Name: high-throughput protein crystallization via microdialysis
Uploaded: 2023-03-03T14:05:00
Duration: 6 min 18 s
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Wir erkennen die Finanzierung durch das britische Ministerium für Wirtschaft, Energie und Industriestrategie (BEIS) an. Wir danken Alex R. Jones und Mike Shaw vom National Physical Laboratory für ihr Feedback zum Manuskript.

1. Vorbereitung der Proteinprobe
<ol><li>Präparation (durch rekombinante Methoden oder auf andere Weise) und Aufreinigung des/der interessierenden Protein(s) in einem geeigneten Puffer (d. h. einem, der für Proteinstabilität und Kristallisation geeignet ist), der mit einem 0,22-μm-Filter filtriert wurde (siehe Materialtabelle). Bewerten Sie die Proteinqualität (in Bezug auf Reinheit, Polydispersität und Stabilität) vor der Kristallisation31. HINWEIS: Einzelheiten zu den in der vorliegenden Studie verwendeten Proteinen und Puffern finden Sie im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse".</li>
	<li>Konzentrieren Sie die Probe auf 10-50 mg.mL-1 oder höher (je nach Proteinziel) mit dem richtigen MWCO-Konzentrator (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Die konzentrierte Probe kann sofort zur Kristallisation verwendet oder gefroren bei -80 °C gelagert werden.</li>
	<li>Wenn das Protein eingefroren wurde, zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang in einer Tischzentrifuge (≥16.000 × g, bei Raumtemperatur oder 4 °C), um sie zu pelletieren und unerwünschtes Material (z. B. Ausfällungen) zu entfernen.</li>
	<li>Aliquotieren Sie das Protein in saubere 200-μl-PCR-Röhrchen. Bewahren Sie es auf Eis oder bei 4 °C auf, wenn das Protein bei Raumtemperatur instabil ist.</li>
</ol>2. Einrichten der Mikrodialyseplatte
HINWEIS: Die kommerziell erhältliche Mikrodialyseplatte (siehe Materialtabelle) besteht aus zwei Seiten ("Proteinseite" und "Pufferseite") mit einer regenerierten Zellulosemembran (erhältlich in verschiedenen MWCOs), wie in Abbildung 2 dargestellt.
<ol><li>Ziehen Sie mit der plattenorientierten Proteinseite nach oben das selbstklebende Abdeckband (Abbildung 2A) vom 200-μm-Druckabstandshalter ab und entfernen Sie es. Achten Sie auf die Position der Vertiefung A1.</li>
	<li>Laden Sie mit einer Mehrkanalpipette maximal 3,2 μl Protein (Schritt 1.4) in jede Vertiefung (Abbildung 2B). Anmerkungen: Das Protein kann auch mit einer Wiederholungspipette beladen werden. Die Verwendung einer Einkanalpipette ist möglich, erhöht jedoch die Wahrscheinlichkeit, dass die Tropfen aufgrund der verlängerten Ladezeit teilweise dehydriert werden.</li>
	<li>Positionieren Sie die 200 μm UV-Deckfolie (siehe Materialtabelle) über der 96-Well-Platte und überprüfen Sie ihre Unversehrtheit (Abbildung 2C). Achten Sie darauf, dass die Schutzfolie nach oben zeigt.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Siegelpaddel (siehe Materialtabelle), drücken Sie die UV-Abdeckfolie nach unten, um den Druckkleber zu aktivieren und zu versiegeln.</li>
	<li>Drehen Sie die Platte um und notieren Sie sich die Position der Vertiefung A1. Stellen Sie sicher, dass die Platte mit der Pufferseite nach oben ausgerichtet ist und dass die Positionen der Bohrlöcher gespiegelt sind (Abbildung 2D).</li>
	<li>Laden Sie mit einer Mehrkanalpipette maximal 350 μl der Dialyselösung in jede der Vertiefungen (Abbildung 2D). HINWEIS: In diesem Schritt können entweder handelsübliche Kristallisationssiebe (Sparse-Matrix-Siebe) oder im Labor hergestellte kundenspezifische Siebe (Rastersiebe) verwendet werden (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Verschließen Sie die Vertiefungen vorsichtig mit der "Reservoir-Deckfolie" (siehe Materialtabelle) (Abbildung 2E).</li>
	<li>Legen Sie die Platte (Pufferseite nach oben) in einen geeigneten temperaturgesteuerten Inkubator (20 °C) für die Kristallzüchtung. HINWEIS: Bei den Proteinen, die für die vorliegende Studie ausgewählt wurden, begannen die Kristalle zwischen 1-8 h bei 20 °C zu erscheinen.</li>
	<li>Um unter dem Mikroskop nach Kristallen zu suchen, drehen Sie die Platte um, um die Proteinseite nach oben zu bringen, und entfernen Sie die Schutzfolie von der 200 μm UV-Deckfolie (Schritt 2.3), wie in Abbildung 2F,G gezeigt.</li>
</ol>3. Großflächige Kristallisation mit Dialysatorröhrchen
HINWEIS: Nachdem die Kristallisationsbedingungen mit der Mikrodialyseplatte untersucht wurden, kann eine Kristallisation des Proteins in großem Maßstab (für die serielle Kristallographie oder andere Zwecke) mit dem Dialysatorröhrchen durchgeführt werden, wie in Abbildung 3 gezeigt. Ähnlich wie die Mikrodialyseplatte sind diese Geräte mit 3, 5, 10 und 30 kDa MWCO-Dialysemembranen erhältlich.
