Name: high-throughput protein crystallization via microdialysis
Uploaded: 2023-03-03T14:05:00
Duration: 6 min 18 s
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Nous reconnaissons le financement du Department of Business, Energy, and Industrial Strategy (BEIS) du Royaume-Uni. Nous remercions Alex R. Jones et Mike Shaw du Laboratoire national de physique pour leurs commentaires sur le manuscrit.

1. Préparation d’échantillons de protéines
<ol><li>Préparer (par des méthodes recombinantes ou autrement) et purifier la ou les protéines d’intérêt dans un tampon approprié (c.-à-d. qui se prête à la stabilité et à la cristallisation des protéines) qui a été filtré avec un filtre de 0,22 μm (voir le tableau des matériaux). Évaluer la qualité des protéines (en termes de pureté, de polydispersité et de stabilité) avant la cristallisation31. REMARQUE : Veuillez consulter la section des résultats représentatifs pour plus de détails sur les protéines et les tampons utilisés dans la présente étude.</li>
	<li>Concentrer l’échantillon jusqu’à 10-50 mg.mL-1 ou plus (selon la cible protéique) en utilisant le bon concentrateur MWCO (voir le tableau des matériaux). NOTE: L’échantillon concentré peut être utilisé immédiatement pour la cristallisation ou conservé congelé à -80 °C.</li>
	<li>Si la protéine a été congelée, centrifuger l’échantillon pendant 10 minutes dans une centrifugeuse de paillasse (≥16 000 × g, à température ambiante ou à 4 °C) pour enrober et éliminer toute matière indésirable (p. ex. précipités).</li>
	<li>Aliquote la protéine dans des tubes PCR propres de 200 μL. Conservez-le sur de la glace ou à 4 °C si la protéine est instable à température ambiante.</li>
</ol>2. Mise en place de la plaque de microdialyse
REMARQUE : La plaque de microdialyse disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) se compose de deux côtés (« côté protéine » et « côté tampon ») avec une membrane de cellulose régénérée (disponible dans différents MWCO), comme le montre la figure 2.
<ol><li>Avec la plaque orientée vers le haut côté protéique, décollez et retirez le ruban adhésif (Figure 2A) de l’espaceur adhésif sous pression de 200 μm. Prenez note de la position du puits A1.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette multicanal, chargez un maximum de 3,2 μL de protéines (étape 1.4) dans chaque puits (figure 2B). REMARQUE: La protéine peut également être chargée à l’aide d’une pipette à distribution répétée. L’utilisation d’une pipette monocanal est possible, mais elle augmentera la probabilité de déshydratation partielle des gouttes en raison du temps de chargement prolongé.</li>
	<li>Placez le film de couverture UV de 200 μm (voir le tableau des matériaux) sur la plaque de 96 puits et vérifiez son intégrité (figure 2C). Assurez-vous que le film protecteur est orienté vers le haut.</li>
	<li>Utilisez une palette d’étanchéité (voir le tableau des matériaux), appuyez sur le film de couverture UV pour activer et sceller l’adhésif sous pression.</li>
