Name: high-throughput protein crystallization via microdialysis
Uploaded: 2023-03-03T14:05:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis at JoVE.com

Vi anerkender finansiering fra Storbritanniens Department of Business, Energy and Industrial Strategy (BEIS). Vi takker Alex R. Jones og Mike Shaw fra National Physical Laboratory for deres feedback på manuskriptet.

1. Forberedelse af proteinprøver
<ol><li>Forbered (gennem rekombinante metoder eller på anden måde) og rens proteinet / proteinerne af interesse i en passende buffer (dvs. en, der er modtagelig for proteinstabilitet og krystallisering), der er blevet filtreret med et 0,22 μm filter (se materialetabel). Evaluer proteinkvaliteten (med hensyn til renhed, polydispersitet og stabilitet) før krystallisation31. BEMÆRK: Se afsnittet om repræsentative resultater for detaljer om de proteiner og buffere, der anvendes i denne undersøgelse.</li>
	<li>Koncentrer prøven op til 10-50 mg.mL-1 eller højere (afhængigt af proteinmålet) ved hjælp af den korrekte MWCO-koncentrator (se materialetabellen). BEMÆRK: Den koncentrerede prøve kan straks anvendes til krystallisation eller opbevares frosset ved -80 °C.</li>
	<li>Hvis proteinet har været frosset, centrifugeres prøven i 10 minutter i en bordcentrifuge (≥16.000 × g ved stuetemperatur eller 4 °C) til pellet og fjernes uønsket materiale (f.eks. bundfald).</li>
	<li>Alikvote proteinet i rene 200 μL PCR-rør. Opbevar det på is eller ved 4 °C, hvis proteinet er ustabilt ved stuetemperatur.</li>
</ol>2. Opsætning af mikrodialysepladen
BEMÆRK: Den kommercielt tilgængelige mikrodialyseplade (se materialetabellen) består af to sider ('proteinsiden' og 'buffersiden') med en regenereret cellulosemembran (tilgængelig i forskellige MWCO'er), som vist i figur 2.
<ol><li>Med den pladeorienterede proteinside opad trækkes klæbetapen (figur 2A) tilbage og fjernes fra 200 μm trykklæbende afstandsstykke. Vær opmærksom på placeringen af brønd A1.</li>
	<li>Brug en multikanalpipette til at fylde maksimalt 3,2 μL protein (trin 1.4) i hvert hul (figur 2B). BEMÆRK: Proteinet kan også fyldes ved hjælp af en pipette til gentagen dispensering. Det er muligt at bruge en enkeltkanalpipette, men det vil øge sandsynligheden for delvis dehydrering af dråberne, der opstår på grund af den forlængede belastningstid.</li>
	<li>Placer UV-dækfilmen på 200 μm (se materialetabellen) over 96-brøndspladen, og kontroller dens integritet (figur 2C). Sørg for, at beskyttelsesfilmen vender opad.</li>
	<li>Brug en tætningspadle (se materialetabellen), tryk UV-dækfilmen ned for at aktivere og forsegle trykklæberen.</li>
	<li>Vend pladen om, og noter placeringen af brønd A1. Sørg for, at pladen vender med puffersiden opad, og at brøndpositionerne spejles (figur 2D).</li>
	<li>Brug en multikanalpipette til at fylde maksimalt 350 μL af dialyseopløsningen i hvert af hullerne (figur 2D). BEMÆRK: I dette trin kan enten kommercielt tilgængelige krystalliseringsskærme (sparsomme matrixskærme) eller laboratoriefremstillede tilpassede skærme (gitterskærme) bruges (se materialetabel).</li>
	<li>Brøndene forsegles forsigtigt med "reservoirdækfilmen" (se materialetabellen) (figur 2E).</li>
	<li>Pladen (buffersiden opad) anbringes i en egnet temperaturstyret inkubator (20 °C) til krystalvækst. BEMÆRK: For de proteiner, der blev udvalgt til denne undersøgelse, begyndte krystallerne at fremstå mellem 1-8 timer ved 20 °C.</li>
	<li>For at inspicere for krystaller under mikroskopet vendes pladen på hovedet, så proteinsiden føres opad, og beskyttelsesfilmen fjernes fra 200 μm UV-dækfilmen (trin 2.3), som vist i figur 2F,G.</li>
</ol>3. Storskala krystallisation ved hjælp af dialysatorrør
BEMÆRK: Når krystalliseringsbetingelserne er undersøgt ved hjælp af mikrodialysepladen, kan storskalakrystallisation af proteinet (til seriel krystallografi eller andre formål) udføres ved hjælp af dialysatorrøret, som vist i figur 3. I lighed med mikrodialysepladen fås disse enheder med 3, 5, 10 og 30 kDa MWCO dialysemembraner.
<ol><li>Forbered den optimerede krystallisationstilstand for vækst af mikrokrystaller i store beholdere (vedtagelse af betingelserne optimeret ved hjælp af mikrodialysepladen). Sørg for, at bufferen tidligere er blevet filtreret med et 0,2 μm filter.</li>
	<li>Pipetter proteinet ind i dialysatorrøret (maksimalt volumen på 0,5 ml) og forsegl enden ved hjælp af den medfølgende røde plasthætte (figur 3A).</li>
	<li>500 μL dialysatorrøret anbringes i en beholder af passende størrelse (afhængigt af det samlede volumen dialyseopløsning), der indeholder flydestativet (se materialetabellen), som vist i figur 3B. BEMÆRK: Det flydende stativ, der følger med dialysatorsættet, rummer op til 18 dialysatorrør samtidigt.</li>
	<li>Beholderen anbringes stille i en egnet temperaturstyret inkubator (20 °C) til krystalvækst.</li>
