Name: high-throughput protein crystallization via microdialysis
Uploaded: 2023-03-03T14:05:00
Duration: 6 min 18 s
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Riconosciamo il finanziamento del Dipartimento per le imprese, l'energia e la strategia industriale (BEIS) del Regno Unito. Ringraziamo Alex R. Jones e Mike Shaw del National Physical Laboratory per il loro feedback sul manoscritto.

1. Preparazione del campione proteico
<ol><li>Preparare (attraverso metodi ricombinanti o altro) e purificare le proteine di interesse in un tampone adatto (cioè uno che sia suscettibile di stabilità e cristallizzazione delle proteine) che è stato filtrato con un filtro da 0,22 μm (vedi Tabella dei materiali). Valutare la qualità delle proteine (in termini di purezza, polidispersività e stabilità) prima della cristallizzazione31. NOTA: Si prega di consultare la sezione dei risultati rappresentativi per i dettagli sulle proteine e sui tamponi utilizzati nel presente studio.</li>
	<li>Concentrare il campione fino a 10-50 mg.mL-1 o superiore (a seconda del bersaglio proteico) utilizzando il concentratore MWCO corretto (vedere Tabella dei materiali). NOTA: Il campione concentrato può essere utilizzato immediatamente per la cristallizzazione o conservato congelato a -80 °C.</li>
	<li>Se la proteina è stata congelata, centrifugare il campione per 10 minuti in una centrifuga da banco (≥16.000 × g, a temperatura ambiente o 4 °C) per pellettare e rimuovere qualsiasi materiale indesiderato (ad esempio, precipitati).</li>
	<li>Aliquotare la proteina in provette PCR pulite da 200 μL. Tenerlo su ghiaccio o a 4 °C se la proteina è instabile a temperatura ambiente.</li>
</ol>2. Impostazione della piastra di microdialisi
NOTA: La piastra di microdialisi disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) è costituita da due lati ("lato proteico" e "lato tampone") con una membrana di cellulosa rigenerata (disponibile in diversi MWCO), come mostrato nella Figura 2.
<ol><li>Con il lato proteico orientato verso l'alto, staccare e rimuovere il nastro adesivo di copertura (Figura 2A) dal distanziatore adesivo a pressione da 200 μm. Prendi nota della posizione del pozzo A1.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta multicanale, caricare un massimo di 3,2 μL di proteine (fase 1.4) in ciascun pozzetto (Figura 2B). NOTA: La proteina può anche essere caricata utilizzando una pipetta di erogazione ripetuta. È possibile utilizzare una pipetta a canale singolo, ma aumenterà la probabilità di disidratazione parziale delle gocce che si verifica a causa del tempo di caricamento prolungato.</li>
	<li>Posizionare la pellicola di copertura UV da 200 μm (vedere la tabella dei materiali) sulla piastra a 96 pozzetti e verificarne l'integrità (Figura 2C). Assicurarsi che la pellicola protettiva sia rivolta verso l'alto.</li>
	<li>Utilizzare una paletta di tenuta (vedere la tabella dei materiali), premere verso il basso la pellicola di copertura UV per attivare e sigillare l'adesivo a pressione.</li>
	<li>Capovolgere la piastra e prendere nota della posizione del pozzetto A1. Assicurarsi che la piastra sia orientata verso l'alto e che le posizioni del pozzetto siano speculari (Figura 2D).</li>
	<li>Utilizzando una pipetta multicanale, caricare un massimo di 350 μL della soluzione di dialisi in ciascuno dei pozzetti (Figura 2D). NOTA: In questa fase, è possibile utilizzare schermi di cristallizzazione disponibili in commercio (schermi a matrice sparsa) o schermi personalizzati realizzati in laboratorio (schermi a griglia) (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Sigillare accuratamente i pozzetti con la "pellicola di copertura del serbatoio" (vedi tabella dei materiali) (figura 2E).</li>
	<li>Posizionare la piastra (con il lato tampone verso l'alto) in un incubatore adatto a temperatura controllata (20 °C) per la crescita dei cristalli. NOTA: Per le proteine selezionate per il presente studio, i cristalli hanno iniziato ad apparire tra 1-8 h a 20 °C.</li>
	<li>Per ispezionare i cristalli al microscopio, capovolgere la piastra per portare il lato proteico verso l'alto e rimuovere la pellicola protettiva dalla pellicola di copertura UV da 200 μm (fase 2.3), come mostrato nella Figura 2F,G.</li>
</ol>3. Cristallizzazione su larga scala con tubi dializzatori
NOTA: Una volta che le condizioni di cristallizzazione sono state esplorate utilizzando la piastra di microdialisi, la cristallizzazione su larga scala della proteina (per cristallografia seriale o altri scopi) può essere eseguita utilizzando il tubo dializzatore, come mostrato in Figura 3. Analogamente alla piastra di microdialisi, questi dispositivi sono disponibili con membrane per dialisi MWCO da 3, 5, 10 e 30 kDa.
