Name: high-throughput protein crystallization via microdialysis
Uploaded: 2023-03-03T14:05:00
Duration: 6 min 18 s
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我们感谢英国商业、能源和工业战略部 （BEIS） 的资助。我们感谢国家物理实验室的Alex R. Jones和Mike Shaw对手稿的反馈。

1. 蛋白质样品制备
<ol><li>制备（通过重组方法或其他方法）并在合适的缓冲液（即适合蛋白质稳定性和结晶的缓冲液）中纯化感兴趣的蛋白质，该缓冲液已用0.22μm过滤器过滤（参见 材料表）。在结晶之前评估蛋白质质量（在纯度、多分散性和稳定性方面）31. 注意：有关本研究中使用的蛋白质和缓冲液的详细信息，请参阅代表性结果部分。</li>
	<li>使用正确的MWCO浓缩器将样品浓缩至10-50 mg.mL-1 或更高（取决于蛋白质靶标）（参见 材料表）。 注意：浓缩的样品可以立即用于结晶或在-80°C冷冻储存。</li>
	<li>如果蛋白质已冷冻，则将样品在台式离心机（≥16，000 × g，在室温或4°C下）中离心10分钟以沉淀并去除任何不需要的物质（例如沉淀物）。</li>
	<li>将蛋白质分装到干净的 200 μL PCR 管中。如果蛋白质在室温下不稳定，则将其保存在冰上或4°C。</li>
</ol>2. 设置微透析板
注意：市售微透析板（见 材料表）由两面（“蛋白质侧”和“缓冲侧”）和再生纤维素膜（可用于不同的MWCO）组成，如图 2所示。
<ol><li>将板定向蛋白质面朝上，剥离并从200μm压力粘合剂垫片中取出胶带（图2A）。注意A1井的位置。</li>
	<li>使用多通道移液器，将最多 3.2 μL 蛋白质（步骤 1.4）加载到每个孔中（图 2B）。 注意：蛋白质也可以使用重复分液移液器上样。使用单通道移液器是可能的，但由于加载时间延长，它会增加液滴部分脱水的可能性。</li>
	<li>将200μmUV覆盖膜（参见 材料表）放置在96孔板上并检查其完整性（图2C）。确保保护膜朝上。</li>
	<li>使用密封桨（见 材料表），按下UV盖膜以激活并密封压力粘合剂。</li>
	<li>倒置板并注意孔A1的位置。确保板的方向是缓冲液面朝上，并且孔位置是镜像的（图2D）。</li>
	<li>使用多通道移液器，将最多 350 μL 的透析溶液加载到每个孔中（图 2D）。 注意：在此步骤中，可以使用市售的结晶筛（稀疏基质筛）或实验室制造的定制筛网（网格筛）（见 材料表）。</li>
	<li>用“储层盖膜”小心地密封孔（见 材料表）（图2E）。</li>
	<li>将板（缓冲液面朝上）置于合适的温控培养箱（20°C）中以进行晶体生长。 注意：对于为本研究选择的蛋白质，晶体在20°C下开始在1-8小时之间出现。</li>
	<li>为了在显微镜下检查晶体，倒置板以使蛋白质面朝上并从200μmUV覆盖膜中去除保护膜（步骤2.3），如图 2F，G所示。</li>
</ol>3. 使用透析管进行大规模结晶
注意：一旦使用微量透析板探索了结晶条件，就可以使用透析管进行蛋白质的大规模结晶（用于连续晶体学或其他目的），如图 3所示。与微透析板类似，这些设备可提供 3、5、10 和 30 kDa MWCO 透析膜。
<ol><li>为大容器中微晶的生长准备优化的结晶条件（采用使用微量透析板优化的条件）。确保缓冲液事先已用0.2 μm过滤器过滤。</li>
	<li>将蛋白质移液到透析管中（最大体积为0.5 mL），并使用随附的红色塑料盖密封末端（图3A）。</li>
	<li>将500μL透析管放入装有浮动架（参见 材料表）的合适尺寸的容器（取决于透析溶液的总体积）中，如图 3B所示。 注意：透析器套件随附的浮动架最多可同时容纳 18 个透析管。</li>
	<li>将容器固定在合适的温控培养箱（20°C）中以进行晶体生长。</li>
	<li>要检查晶体，请将 1-2 μL 溶液移液到玻璃盖载玻片上。在顶部盖上第二个玻璃盖玻片（以防止过度脱水）并在显微镜下观察（见 材料表）。 注意：在检查过程中，夹在两个玻璃盖玻片之间时，晶体可能会损坏。通过将透析管放在立体高放大倍率显微镜下，也可以直接观察晶体。</li>
</ol>