<ol><li>Bereiten Sie die optimierte Kristallisationsbedingung für die Züchtung von Mikrokristallen in großen Behältern vor (unter Verwendung der mit der Mikrodialyseplatte optimierten Bedingungen). Stellen Sie sicher, dass der Puffer zuvor mit einem 0,2-μm-Filter gefiltert wurde.</li>
	<li>Pipettieren Sie das Protein in das Dialysatorröhrchen (maximales Volumen von 0,5 ml) und verschließen Sie das Ende mit der mitgelieferten roten Plastikkappe (Abbildung 3A).</li>
	<li>Legen Sie das 500-μl-Dialysatorröhrchen in einen Behälter geeigneter Größe (abhängig vom Gesamtvolumen der Dialyselösung), in dem sich das schwimmende Gestell befindet (siehe Materialtabelle), wie in Abbildung 3B dargestellt. Anmerkungen: Das schwimmende Gestell, das mit dem Dialysator-Kit geliefert wird, fasst bis zu 18 Dialysatorröhrchen gleichzeitig.</li>
	<li>Stellen Sie den Behälter stationär in einen geeigneten temperaturgeregelten Inkubator (20 °C) für die Kristallzüchtung.</li>
	<li>Um auf Kristalle zu prüfen, pipettieren Sie 1-2 μl der Lösung auf einen Objektträger. Decken Sie den Deckel mit einem zweiten Glasdeckobjektträger ab (um ein übermäßiges Austrocknen zu verhindern) und betrachten Sie ihn unter einem Mikroskop (siehe Materialtabelle). Anmerkungen: Kristalle können beschädigt werden, wenn sie während der Inspektion zwischen zwei Glasabdeckungen eingeklemmt werden. Kristalle können auch direkt betrachtet werden, indem das Dialysatorrohr unter ein Stereomikroskop mit hoher Vergrößerung gehalten wird.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brooks-Bartlett, J. C., Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nobel+science:+One+hundred+years+of+crystallography.">The nobel science: One hundred years of crystallography.</a> Interdisciplinary Science Reviews. 40 (3), 244-264 (2015).</li><li>Maveyraud, L., Mourey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+X-ray+crystallography+and+drug+discovery.">Protein X-ray crystallography and drug discovery.</a> Molecules. 25 (5), (2020).</li><li>Kwan, T. O. 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Die Co-Autoren Pascelle Draper und Paul Reardon sind bei SWISSCI angestellt.

Derzeit ist die Kristallisation durch Dialyse die am wenigsten genutzte Kristallisationsmethode, insbesondere aufgrund des geringen Durchsatzes und der langwierigen Natur der bestehenden Ansätze, wie z. B. der Mikrodialyse mit Knöpfen. Hier folgt ein einfaches, aber robustes Protokoll einem HTP-Workflow für die Züchtung von Proteinkristallen durch die Dialyse durch eine kommerziell erhältliche Mikrodialyseplatte und einen Dialysatorschlauch. Je nach Zielprotein sind die Mikrodialyseplatte und das Dialysatoröhrchen wahlweise mit einer Dialysemembran mit einem MWCO von 3, 5, 10 oder 30 kDa ausgestattet. Das Protokoll kann problemlos in jeder Standard-Kristallisationsanlage eingerichtet werden und hat den großen Vorteil, dass es sowohl auf lösliche als auch auf Membranproteine anwendbar ist. Protein-Protein- und Protein-Nukleinsäure-Komplexe wurden während dieses Protokolls jedoch nicht getestet.