	<li>For at inspicere for krystaller pipetteres 1-2 μL af opløsningen på et glasdækselglas. Dæk med et andet glasdæksel glide ovenpå (for at forhindre overskydende dehydrering) og se under et mikroskop (se materialetabel). BEMÆRK: Krystaller kan blive beskadiget, når de klemmes mellem to glasdæksler under inspektionen. Krystaller kan også ses direkte ved at placere dialysatorrøret under et stereomikroskop med høj forstørrelse.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brooks-Bartlett, J. C., Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nobel+science:+One+hundred+years+of+crystallography.">The nobel science: One hundred years of crystallography.</a> Interdisciplinary Science Reviews. 40 (3), 244-264 (2015).</li><li>Maveyraud, L., Mourey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+X-ray+crystallography+and+drug+discovery.">Protein X-ray crystallography and drug discovery.</a> Molecules. 25 (5), (2020).</li><li>Kwan, T. O. C., Axford, D., Moraes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+crystallography+in+the+era+of+modern+structural+biology.">Membrane protein crystallography in the era of modern structural biology.</a> Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2505-2524 (2020).</li><li>Birch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+art+of+integral+membrane+protein+crystallisation.">The fine art of integral membrane protein crystallisation.</a> Methods. 147, 150-162 (2018).</li><li>Gorrec, F., L&#246;we, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protocols+for+macromolecular+crystallization+at+the+MRC+laboratory+of+molecular+biology.">Automated protocols for macromolecular crystallization at the MRC laboratory of molecular biology.</a> Journal of Visualized Experiments. 131 (131), (2018).</li><li>Govada, L., Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+method+of+crystallization+to+obtain+optimal+results.">Choosing the method of crystallization to obtain optimal results.</a> Crystals. 9 (2), 106 (2019).</li><li>Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+protein+crystallisation+from+an+art+into+science.">Turning protein crystallisation from an art into science.</a> Current Opinion in Structural Biology. 14 (5), 577-583 (2004).</li><li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li><li>Gulbis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallography:+methods+and+protocols.">Protein crystallography: methods and protocols.</a> Crystallography Reviews. 24 (2), 136-143 (2018).</li><li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization:+What+have+we+learned.">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned.</a> Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 70 (9), 1117-1126 (2014).</li><li>Shaw Stewart, ., D, P., Kolek, S. A., Briggs, R. A., Chayen, N. E., Baldock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+microseeding:+a+theoretical+and+practical+exploration+of+seed+stability+and+seeding+techniques+for+successful+protein+crystallization.">Random microseeding: a theoretical and practical exploration of seed stability and seeding techniques for successful protein crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Junius, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+both+on-chip+dialysis+protein+crystallization+and+in+situ+X-ray+diffraction.">A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction.</a> Lab on a Chip. 20 (2), 296-310 (2020).</li><li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control.">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), 686-698 (2020).</li><li>Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystal+growth+for+neutron+macromolecular+crystallography.">Optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. 169, (2021).</li><li>Jaho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+proteins+on+chip+by+microdialysis+for+in+situ+X-ray+diffraction+studies.">Crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ X-ray diffraction studies.</a> Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, 2501 (2011).</li><li>Ujwal, R., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+using+the+lipidic+bicelle+method.">High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method.</a> Journal of Visualized Experiments. 59, (2012).</li><li>Parker, J. L., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+crystallisation:+Current+trends+and+future+perspectives.">Membrane protein crystallisation: Current trends and future perspectives.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 922. , 61-72 (2016).</li><li>Apostolopoulou, V., Junius, N., Sear, R. P., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing+salts+and+polyethylene+glycol+into+protein+solutions:+The+effects+of+diffusion+across+semi-permeable+membranes+and+of+convection.">Mixing salts and polyethylene glycol into protein solutions: The effects of diffusion across semi-permeable membranes and of convection.</a> Crystal Growth &amp; Design. 20 (6), 3927-3936 (2020).</li><li>Neutze, R., Wouts, R., Vander Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+biomolecular+imaging+with+femtosecond+X-ray+pulses.">Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses.</a> Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).</li><li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography.">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-78 (2011).