<ol>
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合著者Pascelle Draper和Paul Reardon受雇于SWISSCI。

目前，透析结晶是最未充分利用的结晶方法，即由于现有方法（例如带按钮的微透析）的低通量和繁琐的性质。在这里，一个简单但强大的方案遵循HTP工作流程，通过市售的微透析板和透析管透析蛋白质晶体生长。根据目标蛋白的不同，手术中使用的微量透析板和透析管可以选择具有 3、5、10 或 30 kDa MWCO 的透析膜。该方案可以在任何标准结晶设施中轻松设置，并且具有适用于可溶性和膜蛋白的巨大优势。然而，在该协议期间未测试蛋白质 - 蛋白质和蛋白质 - 核酸复合物。
与任何透析结晶方法一样，蛋白质样品和透析溶液之间的体积比至关重要。在该协议中，建议样品和透析溶液之间的比例为1：100，但由于微透析板允许最大容量为350μL透析溶液，因此可以探索这些比例以获得晶体命中。在设置结晶板时，在所提出的方案中使用1-2μL蛋白质的体积。这是为了确保使用手动多通道移液器准确设置液滴。通过使用电动移液器（多通道或重复分液移液器）或HTP液体分液机器人，可以准确地滴低体积，从而降低所需的蛋白质量。此外，由于微透析板所需的透析缓冲液体积相对较低（与其他常规透析方法相反），因此可以（无需大量使用资源）探索大型化学空间，不仅使用市售的结晶筛，还使用优化筛（围绕初始结晶命中条件设计）。
所介绍的HTP程序的一个关键步骤是及时将小体积蛋白质（每个条件0.50-3.2μL）施加到透析板上，以限制脱水和样品损失。通过使用多通道移液器、重复分液移液器或机器人结晶系统，可以轻松缓解这种情况。板在20°C下的孵育时间长，例如超过2周，可能导致蛋白质液滴脱水或最近形成的晶体损坏。将透析板保存在加湿室或可密封袋内可以减轻这种影响。此外，建议使用无菌材料和技术以避免细菌生长。
如引言所述，最近，随着对了解疾病机制、蛋白质-配体结合相互作用和蛋白质-蛋白质相互作用的蛋白质结构动力学的需求增加，蛋白质 X 射线晶体学领域通过开发新的和现有的结晶技术、现代晶体样品输送方法、新一代 X 射线源以及用于数据采集和处理的新复杂方法而发生了革命性的变化36，37，38.因此，室温连续微晶体学的出现，无论是使用XFEL还是同步加速器光源进行，已成为结构生物学中的重要工具，特别是在膜蛋白领域39。然而，需要数千个微晶体才能产生足够的数据来形成稳健的结构解决方案，这不是一件容易的事（至少通过传统的结晶方法）。这里描述的透析结晶方法可以生产大量的微晶。一旦通过使用微透析板确定了生产微晶（1-10 μm）的结晶条件，就可以使用0.5 mL透析器装置生产大量高密度微晶（图5）。这些晶体非常适合使用固定目标或液体射流样品输送系统27，40进行数据收集。通过这种方法获得的晶体也适用于MicroED应用。然而，这些可能需要铣削到适合此特定应用的尺寸和厚度，因为电子与晶体的相互作用比X射线光子41强得多。
总之，这里描述的透析结晶方法增加了蛋白质结晶结构测定的不断发展策略，并扩大了可用于确定以前其他传统方法无法成功的新型蛋白质靶标的努力范围。

