Name: microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus
Uploaded: 2022-12-16T14:10:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Belga para la Investigación del Alzheimer (SAO; número de proyecto: 20200032), la Fundación de Investigación de Flandes (FWO Vlaanderen; números de proyecto: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) y el Fondo Baillet Latour. Agradecemos al VIB BioImaging Core por la capacitación, el apoyo y el acceso al parque de instrumentos.

Todos los experimentos con animales descritos en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con la legislación nacional (Ley belga 14/08/1986 y 22/12/2003, Real Decreto belga 06/04/2010) y europea (Directivas de la UE 2010/63 / UE, 86/609 / CEE). Todos los experimentos en ratones y protocolos con animales fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Gante (número de permiso LA1400091 y EC 2017-026).
1. Preparación
<ol><li>Anestésicos: Preparar un anest?...

<ol>
	<li>Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hidden+epithelial+barrier+in+the+brain+with+a+central+role+in+regulating+brain+homeostasis.+Implications+for+aging.">A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging.</a> Annals of the American Thoracic Society. 13, 407-410 (2016).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).</li><li>Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+central+nervous+system+inflammation.">Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation.</a> Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).</li><li>Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+movers+and+shapers+in+immune+privilege+of+the+CNS.">The movers and shapers in immune privilege of the CNS.</a> Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).</li><li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces:+a+role+for+connexins.">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins.</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li><li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules.">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).</li><li>Redzic, Z. B., Segal, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+choroid+plexus+and+the+physiology+of+the+choroid+plexus+epithelium.">The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).</li><li>Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+anatomy+and+functions+of+the+choroid+plexus+in+healthy+and+diseased+brain.">The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430 (2020).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+leukocyte+infiltration+at+the+choroid+plexus+in+(neuro)inflammatory+disorders.">Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders.</a> Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).</li><li>Brkic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;oligomers+disrupt+blood-CSF+barrier+integrity+by+activating+matrix+metalloproteinases.">Amyloid &#946;oligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases.</a> Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).</li><li>Vandenbroucke, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloprotease+8-dependent+extracellular+matrix+cleavage+at+the+blood-CSF+barrier+contributes+to+lethality+during+systemic+inflammatory+diseases.">Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases.</a> Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+response+to+a+repeated+peripheral+inflammatory+stimulus.">The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus.</a> BMC Neuroscience. 10, 135 (2009).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease:+dialogues+into+and+out+of+the+brain.">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li><li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system.">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li><li>Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balanced+view+of+choroid+plexus+structure+and+function:+Focus+on+adult+humans.">A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans.</a> Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).</li><li>Lehtinen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+and+cerebrospinal+fluid:+emerging+roles+in+development,+disease,+and+therapy.">The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy.</a> Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).</li><li>Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+Alzheimer's+disease:+more+than+just+a+barrier.">The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier.</a> Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+implications+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+neuropsychiatric+disorders.">Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).</li><li>Simon, M. J., Iliff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebrospinal+fluid+(CSF)+flow+in+neurodegenerative,+neurovascular+and+neuroinflammatory+disease.">Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).</li><li>Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+role+for+CSF+turnover+and+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+late+onset+Alzheimer's+disease.">A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+iron+metabolism+is+part+of+the+choroid+plexus+response+to+peripheral+inflammation.">Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation.</a> Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).</li><li>Thouvenot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteomic+analysis+of+mouse+choroid+plexus+secretome+reveals+a+high+protein+secretion+capacity+of+choroidal+epithelial+cells.">The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells.</a> Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).</li><li>Vandendriessche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+extracellular+vesicle+secretion+at+the+blood-cerebrospinal+fluid+interface+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143 (2021).</li><li>Bowyer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+description+of+the+dissection+of+the+cerebral+surface+vasculature+and+associated+meninges+and+the+choroid+plexus+from+rat+brain.">A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4285 (2012).</li><li>Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+the+ciliary+movement+of+choroid+plexus+epithelial+cells+ex+vivo.">Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52991 (2015).</li><li>Dani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+and+spatial+map+of+the+choroid+plexus+across+brain+ventricles+and+ages.">A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages.</a> Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).</li><li>Carloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+choroid+plexus+vascular+barrier+closing+during+intestinal+inflammation.">Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation.</a> Science. 374 (6566), 439-448 (2021).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+Niemann-Pick+disease+type.">Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type.</a> C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482 (2021).</li><li>Shipley, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+calcium+dynamics+and+immune+surveillance+at+the+choroid+plexus+blood-cerebrospinal+fluid+interface.">Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface.</a> Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).</li><li>Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+studies+using+serial+block+face+and+focused+ion+beam+scan+electron+microscopy.">Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e59480 (2019).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+(SEM).">Scanning Electron Microscopy (SEM).</a> JoVE Science Education Database. , (2022).</li><li>Pauwels, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus+derived+extracelular+vesicles+exhibit+brain+targeting+characteristics).">Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics).</a> Biomaterials. 290, 121830 (2022).</li></ol>

