Name: microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus
Uploaded: 2022-12-16T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus at JoVE.com

Detta arbete stöddes av den belgiska stiftelsen för Alzheimerforskning (SAO; projektnummer: 20200032), Research Foundation Flanders (FWO Vlaanderen; projektnummer: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) och Baillet Latour Fund. Vi tackar VIB BioImaging Core för utbildning, support och tillgång till instrumentparken.

Alla djurförsök som beskrivs i denna studie utfördes enligt den nationella (belgisk lag 14/08/1986 och 22/12/2003, belgisk kunglig förordning 06/04/2010) och europeisk lagstiftning (EU-direktiv 2010/63 / EU, 86/609 / EEG). Alla experiment på möss och djurprotokoll godkändes av etikkommittén vid Gents universitet (tillståndsnummer LA1400091 och EG 2017-026).
1. Förberedelse
<ol><li>Narkosmedel: Förbered ett terminalbedövningsmedel. Till exempel kan en natriumpento...

<ol>
	<li>Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hidden+epithelial+barrier+in+the+brain+with+a+central+role+in+regulating+brain+homeostasis.+Implications+for+aging.">A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging.</a> Annals of the American Thoracic Society. 13, 407-410 (2016).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).</li><li>Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+central+nervous+system+inflammation.">Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation.</a> Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).</li><li>Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+movers+and+shapers+in+immune+privilege+of+the+CNS.">The movers and shapers in immune privilege of the CNS.</a> Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).</li><li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces:+a+role+for+connexins.">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins.</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li><li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules.">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).</li><li>Redzic, Z. B., Segal, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+choroid+plexus+and+the+physiology+of+the+choroid+plexus+epithelium.">The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).</li><li>Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+anatomy+and+functions+of+the+choroid+plexus+in+healthy+and+diseased+brain.">The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430 (2020).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+leukocyte+infiltration+at+the+choroid+plexus+in+(neuro)inflammatory+disorders.">Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders.</a> Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).</li><li>Brkic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;oligomers+disrupt+blood-CSF+barrier+integrity+by+activating+matrix+metalloproteinases.">Amyloid &#946;oligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases.</a> Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).</li><li>Vandenbroucke, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloprotease+8-dependent+extracellular+matrix+cleavage+at+the+blood-CSF+barrier+contributes+to+lethality+during+systemic+inflammatory+diseases.">Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases.</a> Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+response+to+a+repeated+peripheral+inflammatory+stimulus.">The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus.</a> BMC Neuroscience. 10, 135 (2009).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease:+dialogues+into+and+out+of+the+brain.">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li><li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system.">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li><li>Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balanced+view+of+choroid+plexus+structure+and+function:+Focus+on+adult+humans.">A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans.</a> Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).</li><li>Lehtinen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+and+cerebrospinal+fluid:+emerging+roles+in+development,+disease,+and+therapy.">The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy.</a> Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).</li><li>Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+Alzheimer's+disease:+more+than+just+a+barrier.">The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier.</a> Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+implications+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+neuropsychiatric+disorders.">Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).</li><li>Simon, M. J., Iliff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebrospinal+fluid+(CSF)+flow+in+neurodegenerative,+neurovascular+and+neuroinflammatory+disease.">Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).</li><li>Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+role+for+CSF+turnover+and+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+late+onset+Alzheimer's+disease.">A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+iron+metabolism+is+part+of+the+choroid+plexus+response+to+peripheral+inflammation.">Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation.</a> Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).</li><li>Thouvenot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteomic+analysis+of+mouse+choroid+plexus+secretome+reveals+a+high+protein+secretion+capacity+of+choroidal+epithelial+cells.">The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells.</a> Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).</li><li>Vandendriessche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+extracellular+vesicle+secretion+at+the+blood-cerebrospinal+fluid+interface+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143 (2021).</li><li>Bowyer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+description+of+the+dissection+of+the+cerebral+surface+vasculature+and+associated+meninges+and+the+choroid+plexus+from+rat+brain.">A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4285 (2012).</li><li>Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+the+ciliary+movement+of+choroid+plexus+epithelial+cells+ex+vivo.">Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52991 (2015).</li><li>Dani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+and+spatial+map+of+the+choroid+plexus+across+brain+ventricles+and+ages.">A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages.</a> Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).</li><li>Carloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+choroid+plexus+vascular+barrier+closing+during+intestinal+inflammation.">Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation.</a> Science. 374 (6566), 439-448 (2021).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+Niemann-Pick+disease+type.">Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type.</a> C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482 (2021).</li><li>Shipley, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+calcium+dynamics+and+immune+surveillance+at+the+choroid+plexus+blood-cerebrospinal+fluid+interface.">Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface.</a> Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).</li><li>Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+studies+using+serial+block+face+and+focused+ion+beam+scan+electron+microscopy.">Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e59480 (2019).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+(SEM).">Scanning Electron Microscopy (SEM).</a> JoVE Science Education Database. , (2022).</li><li>Pauwels, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus+derived+extracelular+vesicles+exhibit+brain+targeting+characteristics).">Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics).</a> Biomaterials. 290, 121830 (2022).</li></ol>