	<li>Retourner la plaque et noter la position du puits A1. Assurez-vous que la plaque est orientée côté tampon vers le haut et que les positions du puits sont réfléchies (figure 2D).</li>
	<li>À l’aide d’une pipette multicanal, charger un maximum de 350 μL de la solution de dialyse dans chacun des puits (figure 2D). REMARQUE : Dans cette étape, on peut utiliser des cribles de cristallisation disponibles dans le commerce (cribles à matrice clairsemée) ou des cribles personnalisés fabriqués en laboratoire (cribles de grille) (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Scellez soigneusement les puits avec le « film de couverture du réservoir » (voir le tableau des matériaux) (figure 2E).</li>
	<li>Placer la plaque (côté tampon vers le haut) dans un incubateur approprié à température contrôlée (20 °C) pour la croissance des cristaux. NOTE: Pour les protéines sélectionnées pour la présente étude, les cristaux ont commencé à apparaître entre 1-8 h à 20 °C.</li>
	<li>Pour vérifier la présence de cristaux au microscope, inverser la plaque pour relever le côté protéique et retirer le film protecteur du film de couverture UV de 200 μm (étape 2.3), comme illustré à la figure 2F,G.</li>
</ol>3. Cristallisation à grande échelle à l’aide de tubes dialyseurs
REMARQUE : Une fois que les conditions de cristallisation ont été explorées à l’aide de la plaque de microdialyse, la cristallisation à grande échelle de la protéine (pour cristallographie en série ou à d’autres fins) peut être effectuée à l’aide du tube dialyseur, comme illustré à la figure 3. Semblables à la plaque de microdialyse, ces appareils sont disponibles avec des membranes de dialyse MWCO de 3, 5, 10 et 30 kDa.
<ol><li>Préparer les conditions de cristallisation optimisées pour la croissance des microcristaux dans de grands récipients (en adoptant les conditions optimisées à l’aide de la plaque de microdialyse). Assurez-vous que le tampon a déjà été filtré avec un filtre de 0,2 μm.</li>
	<li>Pipeter la protéine dans le tube dialyseur (volume maximal de 0,5 mL) et sceller l’extrémité à l’aide du capuchon en plastique rouge inclus (Figure 3A).</li>
	<li>Placer le tube de dialyseur de 500 μL dans un contenant de taille appropriée (selon le volume total de solution de dialyse) contenant le support flottant (voir le tableau des matériaux), comme le montre la figure 3B. REMARQUE: Le rack flottant fourni avec le kit de dialyseur peut contenir jusqu’à 18 tubes de dialyseur simultanément.</li>
	<li>Placez le récipient à l’arrêt dans un incubateur à température contrôlée approprié (20 °C) pour la croissance des cristaux.</li>
	<li>Pour inspecter les cristaux, pipeter 1-2 μL de la solution sur une lame de couvercle en verre. Couvrir avec une deuxième lame de couverture en verre sur le dessus (pour éviter une déshydratation excessive) et voir au microscope (voir Tableau des matériaux). REMARQUE: Les cristaux peuvent être endommagés lorsqu’ils sont pris en sandwich entre deux lames de couvercle en verre pendant l’inspection. Les cristaux peuvent également être vus directement en plaçant le tube dialyseur sous un microscope stéréo à fort grossissement.</li>
</ol>