Aquí, se describe un método para aislar el plexo coroideo (PC) fuera del ventrículo lateral y el cuarto ventrículo de un cerebro de ratón. Todo este método de montaje del PC facilita el análisis posterior utilizando un repertorio de técnicas para obtener una visión completa de la morfología del PC, la composición celular, el transcriptoma, el proteoma y el secretoma. Tales análisis son cruciales para obtener una mejor comprensión de esta notable estructura que sobresale de los ventrículos del cerebro. Este ...

Las barreras estrechas separan el sistema nervioso central (SNC) de la periferia, incluida la barrera hematoencefálica (BBB) y la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (LCR). Estas barreras protegen el SNC contra insultos externos y aseguran un microambiente equilibrado y controlado 1,2,3. Si bien la barrera hematoencefálica se ha estudiado ampliamente a lo largo del tiempo, la barrera sangre-LCR ubicada en el plexo coroideo (PC) solo ha ganado un creciente interés de investigación durante la última década. Esta última barrera se puede encontrar en los cuatro ventrículos del cerebro (Figura 1A, B) y se caracteriza por una sola capa de células epiteliales del plexo coroideo (CPE) que rodean un estroma central, capilares con fugas, fibroblastos y una población de células linfoides y mieloides (Figura 1C)4,5,6. Las células CPE están firmemente interconectadas por uniones estrechas, evitando así la fuga de los capilares sanguíneos fenestrados subyacentes hacia el LCR y el cerebro. Además, el transporte a través de las células CPE está regulado por una serie de sistemas de transporte hacia adentro y hacia afuera que manejan la afluencia de compuestos beneficiosos (por ejemplo, nutrientes y hormonas) de la sangre al LCR y el flujo de salida de moléculas dañinas (por ejemplo, desechos metabólicos, exceso de neurotransmisores) en la otra dirección 1,6. Para poder ejercer su función de transporte activo, las células CPE contienen numerosas mitocondrias en su citoplasma7. Además, el PC es la principal fuente de LCR y actúa como el guardián del cerebro por la presencia de células inflamatorias residentes1. Debido a su ubicación única entre la sangre y el cerebro, el PC también está perfectamente posicionado para llevar a cabo la vigilancia inmune8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig01.jpg"> Figura 1: Descripción esquemática de la ubicación y composición del plexo coroideo (PC). El tejido CP (A, B) se encuentra dentro de los dos ventrículos laterales, tercero y cuarto de (A) cerebro humano y (B) de ratón. (C) El tejido CP consiste en una sola capa de células de epitelio CP cuboidal (CPE) estrechamente conectadas que rodean los capilares fenestrados, el tejido conectivo suelto y las células linfoides y mieloides, y forma la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (adaptada y modificada de la referencia23). Figura creada con Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Durante la última década, la creciente evidencia, incluyendo varios informes de nuestro grupo de investigación, han revelado que la PC juega un papel central en la salud y la enfermedad 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Por ejemplo, se sabe que la barrera sangre-LCR envejecida presenta alteraciones morfológicas en, entre otros, los núcleos, las microvellosidades y la membrana basal 1,19. Además, en el contexto de la enfermedad de Alzheimer, la integridad general de la barrera se ve comprometida y todos estos cambios relacionados con la edad parecen ser aún más pronunciados 1,8,20. Además de los cambios morfológicos, el transcriptoma, el proteoma y el secretoma del PC se alteran durante la enfermedad 12,21,22,23. Por lo tanto, el conocimiento avanzado de la PC es esencial para comprender mejor su papel en las enfermedades neurológicas y potencialmente desarrollar nuevas estrategias terapéuticas.
Un método eficiente para la microdisección precisa de la PC fuera de los ventrículos cerebrales es el primer paso invaluable para permitir la investigación adecuada de esta pequeña estructura cerebral. Debido a su naturaleza altamente vascularizada (Figura 2B), el PC que flota dentro de las cavidades ventriculares del cerebro se puede identificar utilizando un microscopio binocular. Sin embargo, a menudo se requiere perfusión transcárdica para el análisis posterior, lo que complica la identificación y el aislamiento adecuados del tejido CP (Figura 2C). Si los pasos de procesamiento adicionales lo permiten (por ejemplo, en el caso del análisis de ARN y proteínas), el PC se puede visualizar mediante perfusión transcárdica con azul de bromofenol (Figura 2A). Varias publicaciones ya describen el aislamiento del PC de cerebros de ratas24 y crías de ratón25. Aquí, se describe una técnica de aislamiento de microdisección para aislar el PC de ratones adultos. Es importante destacar que esta técnica de aislamiento preserva la viabilidad, función y estructura de las células dentro del PC. Aquí se describe el aislamiento del PC flotando en el cuarto ventrículo y lateral. En resumen, los ratones son anestesiados terminalmente y, si es necesario, perfundidos transcárdicamente. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la perfusión puede dañar la estructura de las células dentro de la PC. En consecuencia, si la muestra se va a analizar utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie (SBF-SEM) o SEM de haz de iones enfocado (FIB-SEM), no se debe realizar perfusión. A continuación, se aísla todo el cerebro y se utilizan fórceps para hemisectar sagitalmente el cerebro. A partir de aquí, los PC que flotan en los ventrículos laterales se pueden identificar y diseccionar, mientras que el PC del cuarto ventrículo se puede aislar del lado cerebeloso del cerebro.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig02.jpg"> Figura 2: Visualización del plexo coroideo (PC) del ventrículo lateral (A-C) y (D-F) después de la perfusión (A,D) de azul de bromofenol, (B,E) sin perfusión y (C,F) con PBS/heparina. Las imágenes se toman con un microscopio estéreo (aumento de 8x-32x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Una vez que el PC se disecciona adecuadamente de los ventrículos cerebrales, se puede aplicar todo un repertorio de técnicas para obtener una mayor comprensión de la función de esta estructura. Por ejemplo, la citometría de flujo o la secuenciación de ARN unicelular pueden realizarse para cuantificar y analizar fenotípicamente las células inflamatorias infiltrantes bajo ciertas condiciones de enfermedad26,27. Además de la composición celular, la composición molecular del PC puede analizarse para evaluar la presencia de citoquinas y quimiocinas mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoblot o mediante análisis simultáneo de múltiples citoquinas utilizando la matriz de perlas de citoquinas28. Además, se pueden realizar análisis de transcriptoma, vascular, histología de células inmunes y secretoma en los explantes de CP microdisecados29. Aquí, la microscopía electrónica de barrido (SEM) en CP de montaje completo se utiliza para obtener una visión general de la estructura CP. SEM utiliza un haz de electrones enfocados para escanear sobre la superficie y crear una imagen de la topografía y composición de la superficie. Dado que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de la luz, la resolución de SEM está en el rango nanométrico y es superior a la de un microscopio óptico. En consecuencia, los estudios morfológicos a nivel subcelular se pueden realizar a través de SEM. Brevemente, el CP disecado se transfiere inmediatamente a un fijador que contiene glutaraldehído para una fijación durante la noche, seguida de osmicación y tinción de acetato de uranilo. Luego, las muestras se tratan con tinción de aspartato de plomo, se deshidratan y, en última instancia, se incrustan para obtener imágenes.
Por lo tanto, este protocolo facilita el aislamiento eficiente de la PC de los ventrículos cerebrales del ratón, que se pueden analizar más a fondo utilizando una variedad de técnicas posteriores para investigar su estructura y función.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G x 1/2 needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium specimen mounts</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel surgial blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0210</td>
			<td>size: 0.45 mm x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon adhesive tabs -12 mm</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>77825-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer&#160;</td>
			<td>Bal-Tec&#160;</td>
			<td>CPD030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossbeam 540</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SEM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel</td>
			<td>Metrohm Belgium N.V</td>
			<td>CPA-7800160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide&#160;</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#160;</td>
			<td>Quorum&#160;</td>
			<td>Q150T ES</td>
			<td>PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kela NV</td>
			<td>514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Basket Stainless Steel</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>70190-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi DV4 Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus

El plexo coroideo (PC), una estructura altamente vascularizada que sobresale en los ventrículos del cerebro, es uno de los tejidos menos estudiados en neurociencia. A medida que cada vez está más claro que esta pequeña estructura desempeña un papel crucial en la salud y la enfermedad del sistema nervioso central (SNC), es de suma importancia diseccionar adecuadamente el PC de los ventrículos cerebrales de una manera que permita el procesamiento posterior, que va desde el análisis funcional hasta el estructural. Aquí, se describe el aislamiento del PC del ratón del ventrículo lateral y del cuarto ventrículo cerebral sin la necesidad de herramientas o equipos especializados. Esta técnica de aislamiento preserva la viabilidad, función y estructura de las células dentro del PC. Debido a su alta vascularización, el PC se puede visualizar flotando dentro de las cavidades ventriculares del cerebro utilizando un microscopio binocular. Sin embargo, la perfusión transcárdica requerida para el análisis posterior puede complicar la identificación del tejido CP. Dependiendo de los pasos de procesamiento adicionales (por ejemplo, análisis de ARN y proteínas), esto se puede resolver visualizando el PC a través de la perfusión transcárdica con azul de bromofenol. Después del aislamiento, el PC se puede procesar utilizando varias técnicas, incluyendo ARN, proteína o análisis de células individuales, para obtener una mayor comprensión de la función de esta estructura cerebral especial. Aquí, la microscopía electrónica de barrido (SEM) en CP de montaje completo se utiliza para obtener una visión general de la estructura.

El protocolo descrito facilita el aislamiento eficiente de la PC de los ventrículos laterales del cerebro del ratón (Figura 2A-C) y cuarto (Figura 2D-F). Después de aislar todo el cerebro, se utilizan fórceps para hemisectar sagitalmente el cerebro e identificar los CP que flotan en los ventrículos laterales. La PC del cuarto ventrículo se puede aislar del lado cerebeloso del cerebro. La p...

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Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

El plexo coroideo (PC), un tejido poco estudiado en neurociencia, desempeña un papel clave en la salud y la enfermedad del sistema nervioso central. Este protocolo describe una técnica de microdisección para aislar el PC y el uso de microscopía electrónica de barrido para obtener una visión global de su estructura celular.

Microdisección y microscopía electrónica de barrido de montaje completo Visualización del plexo coroideo del ratón

The choroid plexus (CP), a highly vascularized structure protruding into the ventricles of the brain, is one of the most understudied tissues in ...

