Name: microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus
Uploaded: 2022-12-16T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus at JoVE.com

Bu çalışma Belçika Alzheimer Araştırma Vakfı (SAO; proje numarası: 20200032), Flanders Araştırma Vakfı (FWO Vlaanderen; proje numaraları: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) ve Baillet Latour Fonu tarafından desteklenmiştir. VIB BioImaging Core'a eğitim, destek ve enstrüman parkına erişim için teşekkür ederiz.

Bu çalışmada açıklanan tüm hayvan deneyleri ulusal (Belçika Kanunu 14/08/1986 ve 22/12/2003, Belçika Kraliyet Kararnamesi 06/04/2010) ve Avrupa mevzuatına (AB Direktifleri 2010/63/EU, 86/609/EEC) göre gerçekleştirilmiştir. Fareler ve hayvan protokolleri üzerindeki tüm deneyler Ghent Üniversitesi etik komitesi tarafından onaylanmıştır (izin numaraları LA1400091 ve EC 2017-026).
1. Hazırlık
<ol><li>Anestezikler: Bir terminal anestezi hazırlayın. Örne?...

<ol>
	<li>Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hidden+epithelial+barrier+in+the+brain+with+a+central+role+in+regulating+brain+homeostasis.+Implications+for+aging.">A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging.</a> Annals of the American Thoracic Society. 13, 407-410 (2016).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).</li><li>Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+central+nervous+system+inflammation.">Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation.</a> Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).</li><li>Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+movers+and+shapers+in+immune+privilege+of+the+CNS.">The movers and shapers in immune privilege of the CNS.</a> Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).</li><li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces:+a+role+for+connexins.">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins.</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li><li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules.">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).</li><li>Redzic, Z. B., Segal, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+choroid+plexus+and+the+physiology+of+the+choroid+plexus+epithelium.">The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).</li><li>Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+anatomy+and+functions+of+the+choroid+plexus+in+healthy+and+diseased+brain.">The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430 (2020).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+leukocyte+infiltration+at+the+choroid+plexus+in+(neuro)inflammatory+disorders.">Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders.</a> Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).</li><li>Brkic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;oligomers+disrupt+blood-CSF+barrier+integrity+by+activating+matrix+metalloproteinases.">Amyloid &#946;oligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases.</a> Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).</li><li>Vandenbroucke, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloprotease+8-dependent+extracellular+matrix+cleavage+at+the+blood-CSF+barrier+contributes+to+lethality+during+systemic+inflammatory+diseases.">Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases.</a> Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+response+to+a+repeated+peripheral+inflammatory+stimulus.">The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus.</a> BMC Neuroscience. 10, 135 (2009).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease:+dialogues+into+and+out+of+the+brain.">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li><li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system.">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li><li>Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balanced+view+of+choroid+plexus+structure+and+function:+Focus+on+adult+humans.">A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans.</a> Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).</li><li>Lehtinen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus+and+cerebrospinal+fluid:+emerging+roles+in+development,+disease,+and+therapy.">The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy.</a> Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).</li><li>Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+Alzheimer's+disease:+more+than+just+a+barrier.">The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier.</a> Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).</li><li>Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+implications+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+interface+in+neuropsychiatric+disorders.">Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).</li><li>Simon, M. J., Iliff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebrospinal+fluid+(CSF)+flow+in+neurodegenerative,+neurovascular+and+neuroinflammatory+disease.">Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).</li><li>Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+role+for+CSF+turnover+and+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+late+onset+Alzheimer's+disease.">A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).</li><li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+iron+metabolism+is+part+of+the+choroid+plexus+response+to+peripheral+inflammation.">Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation.</a> Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).</li><li>Thouvenot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteomic+analysis+of+mouse+choroid+plexus+secretome+reveals+a+high+protein+secretion+capacity+of+choroidal+epithelial+cells.">The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells.</a> Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).</li><li>Vandendriessche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+extracellular+vesicle+secretion+at+the+blood-cerebrospinal+fluid+interface+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143 (2021).</li><li>Bowyer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+description+of+the+dissection+of+the+cerebral+surface+vasculature+and+associated+meninges+and+the+choroid+plexus+from+rat+brain.">A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4285 (2012).</li><li>Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+the+ciliary+movement+of+choroid+plexus+epithelial+cells+ex+vivo.">Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52991 (2015).</li><li>Dani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+and+spatial+map+of+the+choroid+plexus+across+brain+ventricles+and+ages.">A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages.</a> Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).</li><li>Carloni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+choroid+plexus+vascular+barrier+closing+during+intestinal+inflammation.">Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation.</a> Science. 374 (6566), 439-448 (2021).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+choroid+plexus+in+the+pathogenesis+of+Niemann-Pick+disease+type.">Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type.</a> C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482 (2021).</li><li>Shipley, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+calcium+dynamics+and+immune+surveillance+at+the+choroid+plexus+blood-cerebrospinal+fluid+interface.">Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface.</a> Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).</li><li>Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+studies+using+serial+block+face+and+focused+ion+beam+scan+electron+microscopy.">Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e59480 (2019).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+(SEM).">Scanning Electron Microscopy (SEM).</a> JoVE Science Education Database. , (2022).</li><li>Pauwels, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+plexus+derived+extracelular+vesicles+exhibit+brain+targeting+characteristics).">Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics).</a> Biomaterials. 290, 121830 (2022).</li></ol>