Här beskrivs en metod för att isolera plexus choroid plexus (CP) ur laterala ventrikeln och den fjärde ventrikeln i en mushjärna. Hela denna monteringsmetod för CP underlättar ytterligare analys med hjälp av en repertoar av tekniker för att få en fullständig bild av CP-morfologin, cellulär sammansättning, transkriptom, proteom och sekretom. Sådana analyser är avgörande för att få en bättre förståelse för denna anmärkningsvärda struktur som sticker ut från hjärnans ventriklar. Denna kunskap är av...

Täta barriärer skiljer centrala nervsystemet (CNS) från periferin, inklusive blod-hjärnbarriären (BBB) och blod-cerebrospinalvätskebarriären (CSF). Dessa barriärer skyddar CNS mot yttre förolämpningar och säkerställer en balanserad och kontrollerad mikromiljö 1,2,3. Medan BBB har studerats omfattande över tiden har blod-CSF-barriären vid choroid plexus (CP) bara fått ökat forskningsintresse under det senaste decenniet. Denna senare barriär finns i hjärnans fyra ventriklar (figur 1A, B) och kännetecknas av ett enda lager av choroid plexus epitelceller (CPE) som omger ett centralt stroma, läckande kapillärer, fibroblaster och en lymfoid och myeloisk cellpopulation (figur 1C)4,5,6. CPE-cellerna är fast sammankopplade med snäva korsningar, vilket förhindrar läckage från de underliggande fenestrerade blodkapillärerna till CSF och hjärnan. Dessutom regleras transporten över CPE-cellerna av ett antal inåtgående och utgående transportsystem som hanterar inflödet av fördelaktiga föreningar (t.ex. näringsämnen och hormoner) från blodet till CSF och utflödet av skadliga molekyler (t.ex. metaboliskt avfall, överskott av neurotransmittorer) i andra riktningen 1,6. För att kunna utöva sin aktiva transportfunktion innehåller CPE-cellerna många mitokondrier i sin cytoplasma7. Dessutom är CP den viktigaste källan till CSF och fungerar som hjärnans portvakt genom närvaron av bosatta inflammatoriska celler1. På grund av sitt unika läge mellan blodet och hjärnan är CP också perfekt positionerat för att utföra immunövervakning8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig01.jpg"> Figur 1: Schematisk översikt över placeringen och sammansättningen av choroid plexus (CP). (A,B) CP-vävnad finns i de två laterala, tredje och fjärde ventriklarna hos (A) mänskliga och (B) mushjärnor. (C) CP-vävnaden består av ett enda lager av tätt anslutna kuboidala CP-epitelceller (CPE) som omger fenestrerade kapillärer, lös bindväv och lymfoida och myeloida celler och bildar blod-cerebrospinalvätskebarriären (anpassad och modifierad från referens23). Figur skapad med Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Under det senaste decenniet har ökande bevis, inklusive flera rapporter från vår forskargrupp, visat att CP spelar en central roll i hälsa och sjukdom 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Det är till exempel känt att den åldrande blod-CSF-barriären uppvisar morfologiska förändringar i bland annat kärnorna, mikrovillierna och basalmembranet 1,19. Dessutom, i samband med Alzheimers sjukdom, äventyras den övergripande barriärintegriteten och alla dessa åldersrelaterade förändringar verkar vara ännu mer uttalade 1,8,20. Förutom morfologiska förändringar förändras transkriptomet, proteomet och sekretomet i CP under sjukdom 12,21,22,23. Således är avancerad kunskap om CP avgörande för att bättre förstå dess roll i neurologiska sjukdomar och potentiellt utveckla nya terapeutiska strategier.
En effektiv metod för exakt mikrodissektion av CP ur hjärnkamrarna är det första ovärderliga steget för att möjliggöra korrekt undersökning av denna lilla hjärnstruktur. På grund av sin mycket vaskulariserade natur (figur 2B) kan CP som flyter inuti hjärnans ventrikulära hålrum identifieras med hjälp av ett binokulärt mikroskop. Transkardiell perfusion krävs emellertid ofta för nedströmsanalys, vilket komplicerar korrekt identifiering och isolering av CP-vävnaden (figur 2C). Om de ytterligare bearbetningsstegen tillåter (t.ex. vid RNA- och proteinanalys) kan CP visualiseras via transkardiell perfusion med bromfenolblått (figur 2A). Flera publikationer beskriver redan isoleringen av CP från råtta24 och musvalphjärnor25. Här beskrivs en isoleringsteknik