Wie bei jedem Kristallisationsansatz durch Dialyse ist das Volumenverhältnis zwischen Proteinprobe und Dialyselösung entscheidend. In diesem Protokoll wird ein Verhältnis von 1:100 zwischen der Probe und der Dialyselösung empfohlen, aber da die Mikrodialyseplatte eine maximale Kapazität von 350 μl Dialyselösung zulässt, können diese Verhältnisse untersucht werden, um Kristalltreffer zu erhalten. Ein Volumen von 1-2 μL Protein wird im vorgestellten Protokoll beim Aufbau von Kristallisationsplatten verwendet. Dadurch soll sichergestellt werden, dass die Tropfen mit einer manuellen Mehrkanalpipette genau aushärten. Durch den Einsatz von elektronischen Pipetten (Mehrkanal- oder Wiederholungspipetten) oder HTP-Flüssigkeitsdosierrobotern können Tropfen mit geringerem Volumen genau erreicht werden, wodurch die benötigte Proteinmenge gesenkt wird. Darüber hinaus ist es aufgrund der relativ geringen Mengen an Dialysepuffer, die von der Mikrodialyseplatte benötigt werden (im Gegensatz zu anderen konventionellen Dialysemethoden), möglich (ohne den umfangreichen Einsatz von Ressourcen), große chemische Räume zu erkunden, und zwar nicht nur mit kommerziell erhältlichen Kristallisationssieben, sondern auch mit Optimierungsbildschirmen (die um die anfängliche Kristallisationstrefferbedingung herum ausgelegt sind).
Ein kritischer Schritt im vorgestellten HTP-Verfahren ist die rechtzeitige Applikation kleiner Proteinvolumina (0,50-3,2 μl pro Bedingung) auf die Dialyseplatte, um Dehydratisierung und Probenverlust zu begrenzen. Dies kann leicht durch den Einsatz einer Mehrkanalpipette, einer Wiederholungspipette oder eines robotergestützten Kristallisationssystems gemildert werden. Die lange Inkubationszeit, z. B. mehr als 2 Wochen, der Platten bei 20 °C kann zu einer Austrocknung der Proteintröpfchen oder zu einer Schädigung der neu gebildeten Kristalle führen. Die Aufbewahrung der Dialyseplatten in einer Befeuchtungskammer oder einem verschließbaren Beutel kann diesen Effekt abmildern. Darüber hinaus wird die Verwendung steriler Materialien und Techniken empfohlen, um Bakterienwachstum zu vermeiden.
Wie in der Einleitung erwähnt, wurde das Gebiet der Protein-Röntgenkristallographie in jüngster Zeit durch die Entwicklung neuer und bestehender Kristallisationstechniken, moderner Ansätze zur Kristallprobenabgabe, neuer Generationen von Röntgenquellen und neuer ausgeklügelter Methoden zur Datenerfassung und -verarbeitung revolutioniert36 ,37,38. Daher hat sich das Aufkommen der seriellen Mikrokristallographie bei Raumtemperatur, die entweder mit XFELs oder Synchrotronlichtquellen durchgeführt wird, zu einem bemerkenswerten Werkzeug in der Strukturbiologie entwickelt, insbesondere auf dem Gebiet der Membranproteine39. Es sind jedoch Tausende von Mikrokristallen erforderlich, um genügend Daten für eine robuste Strukturlösung zu generieren, was (zumindest mit herkömmlichen Kristallisationsmethoden) keine leichte Aufgabe ist. Das hier beschriebene Dialysekristallisationsverfahren ermöglicht die Herstellung einer großen Anzahl von Mikrokristallen. Nachdem die Kristallisationsbedingungen für die Herstellung von Mikrokristallen (1-10 μm) durch den Einsatz einer Mikrodialyseplatte bestimmt wurden, können mit dem 0,5-ml-Dialysator große Mengen an Mikrokristallen hoher Dichte hergestellt werden (Abbildung 5). Diese Kristalle eignen sich ideal für die Datenerfassung mit festen Targets oder Flüssigstrahl-Probenzufuhrsystemen27,40. Kristalle, die mit dieser Methode gewonnen werden, können auch für MicroED-Anwendungen geeignet sein. Diese müssen jedoch möglicherweise auf eine für diese spezielle Anwendung geeignete Größe und Dicke gefräst werden, da Elektronen viel stärker mit Kristallen wechselwirken als Röntgenphotonen41.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der hier beschriebene Ansatz der Kristallisation durch Dialyse zu den sich entwickelnden Strategien in der Proteinkristallisation zur Strukturaufklärung beiträgt und das Spektrum der Anstrengungen erweitert, die zur Bestimmung neuer Proteinziele eingesetzt werden können, die bisher mit anderen konventionellen Methoden erfolglos waren.

Im letzten Jahrhundert hat die Röntgenkristallographie entscheidend dazu beigetragen, das Struktur-Funktions-Paradigma biologischer Makromoleküle aufzuklären und zu verstehen. Bis heute ist es eine der erfolgreichsten Methoden zur Aufklärung atomarer Auflösungsstrukturen vieler einzigartig unterschiedlicher Proteine, die für das grundlegende Verständnis der Zellbiochemie, der Medizin und der frühen Wirkstoffforschung von entscheidender Bedeutung sind 1,2. Die Proteinkristallisation bleibt jedoch ein Engpass bei der Untersuchung vieler Proteinziele, insbesondere von Membranproteinen und großen Proteinkomplexen3. Folglich wird die Proteinkristallisation aufgrund der arbeitsintensiven Trial-and-Error-Ansätze fast immer als Kunst angesehen 4,5,6.