</li><li>Mizohata, E., Nakane, T., Fukuda, Y., Nango, E., Iwata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography+at+the+SACLA:+breakthrough+to+dynamic+structural+biology.">Serial femtosecond crystallography at the SACLA: breakthrough to dynamic structural biology.</a> Biophysical Reviews. 10 (2), 209-218 (2018).</li><li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation.">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).</li><li>Johansson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XFEL+structures+of+the+human+MT2+melatonin+receptor+reveal+the+basis+of+subtype+selectivity.">XFEL structures of the human MT2 melatonin receptor reveal the basis of subtype selectivity.</a> Nature. 569 (7755), 289-292 (2019).</li><li>Owen, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+fixed-target+serial+synchrotron+crystallography.">Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (4), 373-378 (2017).</li><li>Weinert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+millisecond+crystallography+for+routine+room-temperature+structure+determination+at+synchrotrons.">Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons.</a> Nature communications. 8 (1), 542 (2017).</li><li>Axford, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+states+of+a+light-sensitive+membrane+protein+captured+at+room+temperature+using+thin-film+sample+mounts.">Two states of a light-sensitive membrane protein captured at room temperature using thin-film sample mounts.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 52-58 (2022).</li><li>Nannenga, B. L., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cryo-EM+method+microcrystal+electron+diffraction+(MicroED).">The cryo-EM method microcrystal electron diffraction (MicroED).</a> Nature Methods. 16 (5), 369-379 (2019).</li><li>Nguyen, C., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+protein+structure+determination+with+MicroED.">Beyond protein structure determination with MicroED.</a> Current Opinion in Structural Biology. 64, 51-58 (2020).</li><li>Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+microcrystal+electron+diffraction+(MicroED).">An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED).</a> Annual Review of Biochemistry. 90, 431-450 (2021).</li><li>Kwan, T. O. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+biophysical+methods+for+characterisation+of+membrane+proteins.">Selection of biophysical methods for characterisation of membrane proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 2605 (2019).</li><li>Pos, K. M., Purification Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=crystallization+and+preliminary+diffraction+studies+of+AcrB,+an+inner-membrane+multi-drug+efflux+protein.">crystallization and preliminary diffraction studies of AcrB, an inner-membrane multi-drug efflux protein.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (10), 1865-1867 (2002).</li><li>Guan, L., Mirza, O., Verner, G., Iwata, S., Kaback, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+wild-type+lactose+permease.">Structural determination of wild-type lactose permease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (39), 15294-15298 (2007).</li><li>Kwan, T. O. C., Reis, R., Moraes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+measurements+of+polypeptide+samples+by+dynamic+light+scattering:+membrane+proteins,+a+case+study.">In situ measurements of polypeptide samples by dynamic light scattering: membrane proteins, a case study.</a> Methods in Molecular Biology. , 189-202 (2021).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Wickstrand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tool+for+visualizing+protein+motions+in+time-resolved+crystallography.">A tool for visualizing protein motions in time-resolved crystallography.</a> Structural Dynamics. 7 (2), 024701 (2020).</li><li>Orville, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+results+in+time+resolved+serial+femtosecond+crystallography+at+XFELs.">Recent results in time resolved serial femtosecond crystallography at XFELs.</a> Current Opinion in Structural Biology. 65, 193-208 (2020).</li><li>Schulz, E. C., Yorke, B. A., Pearson, A. R., Mehrabi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+time-resolved+serial+synchrotron+crystallography.">Best practices for time-resolved serial synchrotron crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 14-29 (2022).</li><li>Neutze, R., Br&#228;nd&#233;n, G., Schertler, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+structural+biology+using+X-ray+free+eletron+lasers.">Membrane protein structural biology using X-ray free eletron lasers.</a> Current Opinion in Structural Biology. 33, 115-125 (2015).</li><li>Wierstall, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+sample+delivery+techniques+for+serial+femtosecond+crystallography.">Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).</li><li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals.">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345 (2013).</li></ol>

