该技术能够开发一种标准化系统，该系统易于从人类细胞系或原代细胞群中建立，并提供组织良好的骨髓样结构的特征。该模型允许固定后的细胞收获通过成像或 3D 结构解离来表征系统内的原位细胞定位，以收集每个细胞成分进行分子或功能研究。演示该程序的将是我实验室的助理工程师Kevin Geistlich。
每个插入物在 1.5 毫升管中称取 35 至 40 毫克 BCP 珠。也就是说，底部有聚碳酸酯膜的小圆柱形塑料盘。用干净的针头在1.5毫升管的顶部钻一个小孔，以避免盖子在高压灭菌器循环期间弹出，并将管子垂直放置在封闭的无菌盒中。
将无菌聚碳酸酯细胞培养插入物放入六孔板的孔中。将无菌BCP珠从1.5毫升管中倒入插入物中。通过在插入物内滴入 350 微升 1X PBS 仔细清洗珠子，然后将 4.5 毫升 1X PBS 加入孔中。
使用真空或五毫升移液器将吸头放在孔的一角丢弃PBS。重复洗涤步骤两次。然后，使用补充有 10%FBS 的 1X PBS 来阻止系统。
小心地向插入物中加入350微升封闭溶液，向孔中加入4.5毫升，并将整个板放入培养箱中过夜。从系统中卸下阻塞溶液。将1乘以10混合到6个HMEC-1细胞，2乘以10到6个HS27A细胞，分别代表血管和间充质基质细胞区室，在15毫升管中，并在室温下以1， 575G离心5分钟。
弃去上清液并加入175微升HMEC-1培养基，补充175微升ODM，以促进间充质基质细胞分化为成骨细胞。将含有350微升的细胞悬液（含有3乘以10）倒入每个插入物内的6个总细胞中。然后，将4.5毫升不含细胞的组合培养基倒入板的孔中。
用一毫升微量移液器轻轻吸出并分配混合物数次，以使插入物内的细胞和BCP珠均质化。让整个混合物沉淀在插件的底部。一旦内皮细胞和间充质细胞在插入物内匀浆，将六孔板保持在培养箱内三周。
使用一毫升微量移液器小心地去除培养基并将吸头放在内插入物壁上，以避免干扰插入物的角落，每周两次更换孔中插入物内的培养基。将感兴趣的血液学细胞重悬于HMEC-1和RPMI组合培养基中，并将细胞悬液添加到插入物中。可以在此步骤中添加具有专用培养基的其他感兴趣的细胞类型。
如果需要药物治疗方案，请在添加感兴趣的细胞后等待24小时再对其进行治疗，让它们有时间粘附在骨状结构上。每周两次用 50%HMEC-1 完全培养基和 50%RPMI 完全培养基刷新培养基。每周更换两次培养基后，将从插入物内部取出的上清液储存在零下80摄氏度，以评估系统内的蛋白质产生。
为了将细胞与3D结构解离，将4.5毫升RPMI与0.5毫升FBS混合，并在15毫升管中补充每毫升0.4毫克胶原酶。然后，将溶液在 37 摄氏度下加热 10 分钟。将插入物倒置在无菌的六孔板盖上，以正确切出膜。
使用无菌手术刀从侧面切开膜，从而取回白色固体椎间盘。将圆盘放入装有先前制备的溶液混合物的温热的15毫升管内。将试管置于37摄氏度培养箱中的活性轮中，孵育10分钟以使其消化。
对所有膜应用相同的孵育时间，以避免分析偏斜。孵育后，在室温下以1， 575g离心15毫升管5分钟。弃去上清液并将沉淀重悬于五毫升温热的1X PBS中。
将沉淀重悬于300微升温热胰蛋白酶中，并通过移液10秒钟充分混合，然后将其置于37摄氏度的水浴中一分钟。通过添加一毫升温热的纯FBS来停止酶消化。用一毫升微量移液器，机械吸出并分配培养基以完全解离光盘。
将试管以1， 575 G离心5分钟，然后将沉淀重悬于补充有10%FBS的3毫升1X PBS中。让珠子沉淀五秒钟，然后收集上清液并通过放置在收集管上的 35 微米细胞过滤器过滤。将取出的滤液以 1， 575 G 离心五分钟，并用台盼蓝计数细胞以评估活力。
将沉淀重悬于抗体混合物中，并在冰上避光孵育30至40分钟。加入一毫升补充有2%FBS的PBS洗涤细胞，并在1， 575下离心5分钟 G.To 启动流式细胞术分析，将取出的沉淀重悬于200微升1X PBS中，在1至2000溶液中补充DAPI。使用文本手稿中描述的参数分析细胞仪中的试管。
使用 FSC-H 与 FSC-W 图来控制单重态总体。在单重态部分中，使用 DAPI-A 与 FSC-A 图来确定活细胞群。对于先前门控的 DAPI 阴性人群，使用 APCA-A 与 FSC-A 图来确定 CD45 阳性人群。
要固定BM样结构，请将插入物从旧板转移到充满1X PBS的新六孔板中。然后，用1X PBS轻轻更换插入物内的培养基。清洗插入物后，将其放入新的六孔板中，并用新打开的多聚甲醛填充孔和插入物。
让固定过程在室温下进行四个小时，远离光线。接下来，用 1X PBS 清洗插入物一次，并将其存放在远离光线的 4 摄氏度下。在所需的曝光后，结果表明，在检索活细胞之前，可以在3D模型中将血液学细胞维持至少六周。
在这种3D BM样模型中，可以用原发性正常骨髓MSC或急性髓性白血病MSC替换HS27A细胞系，或者用原代HSC替换造血细胞系。 石蜡包埋和免疫化学成功地允许使用3D模型分析CD45和CD73含量。这种3D系统需要三周的骨髓样结构和额外的时间与感兴趣的细胞。
并且必须保持无菌条件，因为有时，我们可以看到每周两次的培养基变化的介质污染。
