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy.</a> Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).</li><li>Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+Alzheimer's+disease:+more+than+just+a+barrier.">The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier.</a> Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+implications+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+neuropsychiatric+disorders.">Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).</li><li>Simon, M. J., Iliff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebrospinal+fluid+(CSF)+flow+in+neurodegenerative,+neurovascular+and+neuroinflammatory+disease.">Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).</li><li>Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+role+for+CSF+turnover+and+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+late+onset+Alzheimer's+disease.">A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+iron+metabolism+is+part+of+the+choroid+plexus+response+to+peripheral+inflammation.">Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation.</a> Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).</li><li>Thouvenot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteomic+analysis+of+mouse+choroid+plexus+secretome+reveals+a+high+protein+secretion+capacity+of+choroidal+epithelial+cells.">The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells.</a> Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).</li><li>Vandendriessche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+extracellular+vesicle+secretion+at+the+blood-cerebrospinal+fluid+interface+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143 (2021).</li><li>Bowyer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+description+of+the+dissection+of+the+cerebral+surface+vasculature+and+associated+meninges+and+the+choroid+plexus+from+rat+brain.">A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4285 (2012).</li><li>Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+the+ciliary+movement+of+choroid+plexus+epithelial+cells+ex+vivo.">Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52991 (2015).</li><li>Dani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+and+spatial+map+of+the+choroid+plexus+across+brain+ventricles+and+ages.">A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages.</a> Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).</li><li>Carloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+choroid+plexus+vascular+barrier+closing+during+intestinal+inflammation.">Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation.</a> Science. 374 (6566), 439-448 (2021).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+Niemann-Pick+disease+type.">Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type.</a> C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482 (2021).</li><li>Shipley, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+calcium+dynamics+and+immune+surveillance+at+the+choroid+plexus+blood-cerebrospinal+fluid+interface.">Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface.</a> Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).</li><li>Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+studies+using+serial+block+face+and+focused+ion+beam+scan+electron+microscopy.">Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e59480 (2019).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+(SEM).">Scanning Electron Microscopy (SEM).</a> JoVE Science Education Database. , (2022).</li><li>Pauwels, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus+derived+extracelular+vesicles+exhibit+brain+targeting+characteristics).">Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics).</a> Biomaterials. 290, 121830 (2022).</li></ol>

Здесь описан способ выделения сосудистого сплетения (ХП) из бокового желудочка и четвертого желудочка мозга мыши. Весь этот метод монтажа CP облегчает дальнейший анализ с использованием репертуара методов, чтобы получить полное представление о морфологии CP, клеточном составе, транскри...