Medforfatterne Pascelle Draper og Paul Reardon er ansat af SWISSCI.

I øjeblikket er krystallisering ved dialyse den mest underudnyttede krystalliseringsmetode, nemlig på grund af den lave gennemstrømning og kedelige karakter af de eksisterende tilgange, såsom mikrodialyse med knapper. Her følger en enkel, men robust protokol en HTP-arbejdsgang for proteinkrystalvækst ved dialyse gennem en kommercielt tilgængelig mikrodialyseplade og dialyserør. Afhængigt af målproteinet leveres mikrodialysepladen og dialysatorrøret, der anvendes i proceduren, med et valg af en dialysemembran med en 3, 5, 10 eller 30 kDa MWCO. Protokollen kan let opsættes i enhver standard krystalliseringsfacilitet og har den store fordel, at den kan anvendes på både opløselige proteiner og membranproteiner. Imidlertid blev protein-protein og protein-nukleinsyrekomplekser ikke testet under denne protokol.
Som i enhver krystalliseringsmetode ved dialyse er volumenforholdet mellem proteinprøven og dialyseopløsningen kritisk. I denne protokol anbefales et forhold på 1:100 mellem prøven og dialyseopløsningen, men da mikrodialysepladen tillader en maksimal kapacitet på 350 μL dialyseopløsning, kan disse forhold undersøges for at opnå krystalhits. Et volumen på 1-2 μL protein anvendes i den præsenterede protokol ved opsætning af krystallisationsplader. Dette er for at sikre, at dråber indstilles nøjagtigt med en manuel multikanalpipette. Ved at bruge elektroniske pipetter (multikanals eller gentagne dispenseringspipetter) eller HTP-væskedispenseringsrobotter kan dråber med lavere volumener opnås nøjagtigt, hvilket sænker den nødvendige mængde protein. På grund af de relativt lave mængder dialysebuffer, der kræves af mikrodialysepladen (i modsætning til andre konventionelle dialysemetoder), er det desuden muligt (uden omfattende brug af ressourcer) at udforske store kemiske rum, ikke kun ved hjælp af kommercielt tilgængelige krystalliseringsskærme, men også med optimeringsskærme (designet omkring den oprindelige krystalliseringstilstand).
Et kritisk trin i den præsenterede HTP-procedure er rettidig anvendelse af små proteinvolumener (0.50-3.2 μL pr. Tilstand) til dialysepladen for at begrænse dehydrering og prøvetab. Dette kan let afhjælpes ved hjælp af en multikanalpipette, en gentagen dispenseringspipette eller et robotkrystalliseringssystem. Den lange inkubationstid, såsom mere end 2 uger, af pladerne ved 20 °C kan føre til dehydrering af proteindråberne eller beskadigelse af de nyligt dannede krystaller. Opbevaring af dialysepladerne inde i et befugtningskammer eller en forseglbar pose kan lindre denne effekt. Derudover anbefales det at bruge sterile materialer og teknikker for at undgå bakterievækst.
Som nævnt i indledningen er området for proteinrøntgenkrystallografi for nylig blevet revolutioneret gennem udvikling af nye og eksisterende krystalliseringsteknikker, moderne tilgange til levering af krystalprøver, nye generationer af røntgenkilder og nye sofistikerede metoder til dataindsamlingog behandling 36 ,37,38. Derfor har fremkomsten af stuetemperatur seriel mikrokrystallografi, enten udført ved hjælp af XFEL'er eller synkrotronlyskilder, vist sig at være et bemærkelsesværdigt værktøj inden for strukturel biologi, specifikt inden for membranproteiner39. Imidlertid kræves tusindvis af mikrokrystaller for at generere nok data til en robust strukturløsning, hvilket ikke er en let opgave (i det mindste ved konventionelle krystalliseringsmetoder). Dialysekrystalliseringsmetoden, der er beskrevet her, muliggør produktion af et stort antal mikrokrystaller. Når krystallisationsbetingelsen for fremstilling af mikrokrystaller (1-10 μm) er blevet bestemt ved anvendelse af en mikrodialyseplade, kan der fremstilles store mængder mikrokrystaller med høj densitet ved hjælp af 0,5 ml dialysatoranordningen (figur 5). Disse krystaller er ideelle til dataindsamling ved hjælp af faste mål eller flydende jetprøveleveringssystemer 27,40. Krystaller opnået ved denne metode kan også være passende til MicroED-applikationer. Det kan dog være nødvendigt at fræse disse ned til en passende størrelse og tykkelse til denne specifikke anvendelse, da elektroner interagerer meget stærkere med krystaller end røntgenfotoner41.
Afslutningsvis tilføjer krystalliseringen ved dialysetilgang, der er beskrevet her, de udviklende strategier inden for proteinkrystallisering til strukturbestemmelse og udvider spektret af indsatser, der kan anvendes til at bestemme nye proteinmål, der tidligere har været mislykkede med andre konventionelle metoder.