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	<li>Brooks-Bartlett, J. C., Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nobel+science:+One+hundred+years+of+crystallography.">The nobel science: One hundred years of crystallography.</a> Interdisciplinary Science Reviews. 40 (3), 244-264 (2015).</li><li>Maveyraud, L., Mourey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+X-ray+crystallography+and+drug+discovery.">Protein X-ray crystallography and drug discovery.</a> Molecules. 25 (5), (2020).</li><li>Kwan, T. O. 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Les co-auteurs Pascelle Draper et Paul Reardon sont employés par SWISSCI.

Actuellement, la cristallisation par dialyse est la méthode de cristallisation la plus sous-utilisée, notamment en raison du faible débit et de la nature fastidieuse des approches existantes, telles que la microdialyse avec boutons. Ici, un protocole simple mais robuste suit un flux de travail HTP pour la croissance de cristaux de protéines par dialyse à travers une plaque de microdialyse disponible dans le commerce et un tube de dialyseur. Selon la protéine cible, la plaque de microdialyse et le tube de dialyse utilisés dans la procédure sont livrés avec un choix d’une membrane de dialyse avec un MWCO de 3, 5, 10 ou 30 kDa. Le protocole peut être facilement mis en place dans n’importe quelle installation de cristallisation standard et présente le grand avantage d’être applicable aux protéines solubles et membranaires. Cependant, les complexes protéine-protéine et protéine-acide nucléique n’ont pas été testés au cours de ce protocole.
Comme dans toute approche de cristallisation par dialyse, le rapport volumique entre l’échantillon de protéines et la solution de dialyse est critique. Dans ce protocole, un rapport de 1:100 entre l’échantillon et la solution de dialyse est recommandé, mais comme la plaque de microdialyse permet une capacité maximale de 350 μL de solution de dialyse, ces rapports peuvent être explorés pour obtenir des résultats cristallins. Un volume de 1-2 μL de protéines est utilisé dans le protocole présenté lors de la mise en place des plaques de cristallisation. Il s’agit de s’assurer que les gouttes sont réglées avec précision avec une pipette manuelle multicanal. En utilisant des pipettes électroniques (pipettes multicanaux ou à distribution répétée) ou des robots de distribution de liquide HTP, des gouttes de volumes inférieurs peuvent être obtenues avec précision, réduisant ainsi la quantité de protéines requise. De plus, en raison des volumes relativement faibles de tampon de dialyse requis par la plaque de microdialyse (contrairement aux autres méthodes de dialyse conventionnelles), il est possible (sans l’utilisation intensive de ressources) d’explorer de grands espaces chimiques, non seulement en utilisant des cribles de cristallisation disponibles dans le commerce, mais aussi avec des écrans d’optimisation (conçus autour de la condition initiale de cristallisation).
Une étape critique de la procédure HTP présentée est l’application en temps opportun de petits volumes de protéines (0,50-3,2 μL par condition) sur la plaque de dialyse pour limiter la déshydratation et la perte d’échantillon. Cela peut être facilement atténué en utilisant une pipette multicanal, une pipette à distribution répétée ou un système de cristallisation robotisé. Le long temps d’incubation, par exemple plus de 2 semaines, des plaques à 20 °C peut entraîner une déshydratation des gouttelettes de protéines ou des dommages aux cristaux récemment formés. Garder les plaques de dialyse à l’intérieur d’une chambre d’humidification ou d’un sac scellable peut atténuer cet effet. En outre, l’utilisation de matériaux et de techniques stériles est recommandée pour éviter la croissance bactérienne.
Comme mentionné dans l’introduction, récemment, avec le besoin accru de comprendre la dynamique structurelle des protéines pour les mécanismes de la maladie, les interactions de liaison protéine-ligand et les interactions protéine-protéine, le domaine de la cristallographie aux rayons X des protéines a été révolutionné par le développement de techniques de cristallisation nouvelles et existantes, des approches modernes de livraison d’échantillons de cristaux, de nouvelles générations de sources de rayons X et de nouvelles méthodes sophistiquées d’acquisition et de traitement des données36 ,37,38. Par conséquent, l’avènement de la microcristallographie sérielle à température ambiante, réalisée à l’aide de XFEL ou de sources lumineuses synchrotron, est apparu comme un outil remarquable en biologie structurale, en particulier dans le domaine des protéines membranaires39. Cependant, des milliers de microcristaux sont nécessaires pour générer suffisamment de données pour une solution de structure robuste, ce qui n’est pas une tâche facile (du moins par les méthodes de cristallisation conventionnelles). La méthode de cristallisation par dialyse décrite ici permet la production d’un grand nombre de microcristaux. Une fois que les conditions de cristallisation pour la production de microcristaux (1-10 μm) ont été déterminées à l’aide d’une plaque de microdialyse, de grandes quantités de microcristaux à haute densité peuvent être produites à l’aide du dialyseur de 0,5 mL (Figure 5). Ces cristaux sont parfaitement adaptés à la collecte de données à l’aide de cibles fixes ou de systèmes de distribution d’échantillons à jet liquide27,40. Les cristaux obtenus par cette méthode peuvent également convenir aux applications MicroED. Cependant, ceux-ci peuvent avoir besoin d’être broyés à une taille et une épaisseur appropriées pour cette application spécifique, car les électrons interagissent beaucoup plus fortement avec les cristaux que les photons X41.
En conclusion, l’approche de cristallisation par dialyse décrite ici s’ajoute à l’évolution des stratégies de cristallisation des protéines pour la détermination de la structure et élargit la gamme des efforts qui peuvent être déployés pour déterminer de nouvelles cibles protéiques qui ont été infructueuses auparavant avec d’autres méthodes conventionnelles.

