फिजियोलॉजिकल या ट्यूमरल संदर्भों में निवासी कोशिकाओं के बीच गतिशीलता और बातचीत की जांच करने के लिए एक मानव अस्थि मज्जा 3 डी मॉडल
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December 16th, 2022
DOI :
December 16th, 2022
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introduction
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Bead Preparation and Sterilization
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3D Insert Preparation Under a Sterile Hood
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Cell Line Harvesting and 3D Maintenance
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Addition of Cells of Interest into the System
4:07
3D Bone Marrow-Like Experimental Results
7:50
Results: In Vitro 3D Human Bone Marrow-Like Microenvironment for Understanding the Resident Cell Interactions
8:33
Conclusion
Transcript
यह तकनीक एक मानकीकृत प्रणाली के विकास को सक्षम बनाती है जो मानव सेल लाइनों या प्राथमिक सेल आबादी से स्थापित करना आसान है और एक सुव्यवस्थित, अस्थि मज्जा जैसी संरचना की विशेषताएं प्रदान करता है। यह मॉडल सेल हार्वेस्ट पोस्ट फिक्सेशन को इमेजिंग के माध्यम से सिस्टम के भीतर सीटू सेल स्थानीयकरण को चिह्नित करने की अनुमति देता है, या आणविक या कार्यात्मक अध्ययन के लिए प्रत्येक सेलुलर घटक को इकट्ठा करने के लिए 3 डी संरचना पृथक्करण। प्रक्रिया का प्रदर्शन मेरी प्रयोगशाला के एक सहायक इंजीनियर केविन गीस्टलिच होगा।
प्रत्येक सम्मिलित के लिए 1.5-मिलीलीटर ट्यूब में 35 से 40 मिलीग्राम बीसीपी मोतियों का वजन करें। यही है, नीचे एक पॉली कार्बोनेट झिल्ली के साथ एक छोटा बेलनाकार प्लास्टिक पकवान। ऑटोक्लेव चक्र के दौरान ढक्कन को खोलने से बचने के लिए 1.5-मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष के माध्यम से एक साफ सुई के साथ एक छोटा छेद बोर करें, और ट्यूबों को एक बंद, बाँझ बॉक्स में ऊर्ध्वाधर स्थिति में रखें।
छह-वेल प्लेट के कुओं के भीतर बाँझ पॉली कार्बोनेट सेल कल्चर डालें। डालने में 1.5 मिलीलीटर ट्यूब से बाँझ बीसीपी मोती डालें। इंसर्ट के अंदर 1एक्स पीबीएस के 350 माइक्रोलीटर टपकाकर मोतियों को सावधानी से धोएं और फिर कुएं में 4.5 मिलीलीटर 1एक्स पीबीएस जोड़ें।
कुएं के एक कोने में नोक रखकर वैक्यूम या पांच मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके पीबीएस को छोड़ दें। धोने के चरण को दो बार दोहराएं। फिर, सिस्टम को ब्लॉक करने के लिए 10% FBS के साथ पूरक 1X PBS का उपयोग करें।
ध्यान से ब्लॉकिंग समाधान के 350 माइक्रोलीटर डालें और कुएं में 4.5 मिलीलीटर जोड़ें, और पूरी प्लेट को रात भर इनक्यूबेटर में रखें। सिस्टम से ब्लॉकिंग समाधान निकालें। 6 एचएमईसी -1 कोशिकाओं में 1 गुना 10 और 6 एचएस 27 ए कोशिकाओं को 2 गुना 10 मिलाएं, जो क्रमशः संवहनी और मेसेनकाइमल स्ट्रोमल सेल डिब्बों का प्रतिनिधित्व करते हैं, 15-मिलीलीटर ट्यूब में और कमरे के तापमान पर 1, 575 ग्राम पर पांच मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
सुपरनैटेंट को छोड़ दें और एचएमईसी -1 माध्यम के 175 माइक्रोलीटर जोड़ें, जो ओडीएम के 175 माइक्रोलीटर के साथ पूरक हैं जो ओस्टियोब्लास्ट में मेसेनकाइमल स्ट्रोमल सेल भेदभाव को बढ़ावा देंगे। सेल सस्पेंशन के 350 माइक्रोलीटर डालें जिसमें प्रत्येक इंसर्ट के अंदर 6 कुल कोशिकाओं में 3 गुना 10 होते हैं। फिर, प्लेट के कुओं में कोशिकाओं के बिना संयुक्त मीडिया के 4.5 मिलीलीटर डालें।