I løbet af det sidste århundrede har røntgenkrystallografi været afgørende for at belyse og forstå struktur-funktionsparadigmet for biologiske makromolekyler. Til dato er det fortsat en af de mest succesrige metoder til at belyse atomopløsningsstrukturer af mange unikt forskellige proteiner, der er afgørende for den grundlæggende forståelse af cellebiokemi, medicin og tidlig lægemiddelopdagelse 1,2. Imidlertid forbliver proteinkrystallisering en flaskehals i studiet af mange proteinmål, især membranproteiner og store proteinkomplekser3. Derfor betragtes proteinkrystallisation næsten altid som en kunst på grund af de arbejdskrævende trial-and-error-tilgange, der anvendes 4,5,6.
Et udfældningsmiddel tilsættes sædvanligvis til en proteinopløsning ved høj koncentration for at danne et velordnet, regelmæssigt og gentagende gitterarrangement af proteinmolekyler, kendt som krystaller. Under gunstige betingelser, såsom temperatur, pH, koncentration og bundfaldsmiddel, dannes der til sidst en overmættet opløsning efterfulgt af krystalkimdannelse og vækst 7,8. Selvom der har været mange fremskridt inden for krystalliseringsforsøgsopsætninger, overvejende med udviklingen af robotsystemer med høj kapacitet og tilgængeligheden af færdige "sparsomme matrix" -skærme, har de generelle tilgange til proteinkrystallisering stort set været uændrede gennem årene. Almindelige eksperimentelle proteinkrystalliseringsteknikker inkluderer dampdiffusion (hængende dråbe og siddende dråbe)9, mikrobatch (under olie)10,11, diffusion med fri grænseflade (mikrofluidiske enheder)12 og dialyse (ved hjælp af knapper og andre teknikker)13,14,15. Imidlertid findes der også andre mere specialiserede opsætninger, såsom mesofasemetoder til krystallisering af membranproteiner16,17. Mens størstedelen af røntgenproteinstrukturer deponeret i proteindatabanken hidtil er blevet løst gennem krystallisering ved dampdiffusionsmetoder 6,18, synes andre tilgange, såsom krystallisering ved dialyse, at være underudnyttede, sandsynligvis på grund af de praktiske aspekter relateret til deres eksperimentelle opsætning.
Krystallisering ved dialyse er simpelthen afhængig af langsom diffusion af opløste stoffer (bundfældningsmidler, ioner, additiver og buffere) gennem en semipermeabel membran, der samtidig forhindrer proteinmolekyler i at cirkulere. På denne måde bringes proteinopløsningen langsomt i ligevægt, hvor bundfaldet når den nødvendige koncentration til krystallisering. Systemets kinetik afhænger af temperatur, udfældningskoncentration og cellulosemembranens molekylvægtsafskæring (MWCO)19. Til dato har den mest populære krystalliseringsopsætning ved dialyse været at bruge mikrodialyseknapper lavet af gennemsigtige akrylplader. Disse nedsænkes normalt i reservoirer (for det meste ved hjælp af dampdiffusionshængende dråbeplader), der indeholder krystallisationsfældningsopløsningerne. Denne metode med lavere kapacitet kræver imidlertid også specifik samling for at forsegle proteinopløsningen i dialysemembranen placeret over knapkammeret, som illustreret i figur 1. Desuden er luftbobler fanget mellem dialysemembranen og proteinopløsningen et hyppigt problem, der forringer krystalvækst. En anden begrænsning ved metoden er prøvekravene, hvorved meget højere koncentrationer og volumener er nødvendige sammenlignet med dampdiffusionsmetoder for at imødekomme dialyseknapperne. Derfor er krystallisering ved hjælp af mikrodialyseknapper blevet opfattet som en utiltalende metode, især for vanskelige mål som membranproteiner, hvis rensningsudbytter er frustrerende lave. For nylig er mikrofluidiske enheder blevet udviklet til at lette proteinkrystallisation ved dialyse15. Disse chips er også designet til at have høj røntgengennemsigtighed med lav baggrund, hvilket gør det muligt at bruge chipsene til in situ-dataindsamling ved stuetemperatur, hvilket eliminerer besværet ved høst og kryokøling af krystaller. På trods af disse fremskridt er tilgangen stadig meget lav gennemstrømning og dyr.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk gengivelse af krystallisering ved dialyse ved hjælp af dialyseknapper. (A) Skematisk gengivelse af en krystalliseringsdialyseknap. (B) Proteinopløsningen tilsættes til mikrodialyseknapkammeret. (C) Dialysemembranen holdes fast på mikrodialyseknappen ved hjælp af en gummiring (O-ring), der påføres via en applikator. D) Dialyseknappen er klar til at blive nedsænket i beholderen indeholdende krystallisationsopløsningen (dialyseopløsning) som vist i punkt E. Hætteglasset med knappen til nedsænkning i dialyse skal være forseglet for at undgå fordampning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Her præsenteres en ligetil protokol til screening af proteinkrystalliseringsbetingelser og krystalvækst ved hjælp af dialysepladen med 96 brønde med høj kapacitet. Disse engangsplader er konstrueret til at blive brugt på samme måde som dampdiffusionskrystallisationspladerne (pipette derefter forsegling), som vist i figur 2. Pladerne kan rumme op til 3,2 μL protein og 350 μL dialyseopløsning. Hver brønd har en separat regenereret cellulosemembran for at forhindre krydskontaminering mellem brøndene. Opsætningen tager ca. 10 minutter at gennemføre og kræver ikke noget specialudstyr udover hvad der findes i alle standardkrystalliseringslaboratorier. Fire forskellige proteiner, herunder to membranproteiner, bruges til at demonstrere og validere denne tilgang som en effektiv metode til high-throughput (HTP) proteinkrystallografi.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig02.jpg"> Figur 2: Krystalliseringsproces ved hjælp af mikrodialysepladen. (A) Fjernelse af den røde klæbende "dækfilm". (B) Dispensering af proteindråberne i hver af dråbehullerne. (C) Brøndene er dækket af UV "dækfilm". (D) Pladen vendes på hovedet, så dialyseopløsningerne (eller krystalliseringsskærmen) tilsættes. E) Pladen forsegles og inkuberes. (F,G) Mikroskopinspektion af dråberne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Anvendelsen af denne krystallisering ved dialyseprotokol blev demonstreret ved anvendelse af 0,5 ml dialysatorrøret (figur 3) til storskala (hundreder til tusinder) produktion af mikrokrystaller, egnet til state-of-the-art dataindsamlingsmetoder såsom seriel krystallografi på begge XFEL-faciliteter 20,21,22,23,24 og synkrotroner25,26,27 , samt for MicroED28,29,30 tilgange.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig03.jpg"> Figur 3: Storskala mikrodialysekrystallisation ved hjælp af dialysatorrøret. (A) Skematisk gengivelse af 0,5 ml dialysatorrøret. B) Set fra siden af et bægerglas indeholdende krystallisationsopløsningen og det flydende rørstativ, der indeholder et dialysatorrør. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0620</td>
			<td>For aliquoting protein solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>17823----------K</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate filters. For filtering dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSTF04700</td>
			<td>Membrane filters for filtering large volumes of buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 0.5 &#8211; 10 &#181;L Research plus pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000028</td>
			<td>For dispensing protein drops onto the Diaplate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 30 &#8211; 300 &#181;L Eppendorf Research plus pipette&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000060</td>
			<td>For dispensing dialysis solutions on the Diaplate reservoirs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15889152</td>
			<td>For use with syringe filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2.2 mL deep-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0788</td>
			<td>Polypropylene deep-well storage plates; for preparing screens using the Hamilton Microlab STARlet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000565</td>
			<td>With rotor FA-24x2 with a maximum g-force of 21,300 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diacon dialyser</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W72010</td>
			<td>Dialyzer tubes with a regenerated cellulose membrane with a molecular weight cut-off of 10 kDa. Ideal for protein solutions of up to 0.5 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaplate 96-well plate</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W82010</td>
			<td>Microdialysis plate. The Diaplate consists of two sides with a regenerated cellulose membrane in-between with a molecular weight cut-off of 10 kDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For holding dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating rack</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diacon kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor-standing vibration-free incubator</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD5-01</td>
			<td>400 L temperature-controlled incubator set to 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 C stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Planapo 1.0x objective, 7.8x &#8211; 160x zoom range with DMC 4500 camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memgold2</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-64</td>
			<td>Sparse-matrix screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlab STARlet</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable bottle top filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>DS0320-5045</td>
			<td>For fitering large volumes of buffers, for use with 0.22 &#181;m membrane filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing paddle</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput protein crystallization via microdialysis