Ein Fällungsmittel wird normalerweise in hoher Konzentration zu einer Proteinlösung hinzugefügt, um eine wohlgeordnete, regelmäßige und sich wiederholende Gitteranordnung von Proteinmolekülen, den sogenannten Kristallen, zu bilden. Unter günstigen Bedingungen wie Temperatur, pH-Wert, Konzentration und Fällungsmittel bildet sich schließlich eine übersättigte Lösung, gefolgt von Kristallkeimbildung und Wachstum 7,8. Obwohl es viele Fortschritte bei Kristallisationsversuchsaufbauten gegeben hat, vor allem mit der Entwicklung von Hochdurchsatz-Robotersystemen und der Verfügbarkeit von vorgefertigten "Sparse Matrix"-Bildschirmen, sind die allgemeinen Ansätze zur Proteinkristallisation im Laufe der Jahre weitgehend unverändert geblieben. Zu den gängigen experimentellen Proteinkristallisationstechniken gehören die Dampfdiffusion (hängender Tropfen und sitzender Tropfen)9, die Mikrocharge (unter Öl)10,11, die Diffusion mit freier Schnittstelle (mikrofluidische Geräte)12 und die Dialyse (unter Verwendung von Knöpfen und anderen Techniken)13,14,15. Es existieren jedoch auch andere, speziellere Aufbauten, wie z. B. Mesophasenansätze zur Kristallisation von Membranproteinen16,17. Während die Mehrzahl der in der Proteindatenbank hinterlegten Röntgenproteinstrukturen bisher durch Kristallisation mit Dampfdiffusionsmethoden 6,18 gelöst wurde, scheinen andere Ansätze, wie z.B. die Kristallisation durch Dialyse, zu wenig genutzt zu werden, was wahrscheinlich auf die praktischen Aspekte ihres Versuchsaufbaus zurückzuführen ist.
Die Kristallisation durch Dialyse beruht einfach auf der langsamen Diffusion von gelösten Stoffen (Fällungsmitteln, Ionen, Additiven und Puffern) durch eine semipermeable Membran, die gleichzeitig die Zirkulation von Proteinmolekülen verhindert. Auf diese Weise wird die Proteinlösung langsam ins Gleichgewicht gebracht, wobei das Fällungsmittel die notwendige Konzentration erreicht, um zu kristallisieren. Die Kinetik des Systems hängt von der Temperatur, der Fällmittelkonzentration und dem Molekulargewichtsgrenzwert (MWCO) der Zellulosemembran ab19. Das bisher beliebteste Kristallisationssystem in der Dialyse sind Mikrodialyseknöpfe aus transparenten Acrylplatten. Diese werden in der Regel in Reservoirs getaucht (meist unter Verwendung von Dampfdiffusions-Hängetropfenplatten), die die Kristallisationsfällungslösungen enthalten. Diese Methode mit niedrigerem Durchsatz erfordert jedoch auch eine spezielle Montage, um die Proteinlösung innerhalb der Dialysemembran zu versiegeln, die über der Knopfkammer platziert ist, wie in Abbildung 1 dargestellt. Darüber hinaus sind Luftblasen, die zwischen der Dialysemembran und der Proteinlösung eingeschlossen sind, ein häufiges Problem, das das Kristallwachstum beeinträchtigen. Eine weitere Einschränkung des Verfahrens sind die Probenanforderungen, bei denen im Vergleich zu Dampfdiffusionsmethoden wesentlich höhere Konzentrationen und Volumina erforderlich sind, um die Dialysetasten unterzubringen. Daher wurde die Kristallisation mit Mikrodialyseknöpfen als unattraktiv empfunden, insbesondere für schwierige Ziele wie Membranproteine, deren Reinigungsausbeute frustrierend gering ist. In jüngster Zeit wurden mikrofluidische Geräte entwickelt, um die Proteinkristallisation durch Dialyse zu erleichtern15. Diese Chips wurden auch so konzipiert, dass sie eine hohe Röntgentransparenz bei niedrigem Hintergrund aufweisen, so dass die Chips für die In-situ-Datenerfassung bei Raumtemperatur verwendet werden können, wodurch die Unannehmlichkeiten der Ernte und Kryokühlung von Kristallen entfallen. Trotz dieser Fortschritte ist der Ansatz immer noch sehr durchsatzarm und teuer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Kristallisation durch Dialyse mit Hilfe von Dialysetasten. (A) Schematische Darstellung eines Kristallisationsdialyseknopfes. (B) Die Proteinlösung wird in die Mikrodialyse-Knopfkammer gegeben. (C) Die Dialysemembran wird mit Hilfe eines Gummirings (O-Rings), der über einen Applikator angebracht wird, am Mikrodialyseknopf gehalten. (D) Der Dialyseknopf kann in das Reservoir mit der Kristallisationslösung (Dialyselösung) eingetaucht werden, wie in (E) gezeigt. Die Durchstechflasche mit dem eingetauchten Dialyseknopf muss verschlossen sein, um eine Verdunstung zu vermeiden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Hier wird ein einfaches Protokoll für das Screening der Proteinkristallisationsbedingungen und des Kristallwachstums unter Verwendung der 96-Well-Hochdurchsatz-Dialyseplatte vorgestellt. Diese Einwegplatten sind so konzipiert, dass sie ähnlich wie die Dampfdiffusionskristallisationsplatten (Pipette und dann Versiegelung) verwendet werden können, wie in Abbildung 2 gezeigt. Die Platten können bis zu 3,2 μl Protein und 350 μl Dialyselösung aufnehmen. Jedes Bohrloch verfügt über eine separate, regenerierte Zellulosemembran, um eine Kreuzkontamination zwischen den Bohrlöchern zu verhindern. Der Aufbau dauert etwa 10 Minuten und erfordert keine spezielle Ausrüstung, außer denen, die in allen Standard-Kristallisationslabors zu finden sind. Vier verschiedene Proteine, darunter zwei Membranproteine, werden verwendet, um diesen Ansatz als effektive Methode für die Hochdurchsatz-Proteinkristallographie (HTP) zu demonstrieren und zu validieren.