تتيح هذه التقنية تطوير نظام موحد يسهل إعداده من خطوط الخلايا البشرية أو مجموعات الخلايا الأولية ويوفر ميزات بنية جيدة التنظيم تشبه نخاع العظام. يسمح هذا النموذج بتثبيت ما بعد حصاد الخلايا لتوصيف توطين الخلايا في الموقع داخل النظام عن طريق التصوير ، أو تفكك بنية 3D لجمع كل مكون خلوي للدراسات الجزيئية أو الوظيفية. سيوضح الإجراء كيفن جيستليش ، مهندس مساعد من مختبري.
تزن 35 إلى 40 ملليغرام من حبات BCP في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر لكل إدخال. وهذا هو ، طبق بلاستيكي أسطواني صغير مع غشاء البولي في الأسفل. قم بحفر ثقب صغير بإبرة نظيفة من خلال الجزء العلوي من الأنبوب سعة 1.5 ملليلتر لتجنب فتح الغطاء أثناء دورة الأوتوكلاف ، ووضع الأنابيب في وضع رأسي في صندوق مغلق ومعقم.
ضع إدخالات خلية البولي كربونات المعقمة داخل آبار لوحة من ستة آبار. صب حبات BCP المعقمة من أنبوب 1.5 ملليلتر في الملحق. اغسل الخرز بعناية عن طريق تقطير 350 ميكرولتر من 1X PBS داخل الملحق ثم أضف 4.5 ملليلتر من 1X PBS إلى البئر.
تخلص من PBS باستخدام فراغ أو ماصة سعة خمسة ملليلتر عن طريق وضع الطرف في زاوية من البئر. كرر خطوة الغسيل مرتين. بعد ذلك ، استخدم 1X PBS المكمل ب 10٪ FBS لحظر النظام.
أضف بعناية 350 ميكرولتر من محلول الحجب إلى الملحق و 4.5 ملليلتر إلى البئر ، وضع اللوحة بأكملها في حاضنة طوال الليل. قم بإزالة حل الحظر من النظام. امزج 1 في 10 أس 6 خلايا HMEC-1 و 2 في 10 إلى 6 خلايا HS27A ، التي تمثل مقصورات الخلايا اللحمية الوعائية والوسيطة على التوالي ، في أنبوب سعة 15 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 1،575 G في درجة حرارة الغرفة.
تخلص من المادة الطافية وأضف 175 ميكرولترا من وسط HMEC-1 ، مع استكمالها ب 175 ميكرولتر من ODM التي ستعزز تمايز الخلايا اللحمية المتوسطة إلى بانيات العظم. صب 350 ميكرولتر من تعليق الخلية التي تحتوي على 3 مرات 10 إلى 6 خلايا إجمالية داخل كل إدراج. ثم ، صب 4.5 ملليلتر من الوسائط المدمجة بدون خلايا في آبار اللوحة.
قم بشفط الخليط برفق وتوزيعه عدة مرات باستخدام ماصة دقيقة سعة ملليلتر واحد لتجانس الخلايا وحبات BCP داخل الملحق. اترك المزيج بأكمله يستقر في الجزء السفلي من الإدخال. بمجرد تجانس الخلايا البطانية والوسيطة داخل الملحق ، احتفظ باللوحة المكونة من ستة آبار داخل الحاضنة لمدة ثلاثة أسابيع.
قم بتغيير الوسيط الموجود داخل الملحق في البئر مرتين في الأسبوع عن طريق إزالة الوسط بعناية باستخدام ماصة صغيرة سعة ملليلتر واحد ووضع الطرف على جدار الإدخال الداخلي لتجنب إزعاج زاوية الإدخال. أعد تعليق الخلايا الدموية ذات الأهمية في وسط الجمع بين HMEC-1 و RPMI وأضف تعليق الخلية إلى الملحق. يمكن إضافة أنواع الخلايا الأخرى ذات الأهمية مع الوسائط المخصصة في هذه الخطوة.
إذا كان بروتوكول العلاج الدوائي مطلوبا ، فانتظر 24 ساعة بعد إضافة الخلايا محل الاهتمام قبل علاجها ، مما يمنحها الوقت للالتصاق بالبنية الشبيهة بالعظام. قم بتحديث الوسيط باستخدام 50٪ HMEC-1 متوسط كامل و 50٪ RPMI متوسط كامل مرتين في الأسبوع. بعد تغيير وسط الاستزراع مرتين في الأسبوع ، قم بتخزين المادة الطافية المسترجعة من داخل الملحق عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لتقييم إنتاج البروتين داخل النظام.