Forståelse af struktur-funktionsforholdet mellem makromolekyler, såsom proteiner, på molekylært niveau er afgørende for biomedicin og moderne lægemiddelopdagelse. Til dato er røntgenkrystallografi fortsat den mest succesrige metode til løsning af tredimensionelle proteinstrukturer ved atomopløsning. Med de seneste fremskridt inden for seriel krystallografi, enten ved hjælp af røntgenfrie elektronlasere (XFEL'er) eller synkrotronlyskilder, har proteinkrystallografi udviklet sig til den næste grænse, hvor evnen til at erhverve tidsopløste data giver vigtig mekanistisk indsigt i biologiske molekylers opførsel ved stuetemperatur. Denne protokol beskriver en ligetil HTP-arbejdsgang (high-throughput) til screening af krystalliseringsbetingelser ved brug af en 96-brønds dialyseplade. Disse plader følger Society for Biomolecular Screening (SBS) standard og kan let opsættes ved hjælp af ethvert standard krystalliseringslaboratorium. Når optimale forhold er identificeret, kan store mængder krystaller (hundredvis af mikrokrystaller) fremstilles ved hjælp af dialysatoren. For at validere robustheden og alsidigheden af denne tilgang blev fire forskellige proteiner krystalliseret, herunder to membranproteiner.