Жесткие барьеры отделяют центральную нервную систему (ЦНС) от периферии, включая гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и гемато-спинномозговой жидкость (СМЖ). Эти барьеры защищают ЦНС от внешних воздействий и обеспечивают сбалансированную и контролируемую микросреду 1,2,3. В то время как ГЭБ широко изучался с течением времени, гемато-ликворный барьер, расположенный в сосудистом сплетении (ХП), только приобрел растущий исследовательский интерес в течение последнего десятилетия. Этот последний барьер может быть обнаружен в четырех желудочках головного мозга (рис. 1A, B) и характеризуется одним слоем эпителиальных клеток сосудистого сплетения (CPE), окружающих центральную строму, негерметичные капилляры, фибробласты и популяцию лимфоидных и миелоидных клеток (рис. 1C)4,5,6 . Клетки CPE прочно соединены между собой плотными соединениями, что предотвращает утечку из нижележащих фенестрированных кровеносных капилляров в спинномозговую жидкость и мозг. Кроме того, транспорт через клетки CPE регулируется рядом транспортных систем внутрь и наружу, которые управляют притоком полезных соединений (например, питательных веществ и гормонов) из крови в спинномозговую жидкость и оттоком вредных молекул (например, метаболических отходов, избытка нейротрансмиттеров) в другом направлении 1,6. Чтобы иметь возможность выполнять свою активную транспортную функцию, клетки CPE содержат многочисленные митохондрии в своей цитоплазме7. Кроме того, CP является основным источником спинномозговой жидкости и действует как привратник мозга благодаря присутствию резидентных воспалительных клеток1. Благодаря своему уникальному расположению между кровью и мозгом, CP также идеально подходит для осуществления иммунного надзора8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig01.jpg"> Рисунок 1: Схематический обзор расположения и состава сосудистого сплетения (ХП). (A, B) Ткань CP находится в двух боковых, третьем и четвертом желудочках (A) человеческого и (B) мышиного мозга. (C) Ткань CP состоит из одного слоя плотно соединенных кубовидных клеток эпителия CP (CPE), окружающих фенестрированные капилляры, рыхлую соединительную ткань, лимфоидные и миелоидные клетки, и образует гемато-спинномозговой барьер (адаптированный и модифицированный из ссылки23). Рисунок создан с помощью Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
За последнее десятилетие все больше доказательств, в том числе несколько отчетов нашей исследовательской группы, показали, что ДЦП играет центральную роль в здоровье и болезнях 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Например, известно, что стареющий барьер кровь-спинномозговая жидкость проявляет морфологические изменения, в частности, в ядрах, микроворсинках и базальной мембране 1,19. Кроме того, в контексте болезни Альцгеймера нарушается общая целостность барьера, и все эти возрастные изменения кажутся еще более выраженными 1,8,20. В дополнение к морфологическим изменениям, транскриптом, протеом и секретом CP изменяются во время болезни 12,21,22,23. Таким образом, передовые знания о ДЦП необходимы для лучшего понимания его роли в неврологических заболеваниях и потенциальной разработки новых терапевтических стратегий.
Эффективный метод точной микродиссекции ЦП из желудочков головного мозга является первым бесценным шагом, позволяющим правильно исследовать эту крошечную структуру мозга. Из-за своей высокой васкуляризированной природы (рис. 2B) CP, плавающий внутри желудочковых полостей мозга, может быть идентифицирован с помощью бинокулярного микроскопа. Тем не менее, транскардиальная перфузия часто требуется для последующего анализа, что усложняет правильную идентификацию и изоляцию ткани CP (рис. 2C). Если позволяют дальнейшие этапы обработки (например, в случае анализа РНК и белка), CP можно визуализировать с помощью транскардиальной перфузии бромфенольным синим (рис. 2A). В нескольких публикациях уже описывается выделение ДЦП из мозгакрысы 24 и мышного детеныша 25. Здесь описан метод изоляции микродиссекции для выделения CP от взрослых мышей. Важно отметить, что этот метод изоляции сохраняет жизнеспособность, функцию и структуру клеток внутри CP. Здесь описана изоляция ЦП, плавающая в четвертом и боковых желудочках. Короче говоря, мышей неизлечимо анестезируют и, при необходимости, транскардиально перфузируют. Однако следует отметить, что перфузия может повредить структуру клеток внутри КП. Следовательно, если образец должен быть проанализирован с использованием просвечивающей электронной микроскопии (TEM), сканирующей электронной микроскопии с последовательным блоком (SBF-SEM) или сфокусированного ионного пучка SEM (FIB-SEM), перфузию не следует проводить. Затем весь мозг изолируется, и щипцы используются для сагиттальной гемисекции мозга. Отсюда ХП, плавающие в боковых желудочках, могут быть идентифицированы и рассечены, в то время как ХП из четвертого желудочка может быть выделен из мозжечковой стороны мозга.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig02.jpg"> Рисунок 2: Визуализация (A-C) четвертого и (D-F) бокового сосудистого сплетения желудочка (CP) после (A, D) перфузии бромфенольного синего, (B, E) отсутствия перфузии и (C, F) перфузии PBS / гепарином. Снимки сделаны с помощью стереомикроскопа (8-32-кратное увеличение). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
После того, как CP правильно рассечен из желудочков мозга, можно применить целый репертуар методов, чтобы получить дальнейшее понимание функции этой структуры. Например, проточная цитометрия или секвенирование одноклеточной РНК могут быть выполнены для количественного определения и фенотипического анализа инфильтрирующих воспалительных клеток при определенных условияхзаболевания 26,27. В дополнение к клеточному составу, молекулярный состав CP может быть проанализирован для оценки присутствия цитокинов и хемокинов с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), иммуноблоттинга или одновременного анализа нескольких цитокинов с использованием массивацитокиновых шариков 28. Кроме того, транскриптомный, сосудистый, иммунно-клеточный гистологический и секретомный анализы могут быть выполнены на микрорассеченных эксплантатахCP 29. Здесь сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) на всей монтировке CP используется для получения общего представления о структуре CP. SEM использует пучок сфокусированных электронов для сканирования поверхности и создания изображения топографии и состава поверхности. Поскольку длина волны электронов намного меньше, чем у света, разрешение СЭМ находится в нанометровом диапазоне и превосходит разрешение светового микроскопа. Следовательно, морфологические исследования на субклеточном уровне могут быть выполнены с помощью SEM. Вкратце, рассеченный CP немедленно переносится в фиксатор, содержащий глутаровый альдегид, для фиксации в течение ночи с последующей осмикацией и окрашиванием уранилацетатом. Затем образцы обрабатывают окраской аспартата свинца, обезвоживают и, в конечном итоге, внедряют для визуализации.
Таким образом, этот протокол способствует эффективному выделению CP из желудочков головного мозга мыши, которые могут быть дополнительно проанализированы с использованием различных последующих методов для исследования его структуры и функции.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G x 1/2 needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium specimen mounts</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel surgial blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0210</td>
			<td>size: 0.45 mm x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon adhesive tabs -12 mm</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>77825-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer&#160;</td>
			<td>Bal-Tec&#160;</td>
			<td>CPD030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossbeam 540</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SEM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel</td>
			<td>Metrohm Belgium N.V</td>
			<td>CPA-7800160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide&#160;</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#160;</td>
			<td>Quorum&#160;</td>
			<td>Q150T ES</td>
			<td>PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kela NV</td>
			<td>514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Basket Stainless Steel</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>70190-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi DV4 Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus

Сосудистое сплетение (ХП), сильно васкуляризированная структура, выступающая в желудочки головного мозга, является одной из наиболее малоизученных тканей в неврологии. Поскольку становится все более очевидным, что эта крошечная структура играет решающую роль в здоровье и заболеваниях центральной нервной системы (ЦНС), крайне важно правильно рассечь ДЦП из желудочков головного мозга таким образом, чтобы обеспечить последующую обработку, начиная от функционального и заканчивая структурным анализом. Здесь описана изоляция ЦП бокового и четвертого желудочков головного мозга мыши без необходимости использования специализированных инструментов или оборудования. Этот метод изоляции сохраняет жизнеспособность, функцию и структуру клеток внутри CP. Из-за высокой васкуляризации CP можно визуализировать плавающим внутри желудочковых полостей мозга с помощью бинокулярного микроскопа. Однако транскардиальная перфузия, необходимая для последующего анализа, может усложнить идентификацию ткани ЦП. В зависимости от дальнейших этапов обработки (например, анализ РНК и белка) это может быть решено путем визуализации CP с помощью транскардиальной перфузии бромфеноловым синим. После выделения CP может быть обработан с использованием нескольких методов, включая анализ РНК, белка или отдельных клеток, чтобы получить более глубокое понимание функции этой особой структуры мозга. Здесь сканирующая электронная микроскопия (SEM) на всей монтировке CP используется для получения общего представления о структуре.

Описанный протокол способствует эффективному выделению CP из бокового (рис. 2A-C) и четвертого (рис. 2D-F) желудочков головного мозга мыши. После изоляции всего мозга щипцы используются для сагиттальной гемисекции мозга и ...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus at JoVE.com

Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

Сосудистое сплетение (ХП), малоизученная ткань в неврологии, играет ключевую роль в здоровье и заболеваниях центральной нервной системы. Этот протокол описывает метод микродиссекции для выделения CP и использование сканирующей электронной микроскопии для получения общего представления о его клеточной структуре.

Микродиссекция и сканирующая электронная микроскопия всего массива Визуализация сосудистого сплетения мыши

The choroid plexus (CP), a highly vascularized structure protruding into the ventricles of the brain, is one of the most understudied tissues in ...