Au cours du siècle dernier, la cristallographie aux rayons X a joué un rôle essentiel dans l’élucidation et la compréhension du paradigme structure-fonction des macromolécules biologiques. À ce jour, elle continue d’être l’une des méthodes les plus efficaces pour élucider les structures de résolution atomique de nombreuses protéines uniques qui sont cruciales pour la compréhension fondamentale de la biochimie cellulaire, de la médecine et de la découverte précoce de médicaments 1,2. Cependant, la cristallisation des protéines reste un goulot d’étranglement dans l’étude de nombreuses cibles protéiques, en particulier les protéines membranaires et les grands complexes protéiques3. Par conséquent, la cristallisation des protéines est presque toujours considérée comme un art en raison des approches d’essais et d’erreurs à forte intensité de main-d’œuvre employées 4,5,6.
Un agent précipitant est généralement ajouté à une solution protéique à forte concentration pour former un arrangement en réseau bien ordonné, régulier et répétitif de molécules de protéines, appelées cristaux. Dans des conditions favorables, telles que la température, le pH, la concentration et l’agent précipitant, une solution sursaturée finit par se former, suivie d’une nucléation cristalline et d’une croissance 7,8. Bien qu’il y ait eu de nombreux progrès dans les configurations d’essais de cristallisation, principalement avec le développement de systèmes robotiques à haut débit et la disponibilité de cribles « à matrice clairsemée » prêts à l’emploi, les approches générales de cristallisation des protéines sont restées largement inchangées au fil des ans. Les techniques expérimentales courantes de cristallisation des protéines comprennent la diffusion de vapeur (goutte suspendue et goutte assise)9, les microlots (sous huile)10,11, la diffusion à interface libre (dispositifs microfluidiques)12 et la dialyse (à l’aide de boutons et d’autres techniques)13,14,15. Cependant, d’autres configurations plus spécialisées existent également, telles que les approches en mésophase pour cristalliser les protéines membranaires16,17. Alors que la majorité des structures de protéines de rayons X déposées dans la banque de données sur les protéines ont jusqu’à présent été résolues par cristallisation par des méthodes de diffusion de vapeur 6,18, d’autres approches, telles que la cristallisation par dialyse, semblent être sous-utilisées, probablement en raison des aspects pratiques liés à leur configuration expérimentale.
La cristallisation par dialyse repose simplement sur la diffusion lente de solutés (précipitants, ions, additifs et tampons) à travers une membrane semi-perméable qui empêche simultanément les molécules de protéines de circuler. De cette façon, la solution protéique est lentement mise en équilibre, le précipitant atteignant la concentration nécessaire pour cristalliser. La cinétique du système dépend de la température, de la concentration précipitante et du seuil de poids moléculaire de la membrane cellulosique (MWCO)19. À ce jour, la configuration de cristallisation par dialyse la plus populaire a été l’utilisation de boutons de microdialyse faits de feuilles d’acrylique transparentes. Ceux-ci sont généralement immergés dans des réservoirs (principalement à l’aide de plaques de goutte suspendues par diffusion de vapeur) contenant les solutions précipitantes de cristallisation. Cependant, cette méthode à faible débit nécessite également un assemblage spécifique pour sceller la solution protéique dans la membrane de dialyse placée sur la chambre à boutons, comme illustré à la figure 1. De plus, les bulles d’air piégées entre la membrane de dialyse et la solution protéique sont un problème fréquent qui nuit à la croissance des cristaux. Une autre contrainte de la méthode est les exigences de l’échantillon, où des concentrations et des volumes beaucoup plus élevés sont nécessaires par rapport aux méthodes de diffusion de vapeur, pour accueillir les boutons de dialyse. Par conséquent, la cristallisation à l’aide de boutons de microdialyse a été perçue comme une méthode peu attrayante, en particulier pour les cibles difficiles telles que les protéines membranaires, dont les rendements de purification sont frustrants. Récemment, des dispositifs microfluidiques ont été développés pour faciliter la cristallisation des protéines par dialyse15. Ces puces ont également été conçues pour avoir une transparence élevée des rayons X avec un faible arrière-plan, ce qui permet aux puces d’être utilisées pour la collecte de données in situ à température ambiante, éliminant ainsi les inconvénients de la récolte et du cryorefroidissement des cristaux. Malgré ces avancées, l’approche est encore très peu débitée et coûteuse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique de la cristallisation par dialyse à l’aide de boutons de dialyse. (A) Représentation schématique d’un bouton de dialyse de cristallisation. (B) La solution protéique est ajoutée à la chambre à boutons de microdialyse. (C) La membrane de dialyse est maintenue au bouton de microdialyse à l’aide d’un anneau en caoutchouc (joint torique) appliqué via un applicateur. (D) Le bouton de dialyse est prêt à être immergé dans le réservoir contenant la solution de cristallisation (solution de dialyse), comme indiqué au point (E). Le flacon contenant le bouton de dialyse immergé doit être scellé pour éviter