在上个世纪，X射线晶体学在阐明和理解生物大分子的结构 - 功能范式方面至关重要。迄今为止，它仍然是阐明许多独特不同蛋白质的原子分辨率结构的最成功方法之一，这些蛋白质对于细胞生物化学，医学和早期药物发现的基本理解至关重要1，2。然而，蛋白质结晶仍然是研究许多蛋白质靶标的瓶颈，特别是膜蛋白和大蛋白质复合物3。因此，由于采用劳动密集型的试错法，蛋白质结晶几乎总是被认为是一门艺术4，5，6。
沉淀剂通常以高浓度添加到蛋白质溶液中，以形成有序、规则和重复的蛋白质分子晶格排列，称为晶体。在有利的条件下，如温度、pH、浓度和沉淀剂，最终形成过饱和溶液，然后晶体成核并生长7，8。尽管结晶试验设置取得了许多进展，主要是随着高通量机器人系统的开发和现成的“稀疏基质”筛选的可用性，但多年来蛋白质结晶的一般方法基本保持不变。常见的实验性蛋白质结晶技术包括蒸汽扩散（悬挂液滴和坐滴）9，微批量（油下）10，11，自由界面扩散（微流体装置）12和透析（使用按钮和其他技术）13，14，15。然而，还存在其他更专业的设置，例如用于结晶膜蛋白16，17的中间相方法。虽然沉积在蛋白质数据库中的大多数X射线蛋白质结构到目前为止已经通过气相扩散方法6，18的结晶来解决，但其他方法，例如通过透析结晶，似乎没有得到充分利用，可能是由于与其实验设置相关的实际方面。
透析结晶仅依赖于溶质（沉淀剂、离子、添加剂和缓冲液）通过半透膜的缓慢扩散，同时防止蛋白质分子循环。这样，蛋白质溶液慢慢进入平衡状态，沉淀剂达到结晶所需的浓度。系统的动力学取决于温度、沉淀剂浓度和纤维素膜分子量截止值 （MWCO）19。迄今为止，最流行的透析结晶装置是使用由透明丙烯酸板制成的微透析按钮。它们通常浸入含有结晶沉淀剂溶液的储液器（主要使用蒸汽扩散悬挂滴板）中。然而，这种低通量方法还需要特定的组装来密封放置在纽扣室上方的透析膜内的蛋白质溶液，如图 1所示。此外，滞留在透析膜和蛋白质溶液之间的气泡是损害晶体生长的常见问题。该方法的另一个限制是样品要求，与蒸汽扩散方法相比，需要更高的浓度和体积来适应透析按钮。因此，使用微透析按钮进行结晶被认为是一种没有吸引力的方法，特别是对于膜蛋白等难以识别的靶标，其纯化率低得令人沮丧。最近，已经开发了微流体装置以促进通过透析15实现蛋白质结晶。这些芯片还被设计为具有高X射线透明度和低背景，允许芯片在室温下用于 原位 数据收集，从而消除了收获和低温冷却晶体的不便。尽管取得了这些进步，但这种方法的通量仍然非常低且成本高昂。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig01.jpg"> 图1：使用透析按钮透析结晶的示意图 。 （A）结晶透析按钮的示意图。（B）将蛋白质溶液加入微透析纽室。（C）在通过涂抹器 施加的 橡胶圈（O形圈）的帮助下将透析膜固定在微透析按钮上。（D）透析按钮准备浸入含有结晶溶液（透析溶液）的储液器中，如（E）所示。装有浸入式透析按钮的小瓶必须密封以避免蒸发。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
在这里，提出了一个简单的方案，用于使用96孔高通量透析板筛选蛋白质结晶条件和晶体生长。这些一次性板的设计用途类似于蒸汽扩散结晶板（移液器然后密封），如图 2所示。这些板可容纳多达 3.2 μL 的蛋白质和 350 μL 的透析液。每个孔都有一个单独的再生纤维素膜，以防止孔之间的交叉污染。设置大约需要 10 分钟才能完成，除了所有标准结晶实验室中都可以找到的设备外，不需要任何专业设备。四种不同的蛋白质，包括两种膜蛋白，用于证明和验证该方法作为高通量（HTP）蛋白质晶体学的有效方法。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig02.jpg"> 图2：使用微透析板的结晶工作流程。 （A）去除红色粘合剂“覆盖膜”。（B）将蛋白质液滴分配到每个滴孔中。（C）孔被紫外线“覆盖膜”覆盖。（D）将板倒置，加入透析液（或结晶筛）。（E）将板密封并孵育。（法，八）液滴的显微镜检查。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
使用0.5 mL透析管（图3）证明了这种通过透析方案结晶的使用，用于大规模（数百至数千次）微晶生产，适用于最先进的数据收集方法，例如XFEL设施20，21，22，23，24和同步加速器25，26，27的连续晶体学，以及MicroED 28、29、30 方法。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig03.jpg"> 图 3：使用透析管的大规模微透析结晶。 （A） 0.5 mL 透析管的示意图。（B）装有结晶溶液的烧杯和装有透析管的浮动管架的侧视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0620</td>
			<td>For aliquoting protein solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>17823----------K</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate filters. For filtering dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSTF04700</td>
			<td>Membrane filters for filtering large volumes of buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 0.5 &#8211; 10 &#181;L Research plus pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000028</td>