<ol><li>Preparare la condizione di cristallizzazione ottimizzata per la crescita di microcristalli in contenitori di grandi dimensioni (adottando le condizioni ottimizzate utilizzando la piastra di microdialisi). Assicurarsi che il buffer sia stato precedentemente filtrato con un filtro da 0,2 μm.</li>
	<li>Pipettare la proteina nel tubo del dializzatore (volume massimo di 0,5 ml) e sigillare l'estremità utilizzando il cappuccio di plastica rosso incluso (Figura 3A).</li>
	<li>Collocare il tubo dializzatore da 500 μL in un contenitore di dimensioni adeguate (a seconda del volume totale della soluzione di dialisi) contenente la cremagliera galleggiante (vedere la tabella dei materiali), come mostrato nella figura 3B. NOTA: Il rack flottante fornito con il kit dializzatore può contenere fino a 18 tubi dializzatore contemporaneamente.</li>
	<li>Posizionare il contenitore stazionario in un'incubatrice a temperatura controllata (20 °C) adatta per la crescita dei cristalli.</li>
	<li>Per ispezionare la presenza di cristalli, pipettare 1-2 μL della soluzione su un vetrino di vetro. Coprire con un secondo vetrino di vetro sulla parte superiore (per evitare un'eccessiva disidratazione) e visualizzare al microscopio (vedi Tabella dei materiali). NOTA: I cristalli possono essere danneggiati se inseriti tra due vetrini di copertura durante l'ispezione. I cristalli possono anche essere visualizzati direttamente posizionando il tubo dializzatore sotto un microscopio stereo ad alto ingrandimento.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brooks-Bartlett, J. C., Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nobel+science:+One+hundred+years+of+crystallography.">The nobel science: One hundred years of crystallography.</a> Interdisciplinary Science Reviews. 40 (3), 244-264 (2015).</li><li>Maveyraud, L., Mourey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+X-ray+crystallography+and+drug+discovery.">Protein X-ray crystallography and drug discovery.</a> Molecules. 25 (5), (2020).</li><li>Kwan, T. O. 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I coautori Pascelle Draper e Paul Reardon sono impiegati da SWISSCI.

Attualmente, la cristallizzazione mediante dialisi è il metodo di cristallizzazione più sottoutilizzato, in particolare a causa del basso rendimento e della natura noiosa degli approcci esistenti, come la microdialisi con pulsanti. Qui, un protocollo semplice ma robusto segue un flusso di lavoro HTP per la crescita dei cristalli proteici mediante dialisi attraverso una piastra di microdialisi disponibile in commercio e un tubo dializzatore. A seconda della proteina bersaglio, la piastra di microdialisi e il tubo dializzatore utilizzati nella procedura vengono forniti con una membrana di dialisi con un MWCO da 3, 5, 10 o 30 kDa. Il protocollo può essere facilmente impostato in qualsiasi impianto di cristallizzazione standard e ha il grande vantaggio di essere applicabile sia alle proteine solubili che a quelle di membrana. Tuttavia, i complessi proteina-proteina e proteina-acido nucleico non sono stati testati durante questo protocollo.
Come in qualsiasi approccio di cristallizzazione mediante dialisi, il rapporto volumetrico tra il campione proteico e la soluzione di dialisi è critico. In questo protocollo, si raccomanda un rapporto di 1:100 tra il campione e la soluzione di dialisi, ma poiché la piastra di microdialisi consente una capacità massima di 350 μL di soluzione di dialisi, questi rapporti possono essere esplorati per ottenere colpi di cristallo. Un volume di 1-2 μL di proteine viene utilizzato nel protocollo presentato durante la configurazione delle piastre di cristallizzazione. Questo per garantire che le gocce si adattino accuratamente con una pipetta multicanale manuale. Utilizzando pipette elettroniche (pipette multicanale o a erogazione ripetuta) o robot di erogazione di liquidi HTP, è possibile ottenere con precisione gocce di volumi inferiori, riducendo così la quantità di proteine necessarie. Inoltre, a causa dei volumi relativamente bassi di tampone di dialisi richiesti dalla piastra di microdialisi (contrariamente ad altri metodi di dialisi convenzionali), è possibile (senza l'ampio uso di risorse) esplorare grandi spazi chimici, non solo utilizzando schermi di cristallizzazione disponibili in commercio, ma anche con schermi di ottimizzazione (progettati intorno alla condizione iniziale di cristallizzazione).