Burada, koroid pleksusun (SP) lateral ventrikülden ve bir fare beyninin dördüncü ventrikülünden izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. SP'nin tüm bu montaj yöntemi, CP morfolojisinin, hücresel kompozisyonun, transkriptomun, proteomun ve sekretomun tam bir görünümünü elde etmek için bir teknik repertuarı kullanarak daha fazla analizi kolaylaştırır. Bu tür analizler, beynin ventriküllerinden çıkıntı yapan bu olağanüstü yapıyı daha iyi anlamak için çok önemlidir. Bu bilgi, SP'n...

Sıkı bariyerler, merkezi sinir sistemini (CNS), kan-beyin bariyeri (BBB) ve kan-beyin omurilik sıvısı (BOS) bariyeri dahil olmak üzere çevreden ayırır. Bu engeller CNS'yi dış hakaretlere karşı korur ve dengeli ve kontrollü bir mikro çevre sağlar 1,2,3. BBB zaman içinde kapsamlı bir şekilde çalışılmış olsa da, koroid pleksusta (SP) bulunan kan-BOS bariyeri sadece son on yılda artan araştırma ilgisi kazanmıştır. Bu son bariyer beynin dört ventrikülünde bulunabilir (Şekil 1A, B) ve merkezi bir stroma, sızdıran kılcal damarlar, fibroblastlar ve bir lenfoid ve miyeloid hücre popülasyonunu çevreleyen tek bir koroid pleksus epitel (CPE) hücresi tabakası ile karakterizedir (Şekil 1C)4,5,6. CPE hücreleri sıkı bağlantılarla sıkıca birbirine bağlanır, böylece altta yatan federe kan kılcal damarlarından BOS ve beyne sızıntıyı önler. Ek olarak, CPE hücreleri boyunca taşıma, yararlı bileşiklerin (örneğin, besinler ve hormonlar) kandan BOS'a akışını ve zararlı moleküllerin (örneğin, metabolik atıklar, aşırı nörotransmiterler) diğer yöndeki efflüksünü yöneten bir dizi içe ve dışa taşıma sistemi tarafından düzenlenir 1,6. Aktif taşıma fonksiyonlarını yerine getirebilmek için, CPE hücreleri sitoplazmalarında çok sayıda mitokondri içerir7. Dahası, SP BOS'un ana kaynağıdır ve yerleşik enflamatuar hücrelerin varlığı ile beynin bekçisi olarak işlev görür1. Kan ve beyin arasındaki eşsiz konumu nedeniyle, SP ayrıca bağışıklık gözetimini gerçekleştirmek için mükemmel bir konuma sahiptir8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig01.jpg"> Şekil 1: Koroid pleksusun (SP) yeri ve bileşimine şematik genel bakış . (A,B) CP dokusu, (A) insan ve (B) fare beyinlerinin iki lateral, üçüncü ve dördüncü ventriküllerinde bulunur. (C) SP dokusu, fenestrated kılcal damarları, gevşek bağ dokusunu ve lenfoid ve miyeloid hücreleri çevreleyen sıkıca bağlanmış küboidal CP epitel (CPE) hücrelerinin tek bir katmanından oluşur ve kan-beyin omurilik sıvısı bariyerini oluşturur (referans23'ten uyarlanmış ve modifiye edilmiştir). Şekil Biorender.com ile oluşturulmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Son on yılda, araştırma grubumuzdan birkaç rapor da dahil olmak üzere artan kanıtlar, SP'nin sağlık ve hastalıkta merkezi bir rol oynadığını ortaya koymuştur 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Örneğin, yaşlanan kan-BOS bariyerinin, diğerlerinin yanı sıra, çekirdeklerde, mikrovilluslarda ve bazal membranda morfolojik değişiklikler gösterdiği bilinmektedir 1,19. Ek olarak, Alzheimer hastalığı bağlamında, genel bariyer bütünlüğü tehlikeye girer ve yaşa bağlı tüm bu değişikliklerin daha da belirgin olduğu görülmektedir 1,8,20. Morfolojik değişikliklere ek olarak, SP'nin transkriptom, proteom ve sekretomu hastalık 12,21,22,23 sırasında değişir. Bu nedenle, SP'nin nörolojik hastalıklardaki rolünü daha iyi anlamak ve potansiyel olarak yeni terapötik stratejiler geliştirmek için SP'nin ileri düzeyde bilgisi gereklidir.
SP'nin beyin ventriküllerinden doğru mikrodiseksiyonu için etkili bir yöntem, bu küçük beyin yapısının düzgün bir şekilde araştırılmasına izin veren ilk paha biçilmez adımdır. Yüksek vaskülarize doğası nedeniyle (Şekil 2B), beynin ventrikül boşluklarında yüzen SP, bir binoküler mikroskop kullanılarak tanımlanabilir. Bununla birlikte, aşağı akış analizi için sıklıkla transkardiyal perfüzyon gereklidir, bu da SP dokusunun doğru tanımlanmasını ve izolasyonunu zorlaştırır (Şekil 2C). Daha sonraki işlem adımları izin veriyorsa (örneğin, RNA ve protein analizi durumunda), SP, bromofenol mavisi ile transkardiyal perfüzyon yoluyla görselleştirilebilir (Şekil 2A). Birkaç yayın, SP'nin sıçan24 ve fare yavrusu beyinlerinden25'ten izole edildiğini zaten tanımlamaktadır. Burada, SP'yi yetişkin farelerden izole etmek için bir mikrodiseksiyon izolasyon tekniği tanımlanmıştır. Önemli olarak, bu izolasyon tekniği SP içindeki hücrelerin canlılığını, işlevini ve yapısını korur. Dördüncü ve lateral