Fire proteiner blev krystalliseret ved hjælp af mikrodialysepladen (med 10 kDa MWCO-membraner), herunder to membranproteiner. Kyllingens æggehvide lysozym fra det frysetørrede pulver (se materialetabel) blev fremstillet ved 50 mg.mL-1 i 20 mM NaOAc (pH 4,5), og det frysetørrede thaumatin (se materialetabel) blev opløst i vand til en endelig koncentration på 25 mg.mL-1. De to membranproteiner, der blev anvendt i denne undersøgelse, var E. coli multidrug effluxpumpen AcrB og E. coli lactosetransportøren LacY. AcrB blev udtrykt ved hjælp af C43 (DE3) celler og oprenset ved Ni-NTA affinitetskromatografi og størrelsesudelukkelseskromatografi i 10 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl, 0,03% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltosid (DDM) og 5% (v/v) glycerol32. Derefter blev proteinet koncentreret under anvendelse af en 100 kDa MWCO centrifugalkoncentrator til en endelig koncentration på 6 mg.mL-1. LacY blev også udtrykt i C43 (DE3) celler, renset ved Ni-sepharose affinitetskromatografi efterfulgt af størrelsesekskluderende kromatografi i 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,03% (w/v) DDM og koncentreret under anvendelse af en 100 kDa MWCO koncentrator til 10 mg.mL-1 4,33.
For lysozym- og thaumatinproteinerne blev mikrodialysepladen med 96 brønde fyldt med en krystalliseringsgitterskærm fremstillet internt som dialyseopløsningen, mens der for membranproteinet AcrB blev fremstillet en gitterskærm internt ud fra en tidligere offentliggjort krystalliseringstilstand34. For LacY blev de første hitbetingelser fundet fra en kommerciel skærm (se materialetabel) og yderligere optimeret med en gitterskærm lavet internt. Krystallisationsdråbeforholdet for lysozym, thaumatin og AcrB var 1:100, med 2 μL protein til 200 μL bundfald (dialyseopløsning). LacY-krystalliseringsdråber var også i forholdet 1:100 med 1 μL protein til 100 μL dialyseopløsning på grund af en lavere mængde tilgængeligt protein.
Krystaller fra alle fire proteiner, herunder membranproteinerne, begyndte at dukke op mellem 1-8 timer ved 20 °C efter opsætning med mikrodialysepladen. I dette tilfælde var det ikke nødvendigt at supplere dialyseopløsningen med vaskemiddel til membranproteinkrystalliseringen, typisk udført under standarddialyseprocessen for at forhindre membranproteinaggregering, da vaskemiddelmicellerne forventedes at være større end MWCO for dialysemembranerne35.
Efter den vellykkede krystallisering af proteinerne på mikrodialysepladen (figur 4) blev krystalliseringsbetingelser noteret, og storskala krystallisation ved dialyse blev udført under anvendelse af dialyserrøret med de samme 10 kDa MWCO-dialysemembraner. Tusindvis af mikrokrystaller for hvert af de enkelte proteiner voksede inde i dialysatoren, som vist i figur 5. Til thaumatinkrystallisation blev 250 μL protein lagt på dialysatoren og dialyseret mod 50 ml (1:200 forhold). For AcrB blev 250 μL protein dialyseret mod 25 ml dialyseopløsning (1:100). LaCy-krystallisering blev også oprettet i samme forhold med 100 μL protein til 10 ml dialyseopløsning.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig04.jpg"> Figur 4: Krystaller dyrkes ved dialyse ved hjælp af mikrodialysepladen. Protokollen demonstrerer anvendeligheden af opsætningen med opløselige proteiner: (A) Lysozym blev dialyseret mod 0,1 M NaOAc (pH 4,0), 0,5 M NaCl og 25% (v / v) glycerol. (B) Thaumatin blev dialyseret mod 0,1 M bis-tris propan (pH 6,6), 1 M K/Na-tartrat og 18% (v/v) ethylenglycol. Krystaller blev også opnået for membranproteiner: (C) AcrB blev dialyseret mod 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl og 20% (v / v) PEG-400. (D) LacY blev dialyseret mod 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl og 32% (v/v) PEG-300. Billeder blev taget ved hjælp af et stereomikroskop med høj forstørrelse med en krydspolarisator. Skalastænger: (A, B, D) = 1 mm; (C) = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig05.jpg"> Figur 5: Repræsentative billeder af membranproteinkrystaller dyrket ved dialyse ved hjælp af dialysatorrøret. (A) Billede, der viser røret fuldt af mikrokrystaller (angivet med den sorte pil). (B) Mikroskopisk billede af 2 μL fra en opslæmning af thaumatinkrystaller dyrket ved dialyse under anvendelse af 0,5 ml dialyserrøret, dialyseret mod 0,1 M Bis-Tris propan (pH 6,6), 1,4 M K/Na-tartrat og 18% (v/v) ethylenglycol. (C) Dark-field (venstre) og bright-field (højre) billeder af AcrB mikrokrystaller dyrket ved dialyse mod 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl og 20% (v/v) PEG-400. (D) Dark-field (venstre) og bright-field (højre) billeder af LacY-mikrokrystaller dyrket ved dialyse mod 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl og 32% (v/v) PEG-300. Nogle bundfald observeres. Skalastænger: (B,D) = 200 μm; (C) = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis at JoVE.com

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Den præsenterede protokol beskriver en ligetil tilgang til screening af proteinkrystalliseringsbetingelser og krystalvækst ved hjælp af en 96-brønds dialyseplade med høj kapacitet. Anvendelsen af dialysatorrør til storskala vækst af mikrokrystaller er også demonstreret til seriel krystallografi og MicroED-applikationer.