			<td>For dispensing protein drops onto the Diaplate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 30 &#8211; 300 &#181;L Eppendorf Research plus pipette&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000060</td>
			<td>For dispensing dialysis solutions on the Diaplate reservoirs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15889152</td>
			<td>For use with syringe filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2.2 mL deep-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0788</td>
			<td>Polypropylene deep-well storage plates; for preparing screens using the Hamilton Microlab STARlet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000565</td>
			<td>With rotor FA-24x2 with a maximum g-force of 21,300 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diacon dialyser</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W72010</td>
			<td>Dialyzer tubes with a regenerated cellulose membrane with a molecular weight cut-off of 10 kDa. Ideal for protein solutions of up to 0.5 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaplate 96-well plate</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W82010</td>
			<td>Microdialysis plate. The Diaplate consists of two sides with a regenerated cellulose membrane in-between with a molecular weight cut-off of 10 kDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For holding dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating rack</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diacon kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor-standing vibration-free incubator</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD5-01</td>
			<td>400 L temperature-controlled incubator set to 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 C stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Planapo 1.0x objective, 7.8x &#8211; 160x zoom range with DMC 4500 camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memgold2</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-64</td>
			<td>Sparse-matrix screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlab STARlet</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable bottle top filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>DS0320-5045</td>
			<td>For fitering large volumes of buffers, for use with 0.22 &#181;m membrane filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing paddle</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput protein crystallization via microdialysis