l’évaporation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Ici, un protocole simple est présenté pour le criblage des conditions de cristallisation des protéines et la croissance des cristaux à l’aide de la plaque de dialyse à haut débit de 96 puits. Ces plaques jetables sont conçues pour être utilisées de manière similaire aux plaques de cristallisation par diffusion de vapeur (pipette puis joint), comme le montre la figure 2. Les plaques peuvent contenir jusqu’à 3,2 μL de protéines et 350 μL de solution de dialyse. Chaque puits comporte une membrane de cellulose régénérée distincte pour éviter la contamination croisée entre les puits. L’installation prend environ 10 minutes et ne nécessite aucun équipement spécialisé en dehors de ce que l’on peut trouver dans tous les laboratoires de cristallisation standard. Quatre protéines différentes, dont deux protéines membranaires, sont utilisées pour démontrer et valider cette approche en tant que méthode efficace pour la cristallographie des protéines à haut débit (HTP).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig02.jpg"> Figure 2 : Flux de travail de cristallisation à l’aide de la plaque de microdialyse. (A) Retrait du « film de couverture » adhésif rouge. (B) Distribuer les gouttelettes de protéines dans chacun des puits de goutte. (C) Les puits sont recouverts du « film de couverture » UV. (D) La plaque est inversée pour ajouter les solutions de dialyse (ou crible de cristallisation). (E) La plaque est scellée et incubée. (F,G) Inspection au microscope des gouttes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
L’utilisation de cette cristallisation par protocole de dialyse a été démontrée à l’aide du tube dialyseur de 0,5 mL (Figure 3) pour la production à grande échelle (des centaines à des milliers) de microcristaux, adaptés aux méthodes de collecte de données de pointe telles que la cristallographie en série dans les installations XFEL 20,21,22,23,24 et les synchrotrons25,26,27 , ainsi que pour les approches MicroED28,29,30.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig03.jpg"> Figure 3 : Cristallisation microdialysée à grande échelle à l’aide du tube dialyseur. (A) Représentation schématique du tube dialyseur de 0,5 mL. (B) Vue latérale d’un bécher contenant la solution de cristallisation et du support à tube flottant contenant un tube de dialyseur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0620</td>
			<td>For aliquoting protein solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>17823----------K</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate filters. For filtering dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSTF04700</td>
			<td>Membrane filters for filtering large volumes of buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 0.5 &#8211; 10 &#181;L Research plus pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000028</td>
			<td>For dispensing protein drops onto the Diaplate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 30 &#8211; 300 &#181;L Eppendorf Research plus pipette&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000060</td>
			<td>For dispensing dialysis solutions on the Diaplate reservoirs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15889152</td>
			<td>For use with syringe filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2.2 mL deep-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0788</td>
			<td>Polypropylene deep-well storage plates; for preparing screens using the Hamilton Microlab STARlet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000565</td>
			<td>With rotor FA-24x2 with a maximum g-force of 21,300 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diacon dialyser</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W72010</td>
			<td>Dialyzer tubes with a regenerated cellulose membrane with a molecular weight cut-off of 10 kDa. Ideal for protein solutions of up to 0.5 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaplate 96-well plate</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W82010</td>
			<td>Microdialysis plate. The Diaplate consists of two sides with a regenerated cellulose membrane in-between with a molecular weight cut-off of 10 kDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For holding dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating rack</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diacon kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor-standing vibration-free incubator</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD5-01</td>
			<td>400 L temperature-controlled incubator set to 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 C stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Planapo 1.0x objective, 7.8x &#8211; 160x zoom range with DMC 4500 camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memgold2</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-64</td>
			<td>Sparse-matrix screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlab STARlet</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable bottle top filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>DS0320-5045</td>
			<td>For fitering large volumes of buffers, for use with 0.22 &#181;m membrane filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing paddle</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput protein crystallization via microdialysis