för mikrodissektion för att isolera CP från vuxna möss. Det är viktigt att denna isoleringsteknik bevarar livskraften, funktionen och strukturen hos cellerna i CP. Isoleringen av CP som flyter i fjärde och laterala ventriklarna beskrivs här. Kort sagt, mössen är terminalt bedövade och vid behov transcardially perfuserade. Det bör dock noteras att perfusion kan skada cellernas struktur inom CP. Om provet ska analyseras med transmissionselektronmikroskopi (TEM), seriell blockytsvepelektronmikroskopi (SBF-SEM) eller fokuserad jonstråle SEM (FIB-SEM), bör perfusion därför inte utföras. Därefter isoleras hela hjärnan, och pincett används för att sagittalt hemisect hjärnan. Härifrån kan CP som flyter i laterala ventriklarna identifieras och dissekeras, medan CP från den fjärde ventrikeln kan isoleras från hjärnans cerebellära sida.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig02.jpg"> Figur 2: Visualisering av (A-C) fjärde och (D-F) laterala ventrikeln choroid plexus (CP) efter (A,D) bromfenolblå perfusion, (B,E) ingen perfusion och (C,F) perfusion med PBS/heparin. Bilderna är tagna med ett stereomikroskop (8x-32x förstoring). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
När CP är korrekt dissekerad ur hjärnkamrarna kan en hel repertoar av tekniker tillämpas för att få ytterligare förståelse för funktionen av denna struktur. Till exempel kan flödescytometri eller encells-RNA-sekvensering utföras för att kvantifiera och fenotypiskt analysera de infiltrerande inflammatoriska cellerna under vissa sjukdomstillstånd26,27. Förutom den cellulära sammansättningen kan CP: s molekylära sammansättning analyseras för att bedöma närvaron av cytokiner och kemokiner via enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA), immunoblot eller genom samtidig analys av flera cytokiner med användning av cytokinpärlmatrisen28. Dessutom kan transkriptom-, kärl-, immuncellshistologi- och sekretomanalyser utföras på de mikrodissekerade CP-explanterna29. Här används svepelektronmikroskopi (SEM) på helmonterad CP för att få en helhetsbild av CP-strukturen. SEM använder en stråle av fokuserade elektroner för att skanna över ytan och skapa en bild av ytans topografi och sammansättning. Eftersom elektronernas våglängd är mycket mindre än ljusets är upplösningen av SEM i nanometerområdet och överlägsen den för ett ljusmikroskop. Följaktligen kan morfologiska studier på subcellulär nivå utföras via SEM. Kortfattat överförs den dissekerade CP omedelbart till ett glutaraldehydinnehållande fixeringsmedel för en fixering över natten, följt av osmication och uranylacetatfärgning. Proverna behandlas sedan med blyaspartatfläck, dehydreras och slutligen inbäddas för avbildning.
Således underlättar detta protokoll effektiv isolering av CP från mushjärnventriklarna, vilket kan analyseras ytterligare med hjälp av en mängd olika nedströmstekniker för att undersöka dess struktur och funktion.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G x 1/2 needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium specimen mounts</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel surgial blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0210</td>
			<td>size: 0.45 mm x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon adhesive tabs -12 mm</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>77825-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer&#160;</td>
			<td>Bal-Tec&#160;</td>
			<td>CPD030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossbeam 540</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SEM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel</td>
			<td>Metrohm Belgium N.V</td>
			<td>CPA-7800160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide&#160;</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#160;</td>
			<td>Quorum&#160;</td>
			<td>Q150T ES</td>
			<td>PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kela NV</td>
			<td>514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Basket Stainless Steel</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>70190-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi DV4 Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus

Choroid plexus (CP), en mycket vaskulariserad struktur som sticker ut i hjärnans ventriklar, är en av de mest understuderade vävnaderna inom neurovetenskap. Eftersom det blir allt tydligare att denna lilla struktur spelar en avgörande roll för hälsa och sjukdom i centrala nervsystemet (CNS), är det av yttersta vikt att korrekt dissekera CP ur hjärnkamrarna på ett sätt som möjliggör nedströms bearbetning, allt från funktionell till strukturell analys. Här beskrivs isolering av den laterala och fjärde hjärnventrikelmusen CP utan behov av specialverktyg eller utrustning. Denna isoleringsteknik bevarar livskraften, funktionen och strukturen hos celler inom CP. På grund av sin höga vaskularisering kan CP visualiseras flytande inuti hjärnans ventrikulära hålrum med hjälp av ett binokulärt mikroskop. Transkardiell perfusion som krävs för nedströmsanalys kan dock komplicera identifieringen av CP-vävnaden. Beroende på de ytterligare bearbetningsstegen (t.ex. RNA- och proteinanalys) kan detta lösas genom att visualisera CP via transkardiell perfusion med bromfenolblått. Efter isolering kan CP bearbetas med hjälp av flera tekniker, inklusive RNA, protein eller encellsanalys, för att få ytterligare förståelse för funktionen hos denna speciella hjärnstruktur. Här används svepelektronmikroskopi (SEM) på helmonterad CP för att få en helhetsbild av strukturen.

Det beskrivna protokollet underlättar effektiv isolering av CP från mushjärnans laterala (figur 2A-C) och fjärde (figur 2D-F) ventriklar. Efter att ha isolerat hela hjärnan används pincett för att sagittalt hemisect hjärnan och identifiera CP: erna som flyter i laterala ventriklarna. CP från den fjärde ventrikeln kan isoleras från hjärnans lillhjärna. Perfusion med bromfenolblått k...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus at JoVE.com

Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

Choroid plexus (CP), en understuderad vävnad inom neurovetenskap, spelar en nyckelroll i hälsa och sjukdom i centrala nervsystemet. Detta protokoll beskriver en mikrodissektionsteknik för att isolera CP och användningen av svepelektronmikroskopi för att få en övergripande bild av dess cellulära struktur.

Mikrodissektion och helmonterad svepelektronmikroskopi Visualisering av musplexus

The choroid plexus (CP), a highly vascularized structure protruding into the ventricles of the brain, is one of the most understudied tissues in ...