Un passo critico nella procedura HTP presentata è l'applicazione tempestiva di piccoli volumi proteici (0,50-3,2 μL per condizione) alla piastra di dialisi per limitare la disidratazione e la perdita del campione. Questo può essere facilmente mitigato utilizzando una pipetta multicanale, una pipetta di erogazione ripetuta o un sistema di cristallizzazione robotizzato. Il lungo tempo di incubazione, ad esempio più di 2 settimane, delle piastre a 20 °C potrebbe portare alla disidratazione delle goccioline proteiche o al danneggiamento dei cristalli di recente formazione. Mantenere le piastre di dialisi all'interno di una camera di umidificazione o di un sacchetto sigillabile può alleviare questo effetto. Inoltre, si raccomanda l'uso di materiali e tecniche sterili per evitare la crescita batterica.
Come accennato nell'introduzione, recentemente, con la crescente necessità di comprendere le dinamiche strutturali delle proteine per i meccanismi della malattia, le interazioni di legame proteina-ligando e le interazioni proteina-proteina, il campo della cristallografia a raggi X delle proteine è stato rivoluzionato attraverso lo sviluppo di tecniche di cristallizzazione nuove ed esistenti, approcci moderni alla consegna di campioni di cristallo, nuove generazioni di sorgenti di raggi X e nuovi metodi sofisticati per l'acquisizione e l'elaborazione dei dati36 ,37,38. Pertanto, l'avvento della microcristallografia seriale a temperatura ambiente, eseguita utilizzando XFEL o sorgenti di luce di sincrotrone, è emerso come uno strumento notevole nella biologia strutturale, in particolare nel campo delle proteine di membrana39. Tuttavia, sono necessarie migliaia di microcristalli per generare dati sufficienti per una soluzione di struttura robusta, che non è un compito facile (almeno con i metodi di cristallizzazione convenzionali). Il metodo di cristallizzazione in dialisi qui descritto consente la produzione di un gran numero di microcristalli. Una volta determinata la condizione di cristallizzazione per la produzione di microcristalli (1-10 μm) mediante l'uso di una piastra di microdialisi, è possibile produrre grandi quantità di microcristalli ad alta densità utilizzando il dispositivo dializzatore da 0,5 mL (Figura 5). Questi cristalli sono ideali per la raccolta di dati utilizzando target fissi o sistemi di consegna di campioni a getto liquido27,40. I cristalli ottenuti con questo metodo possono anche essere appropriati per applicazioni MicroED. Tuttavia, potrebbe essere necessario ridurre a una dimensione e uno spessore adeguati per questa specifica applicazione, poiché gli elettroni interagiscono molto più fortemente con i cristalli rispetto ai fotoni a raggi X41.
In conclusione, l'approccio di cristallizzazione mediante dialisi qui descritto si aggiunge alle strategie in evoluzione nella cristallizzazione delle proteine per la determinazione della struttura e amplia la gamma di sforzi che possono essere impiegati per determinare nuovi bersagli proteici che in precedenza non hanno avuto successo con altri metodi convenzionali.

Nel corso dell'ultimo secolo, la cristallografia a raggi X è stata fondamentale per chiarire e comprendere il paradigma struttura-funzione delle macromolecole biologiche. Ad oggi, continua ad essere uno dei metodi di maggior successo nel chiarire le strutture di risoluzione atomica di molte proteine univocamente diverse che sono cruciali per la comprensione fondamentale della biochimica cellulare, della medicina e della scoperta precoce di farmaci 1,2. Tuttavia, la cristallizzazione delle proteine rimane un collo di bottiglia nello studio di molti bersagli proteici, in particolare proteine di membrana e grandi complessi proteici3. Di conseguenza, la cristallizzazione delle proteine è quasi sempre considerata un'arte a causa degli approcci di prova ed errore ad alta intensità di lavoro impiegati 4,5,6.