Чтобы лучше понять состав и структуру сосудистого сплетения, эффективным методом выделения сосудистого сплетения из желудочков головного мозга является первый неоценимый шаг. С помощью этого метода микродиссекции можно рассечь сосудистое сплетение из желудочков головного мозга, сохраняя при этом его функцию, жизнеспособность и структуру, не загрязняя сосудистое сплетение окружающими тканями. Существенным препятствием в изоляции сосудистого сплетения является идентификация структуры, поскольку она все еще плавает в желудочках мозга.Окрашивание сосудистого сплетения бромфеноловым синим облегчает изоляцию. Продемонстрирует процедуру Элиен Ван Вонтергем, руководитель нашей лаборатории. Начните с приготовления терминального анестетика, раствора транскардиальной перфузии и раствора, необходимого для сканирующей электронной микроскопии или СЭМ, а также других растворов, упомянутых в тексте.Чтобы изолировать мозг мыши, поместите неизлечимо анестезированное животное в положение дорсального пролежня и зафиксируйте мышь, прижав конечности к тарелке. Продезинфицируйте грудную клетку, распылив 70% этанол, прежде чем сделать разрез примерно на четыре сантиметра прямо под диафрагмой с помощью хирургического лезвия из углеродистой стали. Вскрыть кожу и обнажить грудную клетку с помощью хирургических ножниц.Разрежьте диафрагму полностью и отделите грудную клетку, чтобы обнажить легкие и бьющееся сердце. С помощью перфузионного насоса транскардиально перфузируйте мышь 10 миллилитрами перфузионного раствора со скоростью 4,5 миллилитра в минуту. Вставьте иглу 26-го калибра в левый желудочек, чтобы перекачать раствор в системный контур.С помощью хирургических ножниц разрежьте правое предсердие, чтобы кровь вышла из кровообращения. После обезглавливания мышь разрезают кожу головы, сделав разрез, начиная между ушами и заканчивая глазами. Потяните кожу вбок, чтобы обнажить череп.Затем разрежьте череп, проведя чешуйчатые швы по направлению к носовой части. После этого поместите мозг в ледяную чашку Петри и добавьте один миллилитр ледяного PBS в ткань мозга. Чтобы изолировать сосудистое сплетение, плавающее в четвертом желудочке, аккуратно отрежьте мозжечок от головного мозга с помощью скальпеля.Удалите оставшиеся части ткани ствола мозга из мозжечка. Поверните мозг так, чтобы линия разреза была обращена вверх, убедившись, что полость четвертого желудочка видна в середине участка с сосудистым сплетением, лежащим на дорсальном участке. При необходимости вскрывают желудочек, вытягивая соединительную ткань острыми щипцами.Аккуратно вырвите сосудистое сплетение из стенки желудочка с помощью крошечных острых щипцов. Чтобы изолировать сосудистое сплетение от бокового желудочка, сагиттально разрезают мозг на два полушария с помощью крошечных острых щипцов. Поверните одно полушарие мозга так, чтобы линия разреза была направлена вверх.Чтобы раскрыть боковой желудочек, аккуратно оттяните кору от таламуса. Втяните гиппокамп к середине сагиттальной линии разреза. Боковой желудочек теперь виден с сосудистым сплетением, лежащим на дне желудочка.При необходимости немного приоткройте желудочек, растянув соединительную ткань острыми щипцами. Используйте крошечные острые щипцы, чтобы аккуратно вырвать сосудистое сплетение из стенки желудочка. Чтобы выполнить пробоподготовку для СЭМ, перенесите свежеизолированное сосудистое сплетение в свежеприготовленный фиксирующий раствор и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия.После этого промойте образец три раза, используя от трех до пяти миллилитров 0,1-молярного буфера какодилата натрия в течение пяти минут каждый. Постфиксируйте образцы в трех-пяти миллилитрах 2%-ного тетраоксида осмия в 0,1-молярном буфере какодилата натрия в течение 30 минут. Затем промойте образцы три раза по пять минут каждый, используя три-пять миллилитров сверхчистой воды.Затем обезвоживают образцы в возрастающей серии концентраций ледяного этилового спирта в течение 15 минут на раствор этилового спирта. Используйте сушилку для критических точек, чтобы правильно высушить образец. Осторожно поместите образец на крепление для образца с помощью карбоновой наклейки и визуализируйте образцы сосудистого сплетения с помощью SEM.Настоящий протокол способствовал эффективной изоляции сосудистого сплетения от бокового и четвертого желудочков мозга мыши. Перфузия бромфеноловым синим привела к визуализации сосудистого сплетения. Когда бромфенол синий не допускался на дальнейших стадиях обработки, перфузия PBS-гепарином или перфузия не проводилась для обработки.Морфологический анализ поверхности эпителиальных клеток сосудистого сплетения, или CPE, ясно показывает структуру двух плеч четвертого желудочка и типичную С-образную форму латерального сосудистого сплетения, выделенного из бокового желудочка. Более высокое увеличение SEM выявило везикулоподобные структуры на апикальной стороне клеток CPE и микроворсинок, что указывает на то, что морфологические изменения клеток CPE в условиях заболевания могут быть исследованы с помощью SEM. Важно только трогать и вынимать ткань сосудистого сплетения, чтобы не загрязнить образец окружающими тканями.Соблюдайте необходимую осторожность, чтобы сохранить структуру сосудистого сплетения. Различные последующие методы могут быть применены к изолированному сосудистому сплетению для исследования его структуры и функции, начиная от микроскопического анализа через транскриптомный анализ и проточную цитометрию. Микрорассечение сосудистого сплетения из мозга позволяет нам лучше понять структуру и функцию этой крошечной мозговой ткани.Эти знания необходимы для лучшего понимания его роли в неврологических заболеваниях.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Визуализация Эмбриональные нервной системы в целом монтажа Drosophila Эмбрионы

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Препарирование Мышь Око за полного горе пигментный эпителий сетчатки

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Сосредоточены ионного пучка фрезерные и сканирующей электронной микроскопии ткани мозга

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Воспроизводимые мыши седалищного нерва и Давка Последующие оценки регенерации полного анализа горы мышц

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

Визуальное описание вскрытия головного сосудистой поверхности и связанного с мозговых оболочек и сосудистых сплетений из мозга крысы

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Всего горе иммунофлуоресцентного окрашивания новорожденных Retina мыши по расследованию ангиогенеза<em&gt; В естественных условиях</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Всего монтажа Визуализация эмбриона мыши Сенсорная Axon прогнозам

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Наблюдение за Мерцательная Движения сосудистое сплетение эпителиальных клеток<em&gt; Экс Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Всего горе Вскрытие и Иммунофлуоресценции взрослых мышей улитки

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Анализ мозга Митохондрии Использование последовательного Block-Face сканирующая электронная микроскопия

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...