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig02.jpg"> Abbildung 2: Kristallisations-Workflow mit der Mikrodialyseplatte . (A) Entfernen der roten Klebefolie. (B) Abgabe der Proteintröpfchen in jede der Tropfenvertiefungen. (C) Die Vertiefungen werden mit der UV-"Abdeckfolie" abgedeckt. (D) Die Platte wird umgedreht, um die Dialyselösungen (oder das Kristallisationssieb) hinzuzufügen. (E) Die Platte wird versiegelt und inkubiert. (F,G) Mikroskopische Inspektion der Tropfen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Die Verwendung dieses Kristallisationsprotokolls durch Dialyseprotokoll wurde anhand des 0,5-ml-Dialysatorröhrchens (Abbildung 3) für die Herstellung von Mikrokristallen im großen Maßstab (Hunderte bis Tausende) demonstriert, die für modernste Datenerfassungsmethoden wie die serielle Kristallographie an den beiden XFEL-Einrichtungen 20,21,22,23,24 und Synchrotrons25,26,27 geeignet sind , sowie für MicroED28,29,30 Ansätze.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig03.jpg"> Abbildung 3: Mikrodialysekristallisation im großen Maßstab mit dem Dialysatorröhrchen . (A) Schematische Darstellung des 0,5-ml-Dialysatorröhrchens. (B) Seitenansicht eines Becherglases, das die Kristallisationslösung enthält, und des schwimmenden Röhrchengestells, das ein Dialysatorröhrchen enthält. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0620</td>
			<td>For aliquoting protein solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>17823----------K</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate filters. For filtering dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSTF04700</td>
			<td>Membrane filters for filtering large volumes of buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 0.5 &#8211; 10 &#181;L Research plus pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000028</td>
			<td>For dispensing protein drops onto the Diaplate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 30 &#8211; 300 &#181;L Eppendorf Research plus pipette&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000060</td>
			<td>For dispensing dialysis solutions on the Diaplate reservoirs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15889152</td>
			<td>For use with syringe filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2.2 mL deep-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0788</td>
			<td>Polypropylene deep-well storage plates; for preparing screens using the Hamilton Microlab STARlet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000565</td>
			<td>With rotor FA-24x2 with a maximum g-force of 21,300 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diacon dialyser</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W72010</td>
			<td>Dialyzer tubes with a regenerated cellulose membrane with a molecular weight cut-off of 10 kDa. Ideal for protein solutions of up to 0.5 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaplate 96-well plate</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W82010</td>
			<td>Microdialysis plate. The Diaplate consists of two sides with a regenerated cellulose membrane in-between with a molecular weight cut-off of 10 kDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For holding dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating rack</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diacon kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor-standing vibration-free incubator</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD5-01</td>
			<td>400 L temperature-controlled incubator set to 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 C stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Planapo 1.0x objective, 7.8x &#8211; 160x zoom range with DMC 4500 camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memgold2</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-64</td>
			<td>Sparse-matrix screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlab STARlet</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable bottle top filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>DS0320-5045</td>
			<td>For fitering large volumes of buffers, for use with 0.22 &#181;m membrane filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing paddle</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput protein crystallization via microdialysis

Das Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehungen von Makromolekülen, wie z.B. Proteinen, auf molekularer Ebene ist für die Biomedizin und die moderne Arzneimittelforschung von entscheidender Bedeutung. Bis heute ist die Röntgenkristallographie die erfolgreichste Methode, um dreidimensionale Proteinstrukturen mit atomarer Auflösung zu lösen. Mit den jüngsten Fortschritten in der seriellen Kristallographie, entweder unter Verwendung von Röntgenlasern mit freien Elektronen (XFELs) oder Synchrotronlichtquellen, ist die Proteinkristallographie in die nächste Dimension vorgedrungen, wo die Fähigkeit, zeitaufgelöste Daten zu erfassen, wichtige mechanistische Einblicke in das Verhalten biologischer Moleküle bei Raumtemperatur liefert. Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen Hochdurchsatz-Workflow (HTP) für das Screening der Kristallisationsbedingungen unter Verwendung einer 96-Well-Dialyseplatte. Diese Platten entsprechen dem Standard der Society for Biomolecular Screening (SBS) und können mit jedem Standard-Kristallisationslabor einfach eingerichtet werden. Sobald die optimalen Bedingungen identifiziert sind, können mit dem Dialysator große Mengen an Kristallen (Hunderte von Mikrokristallen) hergestellt werden. Um die Robustheit und Vielseitigkeit dieses Ansatzes zu validieren, wurden vier verschiedene Proteine kristallisiert, darunter zwei Membranproteine.