Comprendre les relations structure-fonction des macromolécules, telles que les protéines, au niveau moléculaire est vital pour la biomédecine et la découverte de médicaments modernes. À ce jour, la cristallographie aux rayons X reste la méthode la plus efficace pour résoudre les structures protéiques tridimensionnelles à la résolution atomique. Avec les progrès récents de la cristallographie en série, que ce soit en utilisant des lasers à électrons libres à rayons X (XFEL) ou des sources de lumière synchrotron, la cristallographie des protéines a progressé vers la prochaine frontière, où la capacité d’acquérir des données résolues dans le temps fournit des informations mécanistes importantes sur le comportement des molécules biologiques à température ambiante. Ce protocole décrit un flux de travail simple à haut débit (HTP) pour le criblage des conditions de cristallisation grâce à l’utilisation d’une plaque de dialyse à 96 puits. Ces plaques suivent la norme de la Society for Biomolecular Screening (SBS) et peuvent être facilement installées à l’aide de n’importe quel laboratoire de cristallisation standard. Une fois les conditions optimales identifiées, de grandes quantités de cristaux (des centaines de microcristaux) peuvent être produites à l’aide du dialyseur. Pour valider la robustesse et la polyvalence de cette approche, quatre protéines différentes ont été cristallisées, dont deux protéines membranaires.

