Krystallisering ved dialyse er en underudnyttet metode. Denne protokol præsenterer en Novo-tilgang til dette, hvilket vil øge rækken af krystalliseringsstrategier, der i øjeblikket er tilgængelige til struktureret bestemmelse. De største fordele ved denne teknik er, at den er høj gennemstrømning, enkel at konfigurere uden behov for specialudstyr og muliggør nem overvågning af krystalvækst.
Den person, der udfører denne teknik, skal være fortrolig med pipettering med lav volumen og brug af multikanalpipetter. Dråberne skal pipetteres så tilstrækkeligt som muligt til at forhindre delvis dehydrering. For at oprette mikrodialyseeksperimentet skal du placere en kommercielt tilgængelig mikrodialyseplade med 96 brønde i proteinsiden opad og fjerne klæbebåndet ved at skrælle 200 mikron trykklæbeafstandsstykket af.
Når du har skrællet klæbebåndet af, skal du notere placeringen af brønd A1. Brug derefter en flerkanalpipette til at indlæse maksimalt 3,2 mikroliter korrekt forberedt proteinprøve i hver brønd. Placer UV-dækfilmen på 200 mikron korrekt over 96-brøndspladen med filmen opad. For at aktivere og forsegle trykklæbemidlet skal du derefter trykke ned på UV-dækfilmen ved hjælp af en tætningspadle og kontrollere dens integritet.
Vend nu pladen om for at bringe den til buffersiden opad, og noter dig den spejlede position af den markerede brønd A1. Brug en flerkanalspipette til at indlæse maksimalt 350 mikroliter dialyseopløsning i hver brønd på pladen og forsegle brøndene forsigtigt med reservoirdækfilmen. Placer derefter pladen i buffersiden opad orientering inde i en passende temperaturstyret inkubator ved 20 grader Celsius for at tillade krystalvækst. For at undersøge krystaldannelse under mikroskopet skal du fjerne beskyttelsesdækfilmen fra 200 mikron UV-dækfilmen og placere pladen under okularet med proteinsiden opad.
For at oprette et storstilet krystalliseringseksperiment skal du vedtage de betingelser, hvor mikrokrystalvækst forekom i mikrodialysepladen og replikere de samme betingelser i store beholdere. Vælg beholderstørrelsen afhængigt af dialyseopløsningens volumen. Der pipetteres et maksimalt volumen på 500 mikroliter proteinprøve ind i dialysatorrøret, inden røret forsegles ved hjælp af den røde plastikhætte.
Anbring det forseglede 500 mikroliter dialysatorrør i det flydende stativ inde i beholderen fyldt med dialyseopløsning. Placer derefter beholderen uforstyrret inde i en passende temperaturstyret inkubator ved 20 grader Celsius for at opnå krystalvækst. For at kontrollere dannelsen af krystaller, pipette en til to mikroliter af opløsningen fra dialysatoren på et glasdæksel.
Dæk opløsningen på diaset med et andet glasglas og se det under et mikroskop. Billeder taget ved hjælp af et stereomikroskop med høj forstørrelse viste vellykket mikrokrystaldannelse af fire proteiner ved hjælp af mikrodialysepladerne med 10-kilodalton molekylvægt afskæringsmembraner. Lysozym viste sig at danne krystaller, når det dialyseres mod 0,1 molært natriumacetat ved pH 4 indeholdende passende additiver.
Domatin dannede krystaller, når de dialyseres mod 0,1 molær bis-tris propan ved pH 6,6 indeholdende passende additiver. Optimerede dialysebetingelser førte til mikrokrystaldannelse af membranproteinerne, nemlig E. coli multidrug effluxpumpeproteinet AcrB og E. coli lactosetransportøren LacY. Storskala krystallisering i dialysatorrørene, der anvender de optimerede dialysebetingelser opnået fra mikrodialyseeksperimenterne, førte til dannelsen af tusindvis af mikrokrystaller for hvert af proteinerne.
Til krystallisation af fomitin blev 250 mikroliter protein dialyseret mod 50 ml dialyseopløsning. For AcrB blev 250 mikroliter af proteinet dialyseret mod 25 mikroliter dialyseopløsning. LacY-krystalliseringen blev også oprettet i samme forhold med 100 mikroliter protein til 10 ml dialyseopløsning.
Når pladen vendes om på buffersiden opad, er det vigtigt at notere placeringen af A1, så opløsninger fra krystalliseringsskærmen kan dispenseres i overensstemmelse hermed. Krystallerne opnået ved denne metode kan anvendes til downstream-applikationer, såsom seriel krystallografi og mikro-ED.