Para obtener una mejor comprensión de la composición y estructura del plexo coroideo, un método eficiente para aislar el plexo coroideo de los ventrículos cerebrales es un primer paso invaluable. Con esta técnica de microdisección es posible diseccionar el plexo coroideo fuera de los ventrículos cerebrales mientras se contiene su función, viabilidad y estructura sin contaminar el plexo coroideo con tejido circundante. Un obstáculo importante en el aislamiento del plexo coroideo es identificar la estructura, ya que todavía flota en los ventrículos cerebrales.La tinción del plexo coroideo con azul de bromofenol facilita el aislamiento. Demostrando el procedimiento estará Elien Van Wonterghem, nuestro gerente de laboratorio. Comience con la preparación de un anestésico terminal, una solución de perfusión transcárdica y una solución requerida para la microscopía electrónica de barrido, o SEM, y otras soluciones como se menciona en el texto.Para aislar el cerebro del ratón, coloque al animal anestesiado terminalmente en la posición de decúbito dorsal y fije al ratón fijando las extremidades en una placa. Desinfecte el tórax rociando etanol al 70% antes de hacer una incisión de aproximadamente cuatro centímetros justo debajo del diafragma con una cuchilla quirúrgica de acero al carbono. Abra la piel y exponga el pecho con tijeras quirúrgicas.Corte el diafragma completamente abierto y separe el tórax para exponer los pulmones y el corazón latiendo. Usando una bomba de perfusión transcárdicamente perfundir al ratón con 10 mililitros de la solución de perfusión a una velocidad de 4,5 mililitros por minuto. Inserte una aguja de calibre 26 en el ventrículo izquierdo para bombear la solución al circuito sistémico.Con tijeras quirúrgicas, corte la aurícula derecha para que la sangre salga de la circulación. Después de la decapitación del ratón cortar el cuero cabelludo haciendo una incisión que comienza entre las orejas hasta el superior a los ojos. Tire de la piel lateralmente para exponer el cráneo.Luego abra el cráneo siguiendo las suturas escamosas hacia la parte nasal. Una vez hecho esto, coloque el cerebro en una placa de Petri helada y agregue un mililitro de PBS helado al tejido cerebral. Para aislar el plexo coroideo que flota en el cuarto ventrículo, corte suavemente el cerebelo del cerebro con un bisturí.Extraer las partes restantes del tejido del tronco encefálico del cerebelo. Gire el cerebro de modo que la línea de corte esté orientada hacia arriba, asegurándose de que la cuarta cavidad del ventrículo sea visible en el centro de la sección con el plexo coroideo en el sitio dorsal. Si es necesario, abra el ventrículo tirando del tejido conectivo con pinzas afiladas.Arranca suavemente el plexo coroideo de la pared del ventrículo con pequeños fórceps afilados. Para aislar el plexo coroideo del ventrículo lateral, corte sagitalmente el cerebro en dos hemisferios usando pequeños fórceps afilados. Gire un hemisferio cerebral para que la línea de corte esté hacia arriba.Para revelar el ventrículo lateral tira suavemente de la corteza del tálamo. Retraiga el hipocampo hasta la línea de corte sagital medio. El ventrículo lateral ahora es visible con el plexo coroideo en la parte inferior del ventrículo.Si es necesario, abra un poco el ventrículo abriendo el tejido conectivo con pinzas afiladas. Use fórceps diminutas y afiladas para arrancar suavemente el plexo coroideo de la pared del ventrículo. Para realizar la preparación de la muestra para SEM, transfiera el plexo coroideo recién aislado a una solución de fijación recién hecha e incube durante la noche a cuatro grados centígrados.Una vez hecho esto, lave la muestra tres veces usando de tres a cinco mililitros de tampón de cacodilato de sodio molar 0.1 durante cinco minutos cada uno. Coloque las muestras en tres a cinco mililitros de tetróxido de osmio al 2% en tampón de cacodilato de sodio molar al 0,1 durante 30 minutos. Luego lave las muestras tres veces durante cinco minutos, cada una usando de tres a cinco mililitros de agua ultrapura.A continuación, deshidrate las muestras en una serie creciente de concentraciones de alcohol etílico helado con 15 minutos por solución de alcohol etílico. Utilice un secador de punto crítico para secar la muestra correctamente. Coloque la muestra cuidadosamente en un soporte de muestra con una etiqueta de carbono y visualice las muestras del plexo coroideo usando SEM.El presente protocolo facilitó el aislamiento eficiente del plexo coroideo del cerebro del ratón lateral y cuarto ventrículo. La perfusión con azul de bromofenol resultó en la visualización del plexo coroideo. Cuando el azul de bromofenol no se permitió en los pasos de procesamiento adicionales, se realizó la perfusión con PBS-heparina o ninguna perfusión para el procesamiento.El análisis morfológico SEM de la superficie del plexo coroideo epitelial, o CPE, muestra claramente la estructura de dos brazos del cuarto ventrículo y la forma típica en forma de C del plexo coroideo lateral aislado del ventrículo lateral. Un mayor aumento de SEM reveló estructuras similares a vesículas en el lado apical de las células CPE y las microvellosidades, lo que indica que las alteraciones morfológicas de las células CPE en condiciones de enfermedad pueden investigarse utilizando SEM. Es importante tocar y extraer solo el tejido del plexo coroideo para no contaminar la muestra con tejido circundante.Tenga las precauciones necesarias para preservar la estructura del plexo coroideo. Se puede aplicar una variedad de técnicas posteriores en el plexo coroideo aislado para investigar su estructura y función, desde el análisis microscópico hasta el análisis del transcriptoma y la citometría de flujo. La microdisección del plexo coroideo fuera del cerebro nos permite obtener una mejor comprensión de la estructura y función de este pequeño tejido cerebral.Este conocimiento es esencial para comprender mejor su papel en las enfermedades neurológicas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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