Un agente precipitante viene solitamente aggiunto a una soluzione proteica ad alta concentrazione per formare una disposizione reticolare ben ordinata, regolare e ripetuta di molecole proteiche, note come cristalli. In condizioni favorevoli, come temperatura, pH, concentrazione e agente precipitante, alla fine si forma una soluzione supersatura, seguita da nucleazione cristallina e crescita 7,8. Sebbene ci siano stati molti progressi nelle configurazioni di prova di cristallizzazione, principalmente con lo sviluppo di sistemi robotici ad alta produttività e la disponibilità di schermi "a matrice sparsa" già pronti, gli approcci generali alla cristallizzazione delle proteine sono rimasti in gran parte invariati nel corso degli anni. Le comuni tecniche sperimentali di cristallizzazione delle proteine includono la diffusione del vapore (goccia sospesa e goccia seduta)9, microbatch (sotto olio)10,11, diffusione a interfaccia libera (dispositivi microfluidici)12 e dialisi (usando pulsanti e altre tecniche)13,14,15. Tuttavia, esistono anche altre configurazioni più specializzate, come gli approcci mesophase per cristallizzare le proteine di membrana16,17. Mentre la maggior parte delle strutture proteiche a raggi X depositate nella Protein Data Bank sono state finora risolte attraverso la cristallizzazione mediante metodi di diffusione del vapore 6,18, altri approcci, come la cristallizzazione mediante dialisi, sembrano essere sottoutilizzati, probabilmente a causa degli aspetti pratici legati alla loro configurazione sperimentale.
La cristallizzazione mediante dialisi si basa semplicemente sulla lenta diffusione di soluti (precipitanti, ioni, additivi e tamponi) attraverso una membrana semipermeabile che impedisce contemporaneamente alle molecole proteiche di circolare. In questo modo, la soluzione proteica viene lentamente portata in equilibrio, con il precipitante che raggiunge la concentrazione necessaria per cristallizzare. La cinetica del sistema dipende dalla temperatura, dalla concentrazione del precipitante e dal cut-off del peso molecolare della membrana di cellulosa (MWCO)19. Ad oggi, la configurazione di cristallizzazione più popolare mediante dialisi ha utilizzato pulsanti di microdialisi realizzati con fogli acrilici trasparenti. Questi sono solitamente immersi in serbatoi (per lo più utilizzando piastre sospese per la diffusione del vapore) contenenti le soluzioni precipitanti di cristallizzazione. Tuttavia, questo metodo a bassa produttività richiede anche un assemblaggio specifico per sigillare la soluzione proteica all'interno della membrana di dialisi posta sopra la camera a bottone, come illustrato nella Figura 1. Inoltre, le bolle d'aria intrappolate tra la membrana di dialisi e la soluzione proteica sono un problema frequente che compromette la crescita dei cristalli. Un altro vincolo del metodo sono i requisiti del campione, per cui sono necessarie concentrazioni e volumi molto più elevati rispetto ai metodi di diffusione del vapore, per ospitare i pulsanti di dialisi. Pertanto, la cristallizzazione mediante pulsanti di microdialisi è stata percepita come un metodo poco attraente, specialmente per bersagli difficili come le proteine di membrana, i cui rendimenti di purificazione sono frustrantemente bassi. Recentemente, sono stati sviluppati dispositivi microfluidici per facilitare la cristallizzazione delle proteine mediante dialisi15. Questi chip sono stati inoltre progettati per avere un'elevata trasparenza dei raggi X con uno sfondo basso, consentendo ai chip di essere utilizzati per la raccolta di dati in situ a temperatura ambiente, eliminando così l'inconveniente della raccolta e del crioraffreddamento dei cristalli. Nonostante questi progressi, l'approccio è ancora molto basso e costoso.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica della cristallizzazione mediante dialisi mediante pulsanti di dialisi. (A) Rappresentazione schematica di un pulsante di dialisi di cristallizzazione. (B) La soluzione proteica viene aggiunta alla camera a bottone di microdialisi. (C) La membrana di dialisi è tenuta al pulsante di microdialisi con l'aiuto di un anello di gomma (O-ring) applicato tramite un applicatore. (D) Il pulsante di dialisi è pronto per essere immerso nel serbatoio contenente la soluzione di cristallizzazione (soluzione di dialisi), come mostrato in (E). Il flaconcino contenente il pulsante di dialisi immerso deve essere sigillato per evitare l'evaporazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Qui, viene presentato un protocollo semplice per lo screening delle condizioni di cristallizzazione delle proteine e la crescita dei cristalli utilizzando la piastra di dialisi ad alta produttività a 96 pozzetti. Queste piastre monouso sono progettate per essere utilizzate in modo simile alle piastre di cristallizzazione a diffusione del vapore (pipetta e guarnizione), come mostrato nella Figura 2. Le piastre possono contenere fino a 3,2 μL di proteine e 350 μL di soluzione per dialisi. Ogni pozzetto presenta una membrana di cellulosa rigenerata separata per prevenire la contaminazione incrociata tra i pozzetti. La configurazione richiede circa 10 minuti per essere completata e non richiede alcuna attrezzatura specializzata oltre a quella che si può trovare in tutti i laboratori di cristallizzazione standard. Quattro diverse proteine, tra cui due proteine di membrana, sono utilizzate per dimostrare e convalidare questo approccio come metodo efficace per la cristallografia proteica ad alto rendimento (HTP).