ventriküllerde yüzen SP'nin izolasyonu burada açıklanmaktadır. Kısacası, fareler terminal anestezi altına alınır ve gerekirse transkardiyal olarak perfüze edilir. Bununla birlikte, perfüzyonun SP içindeki hücrelerin yapısına zarar verebileceği unutulmamalıdır. Sonuç olarak, numune transmisyon elektron mikroskobu (TEM), seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBF-SEM) veya odaklanmış iyon ışını SEM (FIB-SEM) kullanılarak analiz edilecekse, perfüzyon yapılmamalıdır. Daha sonra, tüm beyin izole edilir ve forsepsler beyni sagittal olarak hemiseke etmek için kullanılır. Buradan, lateral ventriküllerde yüzen SP'ler tanımlanabilir ve diseke edilebilirken, dördüncü ventrikülden gelen SP beynin serebellar tarafından izole edilebilir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64733/64733fig02.jpg"> Şekil 2: (A-D) bromofenol mavi perfüzyonundan sonra (A-K) dördüncü ve (D-F) lateral ventrikül koroid pleksusunun (SP) görüntülenmesi, (B,E) perfüzyon olmaması ve (C,F) perfüzyonunun PBS/heparin ile görüntülenmesi. Görüntüler stereo mikroskopla (8x-32x büyütme) alınır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64733/64733fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
SP beyin ventriküllerinden düzgün bir şekilde diseke edildikten sonra, bu yapının işlevi hakkında daha fazla bilgi edinmek için bütün bir teknik repertuarı uygulanabilir. Örneğin, akış sitometrisi veya tek hücreli RNA dizilimi, belirli hastalık koşulları altında sızan enflamatuar hücreleri ölçmek ve fenotipik olarak analiz etmek için yapılabilir26,27. Hücresel bileşime ek olarak, SP'nin moleküler bileşimi, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA), immünoblot yoluyla veya sitokin boncuk dizisi28 kullanılarak çoklu sitokinlerin eşzamanlı analizi yoluyla sitokinlerin ve kemokinlerin varlığını değerlendirmek için analiz edilebilir. Ayrıca mikrodiseke SP eksplantları29 üzerinde transkriptom, vasküler, immün hücre histolojisi ve sekretom analizleri yapılabilmektedir. Burada, CP yapısının genel bir görünümünü elde etmek için tüm montaj CP'sinde taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılır. SEM, yüzeyi taramak ve yüzeyin topografyasının ve kompozisyonunun bir görüntüsünü oluşturmak için odaklanmış elektronlardan oluşan bir ışın kullanır. Elektronların dalga boyu ışığınkinden çok daha küçük olduğundan, SEM'in çözünürlüğü nanometre aralığındadır ve bir ışık mikroskobunkinden daha üstündür. Sonuç olarak, hücre altı seviyedeki morfolojik çalışmalar SEM aracılığıyla yapılabilir. kısaca, diseke edilen SP derhal bir gece fiksasyonu için glutaraldehit içeren bir fiksatife aktarılır, ardından osmikasyon ve uranil asetat boyanması yapılır. Numuneler daha sonra kurşun aspartat lekesi ile muamele edilir, dehidre edilir ve nihayetinde görüntüleme için gömülür.
Böylece, bu protokol, SP'nin fare beyin ventriküllerinden verimli bir şekilde izole edilmesini kolaylaştırır; bu, yapısını ve işlevini araştırmak için çeşitli aşağı akış teknikleri kullanılarak daha fazla analiz edilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G x 1/2 needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium specimen mounts</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>75220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel surgial blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0210</td>
			<td>size: 0.45 mm x 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon adhesive tabs -12 mm</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>77825-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer&#160;</td>
			<td>Bal-Tec&#160;</td>
			<td>CPD030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossbeam 540</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SEM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel</td>
			<td>Metrohm Belgium N.V</td>
			<td>CPA-7800160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide&#160;</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#160;</td>
			<td>Quorum&#160;</td>
			<td>Q150T ES</td>
			<td>PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kela NV</td>
			<td>514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Basket Stainless Steel</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>70190-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi DV4 Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection and whole mount scanning electron microscopy visualization of mouse choroid plexus