Quatre protéines ont été cristallisées à l’aide de la plaque de microdialyse (avec des membranes MWCO de 10 kDa), dont deux protéines membranaires. Le lysozyme de blanc d’œuf de poule de la poudre lyophilisée (voir le tableau des matières) a été préparé à 50 mg.mL-1 dans 20 mM de NaOAc (pH 4,5), et la thaumatine lyophilisée (voir le tableau des matières) a été dissoute dans l’eau jusqu’à une concentration finale de 25 mg.mL-1. Les deux protéines membranaires utilisées dans cette étude étaient la pompe à efflux multimédicament E. coli AcrB et le transporteur de lactose E. coli LacY. L’AcrB a été exprimée à l’aide de cellules C43 (DE3) et purifiée par chromatographie d’affinité Ni-NTA et chromatographie d’exclusion de taille dans 10 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl, 0,03% (p/v) de n-dodécyl-β-D-maltoside (DDM) et 5% (v/v) glycérol32. Par la suite, la protéine a été concentrée à l’aide d’un concentrateur centrifuge MWCO de 100 kDa jusqu’à une concentration finale de 6 mg.mL-1. La lacY a également été exprimée dans des cellules C43 (DE3), purifiée par chromatographie d’affinité Ni-sépharose suivie d’une chromatographie d’exclusion de taille dans 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,03% (p/v) DDM, et concentrée à l’aide d’un concentrateur MWCO de 100 kDa à 10 mg.mL-1 4,33.
Pour les protéines lysozyme et thaumatine, la plaque de microdialyse à 96 puits a été remplie d’un crible de grille de cristallisation préparé en interne comme solution de dialyse, tandis que pour la protéine membranaire AcrB, un criblage de grille a été préparé en interne à partir d’une condition de cristallisation34 publiée précédemment. Pour LacY, les conditions de frappe initiales ont été trouvées à partir d’un écran commercial (voir le tableau des matériaux) et optimisées avec un écran de grille fabriqué en interne. Le rapport de goutte de cristallisation pour le lysozyme, la thaumatine et l’AcrB était de 1:100, avec 2 μL de protéines pour 200 μL de précipitant (solution de dialyse). Les gouttes de cristallisation LacY étaient également à un rapport de 1:100, avec 1 μL de protéines pour 100 μL de solution de dialyse, en raison d’une quantité plus faible de protéines disponibles.
Les cristaux des quatre protéines, y compris les protéines membranaires, ont commencé à apparaître entre 1 et 8 heures à 20 °C après la configuration avec la plaque de microdialyse. Dans ce cas, il n’était pas nécessaire de compléter la solution de dialyse avec un détergent pour la cristallisation des protéines membranaires, généralement effectuée au cours du procédé de dialyse standard pour empêcher l’agrégation des protéines membranaires, car les micelles du détergent devaient être plus grandes que le MWCO des membranes de dialyse35.
Après la cristallisation réussie des protéines sur la plaque de microdialyse (Figure 4), des conditions de cristallisation ont été notées et une cristallisation à grande échelle par dialyse a été réalisée à l’aide du tube dialyseur avec les mêmes membranes de dialyse MWCO de 10 kDa. Des milliers de microcristaux pour chacune des protéines individuelles se sont développés à l’intérieur du dialyseur, comme le montre la figure 5. Pour la cristallisation de la thaumatine, 250 μL de protéines ont été chargés sur le dialyseur et dialysés contre 50 ml (rapport 1:200). Pour l’AcrB, 250 μL de protéines ont été dialysés contre 25 mL de solution de dialyse (1:100). La cristallisation LacY a également été mise en place au même rapport avec 100 μL de protéines pour 10 mL de solution de dialyse.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig04.jpg"> Figure 4 : Les cristaux sont cultivés par dialyse à l’aide de la plaque de microdialyse. Le protocole démontre l’applicabilité de la configuration avec des protéines solubles: (A) Lysozyme a été dialysé contre 0,1 M NaOAc (pH 4,0), 0,5 M NaCl et 25% (v / v) glycérol. (B) La thaumatine a été dialysée contre 0,1 M de bis-tris propane (pH 6,6), 1 M K/Na tartrate et 18 % (v/v) d’éthylèneglycol. Des cristaux ont également été obtenus pour les protéines membranaires : (C) AcrB a été dialysé contre 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl et 20% (v/v) PEG-400. (D) LacY a été dialysé contre 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl et 32% (v/v) PEG-300. Les images ont été capturées à l’aide d’un microscope stéréo à fort grossissement avec polariseur croisé. Barres d’échelle: (A,B,D) = 1 mm; (C) = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig05.jpg"> Figure 5 : Images représentatives de cristaux de protéines membranaires cultivés par dialyse à l’aide du tube dialyseur. (A) Image montrant le tube rempli de microcristaux (indiquée par la flèche noire). (B) Image microscopique de 2 μL provenant d’une boue de cristaux de thaumatine cultivée par dialyse à l’aide du tube dialyseur de 0,5 mL, dialysée contre 0,1 M de propane Bis-Tris (pH 6,6), 1,4 M K/Na tartrate et 18 % (v/v) d’éthylène glycol. (C) Images en fond noir (à gauche) et en fond clair (à droite) de microcristaux AcrB cultivés par dialyse contre 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl et 20% (v/v) PEG-400. (D) Images en fond noir (à gauche) et en fond clair (à droite) de microcristaux LacY cultivés par dialyse contre 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl et 32% (v/v) PEG-300. Certains précipités sont observés. Barres d’échelle: (B,D) = 200 μm; (C) = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Le protocole présenté décrit une approche simple pour le criblage des conditions de cristallisation des protéines et la croissance des cristaux à l’aide d’une plaque de dialyse à haut débit de 96 puits. L’utilisation de tubes dialyseurs pour la croissance à grande échelle de microcristaux est également démontrée pour la cristallographie en série et les applications MicroED.