För att få en bättre inblick i sammansättningen och strukturen hos plexus choroid är en effektiv metod för att isolera plexus choroid ur hjärnkamrarna ett första ovärderligt steg. Med denna mikrodissektionsteknik är det möjligt att dissekera choroid plexus ur hjärnventriklarna samtidigt som den innehåller dess funktion, livskraft och struktur utan att förorena choroid plexus med omgivande vävnad. Ett betydande hinder i choroid plexus isolering är att identifiera strukturen som den fortfarande flyter i hjärnventriklarna.Färgning av choroid plexus med bromfenolblått underlättar isoleringen. Demonstrerar proceduren kommer att vara Elien Van Wonterghem, vår laboratoriechef. Börja med att förbereda en terminal bedövningsmedel, transkardiell perfusionslösning och en lösning som krävs för svepelektronmikroskopi, eller SEM, och andra lösningar som nämns i texten.För att isolera mushjärnan placerar du det terminalt bedövade djuret i dorsal decubitus-position och fixerar musen genom att fästa lemmarna på en tallrik. Desinficera bröstet genom att spraya 70% etanol innan du gör ett snitt på cirka fyra centimeter strax under membranet med ett kirurgiskt blad av kolstål. Öppna huden och exponera bröstet med kirurgisk sax.Skär membranet helt öppet och separera bröstkorgen för att exponera lungorna och det slående hjärtat. Använd en perfusionspump transkardiolt perfusera musen med 10 ml perfusionslösning med en hastighet av 4,5 ml per minut. Sätt in en 26-gauge nål i vänster kammare för att pumpa lösningen i systemkretsen.Använd kirurgisk sax, skär det högra atriumet för att blodet ska komma ur cirkulationen. Efter halshuggning av musen skär upp hårbotten genom att göra ett snitt som börjar mellan öronen till överlägsen ögonen. Dra huden i sidled för att exponera skallen.Skär sedan upp skallen genom att följa squamosal suturer mot näsdelen. När du är klar, placera hjärnan i en iskall petriskål och tillsätt en milliliter iskall PBS till hjärnvävnaden. För att isolera choroid plexus som flyter i den fjärde ventrikeln, skär försiktigt av cerebellum från storhjärnan med en skalpell.Ta bort de återstående hjärnstamsvävnadsdelarna från lillhjärnan. Rotera hjärnan så att skärlinjen är vänd uppåt, se till att den fjärde ventrikelhålan är synlig i mitten av sektionen med choroid plexus som ligger vid dorsalplatsen. Öppna vid behov ventrikeln genom att dra bindväven med skarpa pincett.Riv försiktigt choroid plexus ur ventrikelväggen med små vassa pincett. För att isolera choroid plexus från laterala ventrikeln, skär sagittalt hjärnan i två halvklot med små skarpa pincett. Rotera en hjärnhalva så att skärlinjen är uppåt.För att avslöja sidoventrikeln, dra försiktigt bort cortex från thalamus. Dra tillbaka hippocampus till mitten av sagittal skärlinje. Den laterala ventrikeln är nu synlig med choroid plexus som ligger längst ner i ventrikeln.Om nödvändigt, öppna ventrikeln lite genom att dra upp bindväven med skarpa pincett. Använd små vassa pincett för att försiktigt riva choroid plexus ur ventrikelväggen. För att utföra provberedningen för SEM, överför den nyligen isolerade choroid plexus till nygjord fixeringslösning och inkubera över natten vid fyra grader Celsius.När du är klar, tvätta provet tre gånger med tre till fem milliliter 0,1 molar natriumkakodylatbuffert i fem minuter vardera. Postfixera proverna i tre till fem milliliter 2% osmiumtetroxid i 0,1 molär natriumkadodylatbuffert i 30 minuter. Tvätta sedan proverna tre gånger i fem minuter vardera med tre till fem milliliter ultrarent vatten.Därefter dehydrera proverna i en ökande serie iskalla etylalkoholkoncentrationer med 15 minuter per etylalkohollösning. Använd en kritisk punkttork för att torka provet ordentligt. Placera provet försiktigt på ett provfäste med en kolklistermärke och visualisera plexusproverna med choroid plexusprover med SEM.Det nuvarande protokollet underlättade effektiv isolering av choroid plexus från mushjärnans laterala och fjärde ventriklerna. Perfusion med bromfenolblått resulterade i visualisering av choroid plexus. När bromfenolblått inte tilläts i de vidare bearbetningsstegen utfördes perfusion med PBS-heparin eller ingen perfusion för bearbetning.SEM-morfologisk analys av ytan av choroid plexus epiteliala eller CPE-celler visar tydligt den fjärde ventrikelns tvåarmstruktur och den typiska C-formade formen av lateral choroid plexus isolerad från laterala ventrikeln. En högre SEM-förstoring avslöjade vesikelliknande strukturer på den apikala sidan av CPE-celler och mikrovilli, vilket indikerar att morfologiska förändringar av CPE-cellerna vid sjukdomstillstånd kan undersökas med SEM. Det är viktigt att bara röra och ta ut choroid plexusvävnaden för att inte förorena provet med omgivande vävnad.Var försiktig för att bevara strukturen hos choroid plexus. En mängd olika nedströmstekniker kan tillämpas på den isolerade choroid plexus för att undersöka dess struktur och funktion, från mikroskopanalys över transkriptomanalys till flödescytometri. Mikrodissekering av choroid plexus ur hjärnan gör att vi kan få en bättre inblick i strukturen och funktionen hos denna lilla hjärnvävnad.Denna kunskap är avgörande för att bättre förstå dess roll i neurologiska sjukdomar.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualisering av embryonala nervsystemet i hela-fäste Drosophila Embryon

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissekering av en mus Eye för en hel berget av pigmentepitelet

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Fokuserad jonstråle Fräsning och Svepelektronmikroskopi av hjärnvävnad

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Reproducerbar Mouse ischiasnerv krossa och påföljande bedömningen av Regeneration av Whole Mount Muscle Analys

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

En visuell beskrivning av dissektion av cerebral Surface kärlsystemet och associerade hjärnhinnor och koroidea Plexus från råtthjärna

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Hela Mount immunfluorescensfärgning av neonatal mus Retina att undersöka Angiogenesis<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Hela-mount avbildning av Mouse Embryo Sensorisk Axon Projektioner

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Observation av ciliarrörelse av plexus chorioideus epitelceller<em&gt; Ex vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Hela Mount Dissekering och Immunofluorescence i vuxen mus Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Analys av Brain Mitokondrier Använda Serial Block-Face Svepelektronmikroskopi

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...