Vier Proteine wurden mit der Mikrodialyseplatte (mit 10 kDa MWCO-Membranen) kristallisiert, darunter zwei Membranproteine. Das Hühnereiweiß-Lysozym aus dem lyophilisierten Pulver (siehe Materialtabelle) wurde bei 50 mg.mL-1 in 20 mM NaOAc (pH 4,5) hergestellt, und das lyophilisierte Thaumatin (siehe Materialtabelle) wurde in Wasser bis zu einer Endkonzentration von 25 mg.mL-1 gelöst. Die beiden Membranproteine, die in dieser Studie verwendet wurden, waren die E. coli-Multidrug-Efflux-Pumpe AcrB und der E. coli-Laktose-Transporter LacY. AcrB wurde unter Verwendung von C43 (DE3)-Zellen exprimiert und mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie und Größenausschlusschromatographie in 10 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl, 0,03 % (w/v) n-Dodecyl-β-D-Maltosid (DDM) und 5 % (v/v) Glycerin32 gereinigt. Anschließend wurde das Protein mit einem 100 kDa MWCO-Zentrifugalkonzentrator auf eine Endkonzentration von 6 mg.mL-1 eingeengt. LacY wurde auch in C43 (DE3)-Zellen exprimiert, mittels Ni-Sepharose-Affinitätschromatographie und anschließender Größenausschlusschromatographie in 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,03 % (w/v) DDM aufgereinigt und mit einem 100 kDa MWCO-Konzentrator auf 10 mg.mL-1 konzentriert 4,33.
Für die Proteine Lysozym und Thaumatin wurde die 96-Well-Mikrodialyseplatte mit einem intern als Dialyselösung hergestellten Kristallisationsgitter-Screening gefüllt, während für das Membranprotein AcrB ein intern hergestelltes Gitter-Screening aus einer zuvor veröffentlichten Kristallisationsbedingung34 hergestellt wurde. Für LacY wurden die anfänglichen Trefferbedingungen von einem kommerziellen Sieb (siehe Materialtabelle) gefunden und mit einem selbst hergestellten Gittersieb weiter optimiert. Das Kristallisationstropfenverhältnis für Lysozym, Thaumatin und AcrB betrug 1:100, mit 2 μl Protein auf 200 μl Fällungsmittel (Dialyselösung). Die LacY-Kristallisationstropfen lagen ebenfalls in einem Verhältnis von 1:100 auf, mit 1 μl Protein auf 100 μl Dialyselösung, was auf eine geringere Menge an verfügbarem Protein zurückzuführen ist.
Kristalle aus allen vier Proteinen, einschließlich der Membranproteine, traten zwischen 1 und 8 h bei 20 °C nach dem Aufbau mit der Mikrodialyseplatte auf. In diesem Fall war es nicht erforderlich, die Dialyselösung mit einem Detergenz für die Kristallisation des Membranproteins zu ergänzen, was typischerweise während des Standarddialyseprozesses geschieht, um eine Aggregation von Membranproteinen zu verhindern, da erwartet wurde, dass die Detergenzmizellen größer sein würden als die MWCO der Dialysemembranen35.