Beynin ventriküllerine çıkıntı yapan oldukça vaskülarize bir yapı olan koroid pleksus (SP), nörobilimde en az çalışılan dokulardan biridir. Bu küçük yapının merkezi sinir sisteminin (CNS) sağlığı ve hastalığında çok önemli bir rol oynadığı giderek daha açık hale geldiğinden, SP'nin beyin ventriküllerinden düzgün bir şekilde diseke edilmesi, fonksiyonel analizden yapısal analize kadar aşağı akış işlemeye izin verecek şekilde son derece önemlidir. Burada, lateral ve dördüncü beyin ventrikül faresi CP'nin özel alet veya ekipmanlara ihtiyaç duymadan izolasyonu açıklanmaktadır. Bu izolasyon tekniği, SP içindeki hücrelerin canlılığını, işlevini ve yapısını korur. Yüksek vaskülarizasyonu nedeniyle, SP bir binoküler mikroskop kullanılarak beynin ventrikül boşlukları içinde yüzerken görselleştirilebilir. Bununla birlikte, aşağı akış analizi için gerekli olan transkardiyal perfüzyon, SP dokusunun tanımlanmasını zorlaştırabilir. Daha sonraki işleme adımlarına (örneğin, RNA ve protein analizi) bağlı olarak, bu, SP'yi bromofenol mavisi ile transkardiyal perfüzyon yoluyla görselleştirerek çözülebilir. İzolasyondan sonra, SP, bu özel beyin yapısının işlevi hakkında daha fazla bilgi edinmek için RNA, protein veya tek hücre analizi de dahil olmak üzere çeşitli teknikler kullanılarak işlenebilir. Burada, yapının genel bir görünümünü elde etmek için tüm montaj CP'sindeki taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılır.