Cristallisation de protéines à haut débit par microdialyse

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

La cristallisation par dialyse est une méthode sous-utilisée. Ce protocole présente une approche Novo à cet égard, qui augmentera la gamme de stratégies de cristallisation actuellement disponibles pour la détermination structurée. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est à haut débit, simple à mettre en place sans équipement spécialisé requis, et permet un suivi facile de la croissance des cristaux.La personne qui effectue cette technique doit être à l’aise avec le pipetage à faible volume et l’utilisation de pipettes multicanaux. Les gouttes doivent être pipetées aussi suffisamment que possible pour éviter une déshydratation partielle. Pour mettre en place l’expérience de microdialyse, placez une plaque de microdialyse de 96 puits disponible dans le commerce dans l’orientation vers le haut côté protéine et retirez le ruban adhésif en décollant l’espaceur adhésif sous pression de 200 microns.Après avoir décollé le ruban adhésif du couvercle, notez la position du puits A1. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanal, chargez un maximum de 3,2 microlitres d’échantillon de protéines correctement préparé dans chaque puits. Positionnez correctement le film de couverture UV de 200 microns sur la plaque de 96 puits, le film étant orienté vers le haut. Ensuite, pour activer et sceller l’adhésif sous pression, appuyez sur le film de couverture UV à l’aide d’une palette d’étanchéité et vérifiez son intégrité.Maintenant, inversez la plaque pour l’amener à l’orientation du côté tampon vers le haut et notez la position en miroir du puits marqué A1. À l’aide d’une pipette multicanaux, chargez un maximum de 350 microlitres de solution de dialyse dans chaque puits de la plaque et scellez soigneusement les puits avec le film de couvercle du réservoir. Ensuite, placez la plaque dans l’orientation tampon vers le haut à l’intérieur d’un incubateur approprié à température contrôlée à 20 degrés Celsius pour permettre la croissance des cristaux. Pour examiner la formation de cristaux au microscope, retirez le film de couverture protecteur du film de couverture UV de 200 microns et placez la plaque sous l’oculaire avec le côté protéique vers le haut.Pour mettre en place une expérience de cristallisation à grande échelle, adoptez les conditions dans lesquelles la croissance des microcristaux s’est produite dans la plaque de microdialyse et reproduisez les mêmes conditions dans de grands récipients. Sélectionnez la taille du récipient en fonction du volume de la solution de dialyse. Pipeter un volume maximum de 500 microlitres d’échantillon de protéines dans le tube de dialyseur avant de sceller le tube à l’aide du bouchon en plastique rouge.Placez le tube de dialyseur scellé de 500 microlitres dans le rack flottant à l’intérieur du récipient rempli de solution de dialyse. Ensuite, placez le récipient sans être dérangé dans un incubateur approprié à température contrôlée à 20 degrés Celsius pour obtenir une croissance cristalline. Pour vérifier la formation de cristaux, pipeter un à deux microlitres de la solution du dialyseur sur une lame de couvercle en verre.Couvrez la solution sur la lame avec une autre lame de verre et visualisez-la au microscope. Les images capturées à l’aide d’un microscope stéréo à fort grossissement ont montré la formation réussie de quatre protéines par microcristaux à l’aide de plaques de microdialyse avec des membranes de coupure de poids moléculaire de 10 kilodaltons. Le lysozyme s’est avéré former des cristaux lorsqu’il est dialysé contre 0,1 molaire d’acétate de sodium à pH 4 contenant des additifs appropriés.La domatine a formé des cristaux lorsqu’elle est dialysée contre 0,1 molaire de bis-tris propane à pH 6,6 contenant des additifs appropriés. Des conditions de dialyse optimisées ont conduit à la formation de microcristaux par les protéines membranaires, à savoir la protéine AcrB de la pompe à efflux multimédicament E. coli et le transporteur de lactose E. coli LacY. La cristallisation à grande échelle dans les tubes de dialyseur en utilisant les conditions de dialyse optimisées obtenues à partir des expériences de microdialyse a conduit à la formation de milliers de microcristaux pour chacune des protéines.Pour la cristallisation de la fomitine, 250 microlitres de protéines ont été dialysés contre 50 millilitres de la solution de dialyse. Pour AcrB, 250 microlitres de la protéine ont été dialysés contre 25 microlitres de solution de dialyse. La cristallisation LacY a également été mise en place au même rapport, avec 100 microlitres de protéines pour 10 millilitres de solution de dialyse.Lors de l’inversion de la plaque du côté tampon vers le haut, il est important de noter la position de A1, afin que les solutions de l’écran de cristallisation puissent être distribuées en conséquence. Les cristaux obtenus à partir de cette méthode peuvent être utilisés pour des applications en aval, telles que la cristallographie en série et la micro-ED.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Procédé pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs de petites molécules de l&#39;interaction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

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Biochimie

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High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Haut débit, l’absolue détermination de la teneur d’une protéine sélectionnée aux niveaux de tissus en utilisant Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Technologie des microréseaux protéine extracellulaire pour détection haut débit des Interactions Ligand-récepteur de faible affinité

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Dépistage stratégique et caractérisation du complexe de signalisation des protéines VISUAL GPCR-mini-G pour une cristallisation réussie

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Un système de purification de protéines à haut débit économique et polyvalent à l’aide d’un adaptateur de plaque multicolonne

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Un test de fluorescence calcique « à double addition » pour le criblage à haut débit de récepteurs couplés à la protéine G recombinante

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Criblage à haut débit pour obtenir des résultats cristallins pour la cristallographie des protéines

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Quantification à haut débit basée sur l’image de la synthèse et de la distribution de l’ADN mitochondrial

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...