在分子水平上了解蛋白质等大分子的结构-功能关系对于生物医学和现代药物发现至关重要。迄今为止，X射线晶体学仍然是以原子分辨率求解三维蛋白质结构的最成功方法。随着连续晶体学的最新进展，无论是使用X射线自由电子激光器（XFEL）还是同步加速器光源，蛋白质晶体学已经发展到下一个前沿领域，其中获取时间分辨数据的能力为室温下生物分子的行为提供了重要的机理见解。该协议描述了一种简单的高通量（HTP）工作流程，用于通过使用96孔透析板筛选结晶条件。这些板遵循生物分子筛选协会（SBS）标准，可以使用任何标准结晶实验室轻松设置。一旦确定了最佳条件，就可以使用透析器生产大量晶体（数百个微晶）。为了验证这种方法的稳健性和多功能性，结晶了四种不同的蛋白质，包括两种膜蛋白。

使用微量透析板（具有10 kDa MWCO膜）结晶四种蛋白质，包括两种膜蛋白。将冻干粉中的鸡蛋-清溶菌酶（见材料表）在50 mg.mL-1的20 mM NaOAc（pH 4.5）中制备，并将冻干的thaumatin（见材料表）溶解在水中至终浓度为25 mg.mL-1。本研究中使用的两种膜蛋白是大肠杆菌多药外排泵AcrB和大肠杆菌乳糖转运蛋白LacY。 使用C43（DE3）细胞表达AcrB，并通过Ni-NTA亲和色谱和体积排阻色谱在10 mM Tris （pH 7.5）、300 mM NaCl、0.03% （w/v）正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）和5%（v/v）甘油32中纯化。随后，使用100 kDa MWCO离心浓缩器将蛋白质浓缩至终浓度为6 mg.mL-1。LacY也在C43（DE3）细胞中表达，通过Ni-琼脂糖亲和色谱纯化，然后在20 mM Tris（pH 7.5），150 mM NaCl，0.03%（w / v）DDM中体积排阻色谱，并使用100 kDa MWCO浓缩器浓缩至10 mg.mL-1 4，33。
对于溶菌酶和索马汀蛋白，96孔微透析板填充有内部制备的结晶网格筛选作为透析溶液，而对于膜蛋白AcrB，从先前发表的结晶条件内部制备网格筛选34。对于 LacY，初始命中条件是从商业屏幕（见 材料表）中找到的，并使用内部制作的网格屏幕进一步优化。溶菌酶、索马汀和 AcrB 的结晶下降比为 1：100，含 2 μL 蛋白质与 200 μL 沉淀剂（透析溶液）。由于可用蛋白质的量较低，LacY结晶滴也以1：100的比例，1 μL蛋白质与100 μL透析溶液。
在微透析板设置后，来自所有四种蛋白质（包括膜蛋白）的晶体在20°C下开始出现1-8小时。在这种情况下，没有必要用洗涤剂补充透析溶液以进行膜蛋白结晶，通常在标准透析过程中进行以防止膜蛋白聚集，因为洗涤剂胶束预期大于透析膜35的MWCO。
在微透析板上蛋白质成功结晶后（图4），记录结晶条件，并使用具有相同10 kDa MWCO透析膜的透析管通过透析进行大规模结晶。每个蛋白质的数千个微晶在透析器内生长，如图 5所示。对于索马汀结晶，将 250 μL 蛋白质上样到透析器中，并在 50 mL（1：200 比例）下透析。对于 AcrB，将 250 μL 蛋白质与 25 mL 透析液 （1：100） 进行透析。LacY结晶也以与100 μL蛋白质与10 mL透析液的相同比例建立。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig04.jpg"> 图 4：使用微透析板通过透析生长晶体。 该方案证明了该装置对可溶性蛋白质的适用性：（A）溶菌酶对0.1M NaOAc（pH 4.0），0.5M NaCl和25%（v / v）甘油进行透析。（B）将Thaumatin与0.1M Bis-tris丙烷（pH 6.6），1M K / Na酒石酸盐和18%（v / v）乙二醇进行透析。还获得了膜蛋白的晶体：（C）AcrB针对0.1M MES（pH 5.5），0.3M NaCl和20%（v / v）PEG-400进行透析。（D）对LacY进行透析，以0.1M MES（pH 6.5），0.1M NaCl和32%（v / v）PEG-300进行透析。使用带有交叉偏振器的立体高放大倍率显微镜捕获图像。比例尺： （A，B，D） = 1 毫米;（C） = 200 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig05.jpg"> 图5：使用透析管透析生长的膜蛋白晶体的代表性图像。 （A）显示充满微晶体的管的图像（由黑色箭头表示）。（B） 使用 0.5 mL 透析管透析生长的索马汀晶体浆液中的 2 μL 显微图像，透析 0.1 M Bis-Tris 丙烷 （pH 6.6）、1.4 M K/Na 酒石酸盐和 18% （v/v） 乙二醇。（C） 通过透析生长的 AcrB 微晶的暗场（左）和明场（右）图像，针对 0.1 M MES （pH 5.5）、0.3 M NaCl 和 20% （v/v） PEG-400。（D） 通过透析生长的 LacY 微晶的暗场（左）和明场（右）图像，分别针对 0.1 M MES （pH 6.5）、0.1 M NaCl 和 32% （v/v） PEG-300。观察到一些沉淀物。比例尺： （B，D） = 200 μm;（C） = 500 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>