धीरे-धीरे मिश्रण को एक-मिलीलीटर माइक्रोपिपेट के साथ कई बार एस्पिरेट करें और डालें ताकि इंसर्ट के भीतर कोशिकाओं और बीसीपी मोतियों को समरूप किया जा सके। पूरे मिश्रण को सम्मिलित करने के निचले भाग में बसने दें। एक बार जब एंडोथेलियल और मेसेनकाइमल कोशिकाएं इंसर्ट के अंदर समरूप हो जाती हैं, तो तीन सप्ताह के लिए इनक्यूबेटर के अंदर छह-वेल प्लेट रखें।
एक मिलीलीटर माइक्रोपिपेट का उपयोग करके माध्यम को सावधानीपूर्वक हटाकर और डालने के कोने को परेशान करने से बचने के लिए टिप को आंतरिक सम्मिलित दीवार पर रखकर सप्ताह में दो बार कुएं में डालें। एचएमईसी -1 और आरपीएमआई संयोजन माध्यम में रुचि की हेमेटोलॉजिकल कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और सेल निलंबन को सम्मिलित करें। समर्पित मीडिया के साथ अन्य सेल प्रकार की रुचि इस चरण में जोड़ी जा सकती है।
यदि दवा उपचार प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है, तो उनके इलाज से पहले रुचि की कोशिकाओं को जोड़ने के बाद 24 घंटे प्रतीक्षा करें, जिससे उन्हें हड्डी जैसी संरचना का पालन करने का समय मिले। सप्ताह में दो बार 50% एचएमईसी -1 पूर्ण माध्यम और 50% आरपीएमआई पूर्ण माध्यम के साथ माध्यम को ताज़ा करें। सप्ताह में दो बार कल्चर माध्यम को बदलने के बाद, सिस्टम के भीतर प्रोटीन उत्पादन का मूल्यांकन करने के लिए इंसर्ट के अंदर से पुनः प्राप्त सुपरनैटेंट को माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
कोशिकाओं को 3 डी संरचना से अलग करने के लिए, 0.5 मिलीलीटर एफबीएस के साथ आरपीएमआई के 4.5 मिलीलीटर मिलाएं, 15 मिलीलीटर ट्यूब में कोलेजनेज के 0.4 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ पूरक। फिर, 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर घोल गर्म करें। झिल्ली को ठीक से काटने के लिए एक बाँझ, छह-वेल प्लेट कवर पर डालें।
किनारों से झिल्ली को काटने के लिए एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करें, इस प्रकार एक सफेद ठोस डिस्क को पुनः प्राप्त करें। डिस्क को गर्म 15-मिलीलीटर ट्यूब के अंदर रखें जिसमें पहले तैयार समाधान मिश्रण हो। ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक सक्रिय पहिया में रखें और पाचन की अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
विषम विश्लेषण से बचने के लिए सभी झिल्ली के लिए एक ही इनक्यूबेशन समय लागू करें। इनक्यूबेशन के बाद, कमरे के तापमान पर 1,575 ग्राम पर पांच मिनट के लिए 15-मिलीलीटर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और पैलेट को पांच मिलीलीटर गर्म 1 एक्स पीबीएस में फिर से निलंबित करें।
गोली को गर्म ट्रिप्सिन के 300 माइक्रोलीटर में फिर से निलंबित करें और 10 सेकंड के लिए पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं, और इसे एक मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारित पानी के स्नान में रखें। एक मिलीलीटर गर्म, शुद्ध एफबीएस जोड़कर एंजाइमेटिक पाचन को रोकें। एक मिलीलीटर माइक्रोपिपेट के साथ, यांत्रिक रूप से एस्पिरेट करें और डिस्क को पूरी तरह से अलग करने के लिए माध्यम को वितरित करें।