High-throughput proteinkrystallisering via mikrodialyse

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

Krystallisering ved dialyse er en underudnyttet metode. Denne protokol præsenterer en Novo-tilgang til dette, hvilket vil øge rækken af krystalliseringsstrategier, der i øjeblikket er tilgængelige til struktureret bestemmelse. De største fordele ved denne teknik er, at den er høj gennemstrømning, enkel at konfigurere uden behov for specialudstyr og muliggør nem overvågning af krystalvækst.Den person, der udfører denne teknik, skal være fortrolig med pipettering med lav volumen og brug af multikanalpipetter. Dråberne skal pipetteres så tilstrækkeligt som muligt til at forhindre delvis dehydrering. For at oprette mikrodialyseeksperimentet skal du placere en kommercielt tilgængelig mikrodialyseplade med 96 brønde i proteinsiden opad og fjerne klæbebåndet ved at skrælle 200 mikron trykklæbeafstandsstykket af.Når du har skrællet klæbebåndet af, skal du notere placeringen af brønd A1. Brug derefter en flerkanalpipette til at indlæse maksimalt 3,2 mikroliter korrekt forberedt proteinprøve i hver brønd. Placer UV-dækfilmen på 200 mikron korrekt over 96-brøndspladen med filmen opad. For at aktivere og forsegle trykklæbemidlet skal du derefter trykke ned på UV-dækfilmen ved hjælp af en tætningspadle og kontrollere dens integritet.Vend nu pladen om for at bringe den til buffersiden opad, og noter dig den spejlede position af den markerede brønd A1. Brug en flerkanalspipette til at indlæse maksimalt 350 mikroliter dialyseopløsning i hver brønd på pladen og forsegle brøndene forsigtigt med reservoirdækfilmen. Placer derefter pladen i buffersiden opad orientering inde i en passende temperaturstyret inkubator ved 20 grader Celsius for at tillade krystalvækst. For at undersøge krystaldannelse under mikroskopet skal du fjerne beskyttelsesdækfilmen fra 200 mikron UV-dækfilmen og placere pladen under okularet med proteinsiden opad.For at oprette et storstilet krystalliseringseksperiment skal du vedtage de betingelser, hvor mikrokrystalvækst forekom i mikrodialysepladen og replikere de samme betingelser i store beholdere. Vælg beholderstørrelsen afhængigt af dialyseopløsningens volumen. Der pipetteres et maksimalt volumen på 500 mikroliter proteinprøve ind i dialysatorrøret, inden røret forsegles ved hjælp af den røde plastikhætte.Anbring det forseglede 500 mikroliter dialysatorrør i det flydende stativ inde i beholderen fyldt med dialyseopløsning. Placer derefter beholderen uforstyrret inde i en passende temperaturstyret inkubator ved 20 grader Celsius for at opnå krystalvækst. For at kontrollere dannelsen af krystaller, pipette en til to mikroliter af opløsningen fra dialysatoren på et glasdæksel.Dæk opløsningen på diaset med et andet glasglas og se det under et mikroskop. Billeder taget ved hjælp af et stereomikroskop med høj forstørrelse viste vellykket mikrokrystaldannelse af fire proteiner ved hjælp af mikrodialysepladerne med 10-kilodalton molekylvægt afskæringsmembraner. Lysozym viste sig at danne krystaller, når det dialyseres mod 0,1 molært natriumacetat ved pH 4 indeholdende passende additiver.Domatin dannede krystaller, når de dialyseres mod 0,1 molær bis-tris propan ved pH 6,6 indeholdende passende additiver. Optimerede dialysebetingelser førte til mikrokrystaldannelse af membranproteinerne, nemlig E. coli multidrug effluxpumpeproteinet AcrB og E. coli lactosetransportøren LacY. Storskala krystallisering i dialysatorrørene, der anvender de optimerede dialysebetingelser opnået fra mikrodialyseeksperimenterne, førte til dannelsen af tusindvis af mikrokrystaller for hvert af proteinerne.Til krystallisation af fomitin blev 250 mikroliter protein dialyseret mod 50 ml dialyseopløsning. For AcrB blev 250 mikroliter af proteinet dialyseret mod 25 mikroliter dialyseopløsning. LacY-krystalliseringen blev også oprettet i samme forhold med 100 mikroliter protein til 10 ml dialyseopløsning.Når pladen vendes om på buffersiden opad, er det vigtigt at notere placeringen af A1, så opløsninger fra krystalliseringsskærmen kan dispenseres i overensstemmelse hermed. Krystallerne opnået ved denne metode kan anvendes til downstream-applikationer, såsom seriel krystallografi og mikro-ED.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produktion, krystallisation og struktur Bestemmelse af<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via mikropodning og Zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Høj overførselshastighed, absolut bestemmelse af indholdet af en markeret Protein i væv niveauer ved hjælp af kvantitative Dot duppes analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi til High Throughput påvisning af lav affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisk screening og karakterisering af Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for vellykket krystallisering

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Et økonomisk og alsidigt proteinrensningssystem med høj gennemløb ved hjælp af en pladeadapter med flere kolonner

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Et "dual-addition" calciumfluorescensassay til high-throughput screening af rekombinante G-proteinkoblede receptorer

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

High-throughput screening for at opnå krystal hits til proteinkrystallografi

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Billedbaseret kvantificering med høj kapacitet af mitokondrie-DNA-syntese og -distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...