لفصل الخلايا عن بنية 3D ، امزج 4.5 ملليلتر من RPMI مع 0.5 ملليلتر من FBS ، مع استكمال 0.4 ملليغرام لكل ملليلتر من كولاجيناز في أنبوب سعة 15 ملليلتر. ثم سخني المحلول عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ضع الملحق رأسا على عقب على غطاء لوحة معقم من ستة آبار لقطع الغشاء بشكل صحيح.
استخدم مشرطا معقما لقطع الغشاء من الجانبين ، وبالتالي استرداد قرص صلب أبيض. ضع القرص داخل الأنبوب الدافئ سعة 15 ملليلتر الذي يحتوي على خليط المحلول المحضر مسبقا. ضع الأنبوب في عجلة نشطة في حاضنة 37 درجة مئوية واحتضنها لمدة 10 دقائق للسماح بالهضم.
ضع نفس وقت الحضانة لجميع الأغشية لتجنب التحليل المنحرف. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي لأنبوب 15 ملليلتر لمدة خمس دقائق عند 1،575 جم في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1X الدافئ.
أعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من التربسين الدافئ واخلطها جيدا عن طريق السحب لمدة 10 ثوان ، وضعها في حمام مائي مضبوط على 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. أوقف الهضم الأنزيمي بإضافة ملليلتر واحد من FBS الدافئ والنقي. باستخدام ماصة صغيرة بحجم ملليلتر واحد ، قم بشفط الوسط وتوزيعه ميكانيكيا لفصل القرص تماما.
قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة خمس دقائق عند 1،575 G وأعد تعليق الحبيبات في ثلاثة ملليلتر من 1X PBS مكملة ب 10٪ FBS. اترك الخرزات للرواسب لمدة خمس ثوان قبل جمع المادة الطافية وترشيحها من خلال مصفاة خلية 35 ميكرون موضوعة على أنبوب تجميع. قم بالطرد المركزي للمرشح المسترد لمدة خمس دقائق عند 1،575 G وعد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق لتقييم الجدوى.
أعد تعليق الكريات في مزيج الأجسام المضادة واحتضانها لمدة 30 إلى 40 دقيقة على الجليد بعيدا عن الضوء. أضف ملليلتر واحد من PBS المكمل ب 2٪ FBS لغسل الخلايا وأجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 1،575 G.To بدء تحليل قياس التدفق الخلوي ، وإعادة تعليق الحبيبات المستردة في 200 ميكرولتر من 1X PBS مع 10٪ FBS ، مع استكمال DAPI في محلول من 1 إلى 2000. تحليل الأنابيب في مقياس خلوي باستخدام المعلمات الموضحة في مخطوطة النص.
استخدم مخطط الرسم البياني FSC-H مقابل FSC-W لبوابة السكان المفردة. في الكسر المفرد ، استخدم مخطط الرسم البياني DAPI-A مقابل FSC-A لتحديد عدد الخلايا القابل للحياة. مع السكان سلبي DAPI سابقا ، استخدم مخطط الرسم البياني APCA-A مقابل FSC-A لتحديد السكان الإيجابيين CD45.
لإصلاح الهيكل الشبيه ب BM ، انقل الملحق من اللوحة القديمة إلى لوحة جديدة من ستة آبار مملوءة ب 1X PBS. بعد ذلك ، استبدل الوسيط الموجود داخل الملحق برفق ب 1X PBS. بمجرد غسل الملحق ، ضعه داخل لوحة جديدة من ستة آبار واملأ كل من البئر والإدراج ببارافورمالدهيد المفتوح حديثا.
اسمح لعملية التثبيت بالمضي قدما لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة ، بعيدا عن الضوء. بعد ذلك ، اغسل الملحق مرة واحدة باستخدام 1X PBS وقم بتخزينه عند أربع درجات مئوية بعيدا عن الضوء. بعد التعرض المطلوب ، أشارت النتائج إلى أنه كان من الممكن الحفاظ على خلايا الدم لمدة ستة أسابيع على الأقل ضمن نموذج 3D قبل استرجاع الخلايا القابلة للحياة.
كان من الممكن استبدال خط الخلية HS27A بنخاع العظم الطبيعي الأساسي MSC أو سرطان الدم النخاعي الحاد MSC في هذا النموذج الشبيه ب 3D BM ، أو استبدال خط الخلايا المكونة للدم ب HSCs الأولية. سمح تضمين البارافين والكيمياء المناعية بنجاح بتحليل محتويات CD45 و CD73 باستخدام نماذج 3D. تتطلب أنظمة 3D هذه ثلاثة أسابيع من الهياكل الشبيهة بنخاع العظم ووقتا إضافيا مع الخلايا ذات الأهمية.
ويجب الحفاظ على الظروف المعقمة كما في بعض الأحيان ، يمكننا أن نرى تلوثات متوسطة مع تغييرات متوسطة مرتين في الأسبوع.