Tarif edilen protokol, SP'nin fare beyni lateral (Şekil 2A-C) ve dördüncü (Şekil 2D-F) ventriküllerinden etkili bir şekilde izole edilmesini kolaylaştırır. Tüm beyni izole ettikten sonra, forsepsler beyni sagittal olarak hemiseke etmek ve lateral ventriküllerde yüzen CP'leri tanımlamak için kullanılır. Dördüncü ventrikülden SP, beynin serebellar tarafından izole edilebilir....

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus at JoVE.com

Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

Nörobilimde az çalışılmış bir doku olan koroid pleksus (SP), merkezi sinir sisteminin sağlığında ve hastalığında önemli bir rol oynar. Bu protokol, SP'yi izole etmek için bir mikrodiseksiyon tekniğini ve hücresel yapısının genel bir görünümünü elde etmek için taramalı elektron mikroskobunun kullanımını açıklar.

Fare Koroid Pleksusunun Mikrodiseksiyonu ve Tüm Montajlı Taramalı Elektron Mikroskobu Görselleştirmesi

The choroid plexus (CP), a highly vascularized structure protruding into the ventricles of the brain, is one of the most understudied tissues in ...

Koroid pleksusun bileşimi ve yapısı hakkında daha iyi bir fikir edinmek için, koroid pleksusu beyin ventriküllerinden izole etmek için etkili bir yöntem ilk paha biçilmez bir adımdır. Bu mikrodiseksiyon tekniği ile koroid pleksusu beyin ventriküllerinden dışarı çıkarırken, koroid pleksusu çevreleyen doku ile kirletmeden fonksiyonunu, canlılığını ve yapısını içerecek şekilde diseke etmek mümkündür. Koroid pleksus izolasyonundaki önemli bir engel, yapıyı hala beyin ventriküllerinde yüzerken tanımlamaktır.Koroid pleksusun bromofenol mavisi ile boyanması izolasyonu kolaylaştırır. Prosedürü gösteren, laboratuvar yöneticimiz Elien Van Wonterghem olacaktır. Bir terminal anestezik, transkardiyal perfüzyon çözeltisi ve elektron mikroskobu veya SEM ve metinde belirtildiği gibi diğer çözeltileri taramak için gerekli bir çözelti hazırlayarak başlayın.Fare beynini izole etmek için ölümcül anestezi altındaki hayvanı dorsal decubitus pozisyonuna yerleştirin ve uzuvları bir tabağa sabitleyerek fareyi sabitleyin. Karbon çelik cerrahi bıçak kullanarak diyaframın hemen altında yaklaşık dört santimetrelik bir kesi yapmadan önce% 70 etanol püskürterek göğsü dezenfekte edin. Cildi açın ve cerrahi makas kullanarak göğsü açığa çıkarın.Akciğerleri ve atan kalbi açığa çıkarmak için diyaframı tamamen açın ve göğüs kafesini ayırın. Bir perfüzyon pompası kullanarak, fareyi dakikada 4,5 mililitre oranında 10 mililitre perfüzyon çözeltisi ile transkardiyal olarak perfüze edin. Çözeltiyi sistemik devreye pompalamak için sol ventriküle 26 gauge'lik bir iğne yerleştirin.Cerrahi makas kullanarak, kanın dolaşımdan çıkması için sağ atriyumu kesin. Farenin kafası kesildikten sonra kulakların arasından başlayarak gözlerden üstünlüğe doğru bir kesi yaparak kafa derisini kesin. Kafatasını açığa çıkarmak için cildi yanal olarak çekin.Daha sonra burun kısmına doğru skuamozal dikişleri takip ederek kafatasını kesin. İşiniz bittiğinde, beyni buz gibi soğuk bir Petri kabına yerleştirin ve beyin dokusuna bir mililitre buz gibi PBS ekleyin. Dördüncü ventrikülde yüzen koroid pleksusu izole etmek için, bir neşter kullanarak beyinciği beyincikten yavaşça kesin.Kalan beyin sapı doku parçalarını beyincikten çıkarın. Beyni, kesme çizgisi yukarı bakacak şekilde döndürün, dördüncü ventrikül boşluğunun, dorsal bölgede yatan koroid pleksus ile bölümün ortasında görünür olmasını sağlayın. Gerekirse, bağ dokusunu keskin forsepslerle çekerek ventrikülü açın.Koroid pleksusu küçük keskin forsepsler kullanarak ventrikül duvarından yavaşça yırtın. Koroid pleksusu lateral