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High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

所提出的协议描述了一种使用96孔高通量透析板筛选蛋白质结晶条件和晶体生长的简单方法。透析管用于微晶的大规模生长也用于连续晶体学和MicroED应用。

通过微透析 实现 高通量蛋白质结晶

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

透析结晶是一种未充分利用的方法。该协议为此提供了一种Novo方法，该方法将增加目前可用于结构化测定的结晶策略的范围。该技术的主要优点是通量高，设置简单，无需专业设备，并且可以轻松监测晶体生长。执行此技术的个人必须熟悉小容量移液和使用多通道移液器。滴剂必须尽可能充分地移液以防止部分脱水。要设置微透析实验，请将市售的 96 孔微透析板放在蛋白质面朝上的方向，并通过剥离 200 微米压力粘合剂垫片来去除胶带。撕下胶带后，注意孔A1的位置。接下来，使用多通道移液器，将最多3.2微升适当制备的蛋白质样品加载到每个孔中。将 200 微米的 UV 覆盖膜正确放置在 96 孔板上，薄膜朝上。然后，要激活并密封压力粘合剂，请使用密封桨向下压UV盖膜并检查其完整性。现在，倒置板以使其达到缓冲面朝上的方向，并注意标记孔A1的镜像位置。使用多通道移液器，将最多350微升透析溶液装入板的每个孔中，并用储液罐盖膜小心地密封孔。然后，将板朝上放置在合适的温控培养箱内，温度为20摄氏度，以允许晶体生长。要在显微镜下检查晶体形成，请从200微米UV盖膜上取下保护盖膜，并将板放在目镜下方，蛋白质面朝上。要建立大规模的结晶实验，请采用微透析板中发生微晶生长的条件，并在大容器中复制相同的条件。根据透析液的体积选择容器尺寸。在使用红色塑料盖密封试管之前，将最大体积为 500 微升的蛋白质样品移液到透析管中。将密封的500微升透析管放入装有透析溶液的容器内的浮动架中。接下来，将容器不受干扰地放置在合适的温控培养箱中，温度为20摄氏度，以实现晶体生长。要检查晶体的形成，请将透析器中的一到两微升溶液移液到玻璃盖载玻片上。用另一张载玻片覆盖载玻片上的溶液，并在显微镜下观察。使用立体高放大倍率显微镜捕获的图像显示，使用具有10千道尔顿截止膜的微透析板成功形成四种蛋白质的微晶。发现溶菌酶在pH 4下与含有适当添加剂的0.1摩尔乙酸钠透析时形成晶体。当在pH 6.6下对含有适当添加剂的0.1摩尔双三丙烷透析时，Domatin形成晶体。优化的透析条件导致膜蛋白形成微晶，即大肠杆菌多药外排泵蛋白AcrB和大肠杆菌乳糖转运蛋白LacY。使用从微透析实验中获得的优化透析条件在透析管中进行大规模结晶，导致每种蛋白质形成数千个微晶。对于磷脂的结晶，将250微升蛋白质透析到50毫升透析液中。对于AcrB，将250微升蛋白质透析至25微升透析液中。LacY结晶也以相同的比例设置，用100微升蛋白质与10毫升透析液。当将板倒置到缓冲液面朝上时，重要的是要注意A1的位置，以便可以相应地分配来自结晶筛的溶液。从该方法获得的晶体可用于下游应用，例如连续晶体学和微ED。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

方法确定HCN1和TRIP8b之间蛋白 - 蛋白相互作用的小分子抑制剂

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