ट्यूब को 1,575 जी पर पांच मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और 10% एफबीएस के साथ पूरक 1 एक्स पीबीएस के तीन मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। सतह पर तैरने वाले को इकट्ठा करने और संग्रह ट्यूब पर रखे गए 35 माइक्रोन सेल छन्नी के माध्यम से इसे छानने से पहले मोतियों को पांच सेकंड के लिए तलछट पर छोड़ दें। 1,575 जी पर पांच मिनट के लिए पुनर्प्राप्त फिल्ट्रेट को सेंट्रीफ्यूज करें और व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए ट्राइपैन ब्लू के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
एंटीबॉडी मिश्रण में छर्रों को फिर से निलंबित करें और प्रकाश से दूर बर्फ पर 30 से 40 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण शुरू करने के लिए 1,575 पर पांच मिनट के लिए कोशिकाओं और सेंट्रीफ्यूज को धोने के लिए 2% एफबीएस G.To के साथ पूरक पीबीएस के एक मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें, 10% एफबीएस के साथ 1 एक्स पीबीएस के 200 माइक्रोलीटर में पुनर्प्राप्त गोली को फिर से निलंबित करें, 1 से 2000 समाधान में डीएपीआई के साथ पूरक। पाठ पांडुलिपि में वर्णित मापदंडों का उपयोग करके साइटोमीटर में ट्यूबों का विश्लेषण करें।
एकल आबादी को गेट करने के लिए एफएससी-एच बनाम एफएससी-डब्ल्यू ग्राफ प्लॉट का उपयोग करें। एकल अंश में, व्यवहार्य सेल आबादी निर्धारित करने के लिए DAPI-A बनाम FSC-A ग्राफ प्लॉट का उपयोग करें। डीएपीआई-नकारात्मक आबादी के साथ पहले गेटेड होने के साथ, सीडी 45-पॉजिटिव आबादी निर्धारित करने के लिए एपीसीए-ए बनाम एफएससी-ए ग्राफ प्लॉट का उपयोग करें।
बीएम जैसी संरचना को ठीक करने के लिए, पुरानी प्लेट से 1 एक्स पीबीएस से भरी एक नई छह-वेल प्लेट में डालें। फिर, धीरे से 1 एक्स पीबीएस के साथ इंसर्ट के अंदर माध्यम को बदलें। एक बार जब डालने को धो लिया जाता है, तो इसे एक नई छह-वेल प्लेट के भीतर रखें और ताजा खोले गए पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कुएं और इंसर्ट दोनों को भरें।
निर्धारण प्रक्रिया को प्रकाश से दूर कमरे के तापमान पर चार घंटे तक आगे बढ़ने दें। इसके बाद, 1X PBS के साथ एक बार डालें और इसे प्रकाश से दूर चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। वांछित एक्सपोजर के बाद, परिणामों ने सुझाव दिया कि व्यवहार्य कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करने से पहले 3 डी मॉडल के भीतर कम से कम छह सप्ताह तक हेमेटोलॉजिकल कोशिकाओं को बनाए रखना संभव था।
इस 3 डी बीएम जैसे मॉडल में प्राथमिक सामान्य अस्थि मज्जा एमएससी या तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया एमएससी के साथ एचएस 27 ए सेल लाइन को प्रतिस्थापित करना संभव था, या प्राथमिक एचएससी के साथ हेमटोपोइएटिक सेल लाइन को बदलना संभव था। पैराफिन-एम्बेडिंग और इम्यूनोकैमिस्ट्री ने 3 डी मॉडल का उपयोग करके सीडी 45 और सीडी 73 सामग्री के विश्लेषण की सफलतापूर्वक अनुमति दी। इस 3 डी सिस्टम को तीन सप्ताह की अस्थि मज्जा जैसी संरचनाओं और रुचि की कोशिकाओं के साथ अतिरिक्त समय की आवश्यकता होती है।
और बाँझ स्थितियों को बनाए रखा जाना चाहिए क्योंकि कभी-कभी, हम दो बार साप्ताहिक मध्यम परिवर्तनों के साथ मध्यम संदूषण देख सकते हैं।
यहां, हम एक आसान-से-लागू, मानकीकृत, माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम का वर्णन करते हैं जो विवो संरचना में मानव अस्थि मज्जा की जटिलता को दर्शाता है, सामान्य और पैथोलॉजिकल घटनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का बारीक अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक मॉडल प्रदान करता है।
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