ventrikülden izole etmek için, küçük keskin forsepsler kullanarak beyni sagittal olarak iki yarım küreye bölün. Bir beyin yarımküresini, kesme çizgisi yukarı doğru olacak şekilde döndürün.Lateral ventrikülü ortaya çıkarmak için korteksi talamustan yavaşça çekin. Hipokampüsü orta sagital kesme hattına geri çekin. Lateral ventrikül artık ventrikülün dibinde yatan koroid pleksus ile görülebilir.Gerekirse, bağ dokusunu keskin forsepslerle açarak ventrikülü biraz açın. Koroid pleksusu ventrikül duvarından nazikçe koparmak için küçük keskin forseps kullanın. SEM için numune hazırlığını gerçekleştirmek için, taze izole edilmiş koroid pleksusu taze yapılmış fiksasyon çözeltisine aktarın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.İşiniz bittiğinde, numuneyi her biri beş dakika boyunca üç ila beş mililitre 0.1 molar sodyum kakodilat tamponu kullanarak üç kez yıkayın. Numuneleri üç ila beş mililitre% 2 osmiyum tetroksit içinde 0.1 molar sodyum kakodilat tamponunda 30 dakika bekletin. Daha sonra numuneleri her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın, üç ila beş mililitre ultra saf su kullanın.Daha sonra, numuneleri artan bir dizi buz gibi soğuk etil alkol konsantrasyonunda, etil alkol çözeltisi başına 15 dakika ile kurutun. Numuneyi düzgün bir şekilde kurutmak için kritik bir nokta kurutucu kullanın. Numuneyi karbon etiketli bir numune montajına dikkatlice yerleştirin ve SEM kullanarak koroid pleksus numunelerini görselleştirin.Mevcut protokol, koroid pleksusun fare beyninden, lateral ve dördüncü ventriküllerden etkili bir şekilde izole edilmesini kolaylaştırmıştır. Bromofenol mavisi ile yapılan perfüzyon, koroid pleksusun görüntülenmesi ile sonuçlandı. Daha sonraki işlem adımlarında bromofenol mavisine izin verilmediğinde, PBS-heparin ile perfüzyon yapıldı veya işleme için perfüzyon yapılmadı.Koroid pleksus epitelyal veya CPE hücrelerinin yüzeyinin SEM morfolojik analizi, dördüncü ventrikülün iki kol yapısını ve lateral ventrikülden izole edilen lateral koroid pleksusun tipik C şeklindeki formunu açıkça göstermektedir. Daha yüksek bir SEM büyütmesi, CPE hücrelerinin ve mikrovillusların apikal tarafında vezikül benzeri yapılar ortaya çıkardı, bu da CPE hücrelerinin hastalık koşullarındaki morfolojik değişikliklerinin SEM kullanılarak araştırılabileceğini gösterdi. Numuneyi çevreleyen doku ile kirletmemek için sadece koroid pleksus dokusuna dokunmak ve çıkarmak önemlidir.Koroid pleksusun yapısını korumak için gerekli dikkati kullanın. İzole koroid pleksusun yapısını ve işlevini araştırmak için mikroskop analizinden transkriptom analizine ve akış sitometrisine kadar çeşitli aşağı akış teknikleri uygulanabilir. Koroid pleksusun beyinden mikrodiseksiyonu, bu küçük beyin dokusunun yapısı ve işlevi hakkında daha iyi bir fikir edinmemizi sağlar.Bu bilgi, nörolojik hastalıklardaki rolünü daha iyi anlamak için gereklidir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Odaklı İyon Işın Freze ve Beyin Dokusu Taramalı Elektron Mikroskobu

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Tüm Dağı Muscle Analizi ile tekrarlanabilir Fare Siyatik Sinir Ezilme ve Rejenerasyon daha sonraki Değerlendirme

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

Rat Beyin gelen Serebral Yüzey damarları ve İlişkili Beyin zarları ve Diseksiyon ve Koroid Pleksus bir Görsel Açıklama

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Koroid Pleksus Epitel Hücreleri Silier Hareketi Gözlem<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Seri Blok-Yüz Taramalı Elektron Mikroskop Kullanarak Beyin Mitokondri Analizi

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...