Nach der erfolgreichen Kristallisation der Proteine auf der Mikrodialyseplatte (Abbildung 4) wurden die Kristallisationsbedingungen festgestellt und eine großtechnische Kristallisation durch Dialyse unter Verwendung des Dialysatoröhrchens mit den gleichen 10 kDa MWCO-Dialysemembranen durchgeführt. Tausende von Mikrokristallen für jedes der einzelnen Proteine wuchsen im Dialysator, wie in Abbildung 5 dargestellt. Für die Thaumatinkristallisation wurden 250 μL Protein auf den Dialysator geladen und gegen 50 mL dialysiert (Verhältnis 1:200). Für AcrB wurden 250 μl Protein gegen 25 ml Dialyselösung dialysiert (1:100). Die LacY-Kristallisation wurde ebenfalls im gleichen Verhältnis mit 100 μl Protein zu 10 ml Dialyselösung durchgeführt.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig04.jpg"> Abbildung 4: Kristalle werden durch Dialyse mit Hilfe der Mikrodialyseplatte gezüchtet. Das Protokoll demonstriert die Anwendbarkeit des Aufbaus mit löslichen Proteinen: (A) Lysozym wurde gegen 0,1 M NaOAc (pH 4,0), 0,5 M NaCl und 25% (v/v) Glycerin dialysiert. (B) Thaumatin wurde gegen 0,1 M Bis-Tris-Propan (pH 6,6), 1 M K/Na-Tartrat und 18% (v/v) Ethylenglykol dialysiert. Kristalle wurden auch für Membranproteine erhalten: (C) AcrB wurde gegen 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl und 20% (v/v) PEG-400 dialysiert. (D) LacY wurde gegen 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl und 32% (v/v) PEG-300 dialysiert. Die Bilder wurden mit einem Stereomikroskop mit hoher Vergrößerung und Kreuzpolarisator aufgenommen. Maßstabsbalken: (A,B,D) = 1 mm; (C) = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig05.jpg"> Abbildung 5: Repräsentative Bilder von Membranproteinkristallen, die durch Dialyse mit dem Dialysatoröhrchen gezüchtet wurden. (A) Das Bild zeigt das Röhrchen voller Mikrokristalle (gekennzeichnet durch den schwarzen Pfeil). (B) Mikroskopische Aufnahme von 2 μl aus einer Aufschlämmung von Thaumatinkristallen, die durch Dialyse mit dem 0,5-ml-Dialysatorröhrchen gezüchtet wurden, dialysiert gegen 0,1 M Bis-Tris-Propan (pH 6,6), 1,4 M K/Na-Tartrat und 18 % (v/v) Ethylenglykol. (C) Dunkelfeld- (links) und Hellfeldbilder (rechts) von AcrB-Mikrokristallen, die durch Dialyse gegen 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl und 20% (v/v) PEG-400 gezüchtet wurden. (D) Dunkelfeld- (links) und Hellfeldbilder (rechts) von LacY-Mikrokristallen, die durch Dialyse gegen 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl und 32% (v/v) PEG-300 gezüchtet wurden. Es werden einige Ausscheidungen beobachtet. Maßstabsbalken: (B,D) = 200 μm; (C) = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Das vorgestellte Protokoll beschreibt einen einfachen Ansatz für das Screening der Proteinkristallisationsbedingungen und des Kristallwachstums unter Verwendung einer 96-Well-Hochdurchsatz-Dialyseplatte. Der Einsatz von Dialysatorröhrchen für die großskalige Züchtung von Mikrokristallen wird auch für serielle Kristallographie und MicroED-Anwendungen demonstriert.

Hochdurchsatz-Proteinkristallisation mittels Mikrodialyse

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

Die Kristallisation durch Dialyse ist eine wenig genutzte Methode. Dieses Protokoll stellt hierfür einen Novo-Ansatz dar, der das Spektrum der derzeit verfügbaren Kristallisationsstrategien für die strukturierte Bestimmung erweitern wird. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie einen hohen Durchsatz hat, einfach einzurichten ist, ohne dass eine spezielle Ausrüstung erforderlich ist, und eine einfache Überwachung des Kristallwachstums ermöglicht.Die Person, die diese Technik durchführt, muss mit dem Pipettieren mit geringem Volumen und der Verwendung von Mehrkanalpipetten vertraut sein. Die Tropfen müssen so ausreichend wie möglich pipettiert werden, um eine teilweise Austrocknung zu verhindern. Um das Mikrodialyse-Experiment einzurichten, legen Sie eine handelsübliche 96-Well-Mikrodialyseplatte in die Proteinseite nach oben und entfernen Sie das Klebeabdeckband, indem Sie den 200-Mikron-Druckabstandshalter abziehen.Beachten Sie nach dem Abziehen des selbstklebenden Abdeckbandes die Position der Vertiefung A1. Laden Sie anschließend mit einer Mehrkanalpipette maximal 3,2 Mikroliter einer ordnungsgemäß vorbereiteten Proteinprobe in jede Vertiefung. Positionieren Sie die 200-Mikron-UV-Deckfolie mit der Folie nach oben richtig über der 96-Well-Platte. Um den Druckkleber zu aktivieren und zu versiegeln, drücken Sie dann die UV-Deckfolie mit einem Siegelpaddel nach unten und überprüfen Sie deren Unversehrtheit.Drehen Sie nun die Platte um, um sie auf die Ausrichtung mit der Pufferseite nach oben zu bringen, und notieren Sie sich die gespiegelte Position der markierten Vertiefung A1. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette maximal 350 Mikroliter der Dialyselösung in jede Vertiefung der Platte und verschließen Sie die Vertiefungen sorgfältig mit der Reservoirabdeckfolie. Legen Sie dann die Platte mit der Pufferseite nach oben in einen geeigneten temperaturgesteuerten Inkubator bei 20 Grad Celsius, um das Kristallwachstum zu ermöglichen. Um die Kristallbildung unter dem Mikroskop zu untersuchen, entfernen Sie die schützende Abdeckfolie von der 200-μm-UV-Abdeckfolie und legen Sie die Platte mit der Proteinseite nach oben unter das Okular.Um ein Kristallisationsexperiment im großen Maßstab durchzuführen, nehmen Sie die Bedingungen an, unter denen das Mikrokristallwachstum in der Mikrodialyseplatte stattgefunden hat, und replizieren Sie die gleichen Bedingungen in großen Behältern. Wählen Sie die Behältergröße in Abhängigkeit vom Volumen der Dialyselösung. Pipettieren Sie ein maximales Volumen von 500 Mikrolitern Proteinprobe in das Dialysatorröhrchen, bevor Sie das Röhrchen mit der roten Plastikkappe verschließen.Legen Sie das versiegelte 500-Mikroliter-Dialysatorröhrchen in das schwimmende Gestell in dem mit Dialyselösung gefüllten Behälter. Stellen Sie den Behälter anschließend ungestört in einen geeigneten temperaturgesteuerten Inkubator bei 20 Grad Celsius, um ein Kristallwachstum zu erzielen. Um die Bildung von Kristallen zu überprüfen, pipettieren Sie ein bis zwei Mikroliter der Lösung aus dem Dialysator auf einen Glasdeckobjektträger.Decken Sie die Lösung auf dem Objektträger mit einem anderen Objektträger aus Glas ab und betrachten Sie sie unter einem Mikroskop. Bilder, die mit einem Stereomikroskop mit hoher Vergrößerung aufgenommen wurden, zeigten die erfolgreiche Mikrokristallbildung von vier Proteinen unter Verwendung der Mikrodialyseplatten mit 10-Kilodalton-Molekulargewichts-Cutoff-Membranen. Es wurde festgestellt, dass Lysozym Kristalle bildet, wenn es gegen 0,1 molaren Natriumacetat bei pH 4 dialysiert wird, das geeignete Additive enthält.Domatin bildete Kristalle, wenn es gegen 0,1 molaren Bis-Tris-Propan bei pH 6,6 dialysiert wurde und geeignete Additive enthielt. Optimierte Dialysebedingungen führten zur Bildung von Mikrokristallen durch die Membranproteine, namentlich das E.coli-Multidrug-Efflux-Pumpprotein AcrB und den E.coli-Laktosetransporter LacY. Die großflächige Kristallisation in den Dialysatorröhrchen unter Verwendung der optimierten Dialysebedingungen aus den Mikrodialyseexperimenten führte zur Bildung von Tausenden von Mikrokristallen für jedes der Proteine.Zur Kristallisation von Fomitin wurden 250 Mikroliter Protein gegen 50 Milliliter der Dialyselösung dialysiert. Für AcrB wurden 250 Mikroliter des Proteins gegen 25 Mikroliter Dialyselösung dialysiert. Die LacY-Kristallisation wurde ebenfalls im gleichen Verhältnis aufgebaut, mit 100 Mikrolitern Protein auf 10 Milliliter Dialyselösung.Beim Umdrehen der Platte auf die Pufferseite nach oben ist die Position von A1 zu beachten, damit Lösungen aus dem Kristallisationssieb entsprechend dosiert werden können. Die so gewonnenen Kristalle können für nachgelagerte Anwendungen wie serielle Kristallographie und Mikro-ED verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Forschung

Biochemie

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 über Microseeding und Zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Hoher Durchsatz, Absolute Bestimmung des Inhalts eines ausgewählten Proteins auf Gewebe Ebenen mit quantitativen Dot Blot Analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisches Screening und Charakterisierung des Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex für eine erfolgreiche Kristallisation

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Ein wirtschaftliches und vielseitiges Hochdurchsatz-Proteinreinigungssystem mit einem Mehrsäulenplattenadapter

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Ein "Dual-Addition"-Calciumfluoreszenz-Assay für das Hochdurchsatz-Screening von rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Bildbasierte Hochdurchsatz-Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Synthese und -Verteilung

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...