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig02.jpg"> Figura 2: Flusso di lavoro di cristallizzazione utilizzando la piastra di microdialisi . (A) Rimozione della "pellicola di copertura" adesiva rossa. (B) Erogare le goccioline proteiche in ciascuno dei pozzetti di goccia. (C) I pozzetti sono coperti con la "pellicola di copertura" UV. (D) La piastra viene capovolta per aggiungere le soluzioni di dialisi (o schermo di cristallizzazione). (E) La piastra è sigillata e incubata. (F,G) Ispezione al microscopio delle gocce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
L'uso di questa cristallizzazione mediante protocollo di dialisi è stato dimostrato utilizzando il tubo dializzatore da 0,5 mL (Figura 3) per la produzione su larga scala (da centinaia a migliaia) di microcristalli, adatti per metodi di raccolta dati all'avanguardia come la cristallografia seriale in entrambe le strutture XFEL 20,21,22,23,24 e sincrotroni25,26,27 , così come per gli approcci MicroED28,29,30.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig03.jpg"> Figura 3: Cristallizzazione in microdialisi su larga scala mediante il tubo dializzatore . (A) Rappresentazione schematica del tubo dializzatore da 0,5 ml. (B) Vista laterale di un becher contenente la soluzione di cristallizzazione e della cremagliera galleggiante contenente un tubo dializzatore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0620</td>
			<td>For aliquoting protein solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>17823----------K</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate filters. For filtering dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSTF04700</td>
			<td>Membrane filters for filtering large volumes of buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 0.5 &#8211; 10 &#181;L Research plus pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000028</td>
			<td>For dispensing protein drops onto the Diaplate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 30 &#8211; 300 &#181;L Eppendorf Research plus pipette&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000060</td>
			<td>For dispensing dialysis solutions on the Diaplate reservoirs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15889152</td>
			<td>For use with syringe filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2.2 mL deep-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0788</td>
			<td>Polypropylene deep-well storage plates; for preparing screens using the Hamilton Microlab STARlet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000565</td>
			<td>With rotor FA-24x2 with a maximum g-force of 21,300 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diacon dialyser</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W72010</td>
			<td>Dialyzer tubes with a regenerated cellulose membrane with a molecular weight cut-off of 10 kDa. Ideal for protein solutions of up to 0.5 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaplate 96-well plate</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W82010</td>
			<td>Microdialysis plate. The Diaplate consists of two sides with a regenerated cellulose membrane in-between with a molecular weight cut-off of 10 kDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For holding dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating rack</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diacon kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor-standing vibration-free incubator</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD5-01</td>
			<td>400 L temperature-controlled incubator set to 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 C stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Planapo 1.0x objective, 7.8x &#8211; 160x zoom range with DMC 4500 camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memgold2</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-64</td>
			<td>Sparse-matrix screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlab STARlet</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable bottle top filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>DS0320-5045</td>
			<td>For fitering large volumes of buffers, for use with 0.22 &#181;m membrane filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing paddle</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput protein crystallization via microdialysis

Comprendere le relazioni struttura-funzione delle macromolecole, come le proteine, a livello molecolare è vitale per la biomedicina e la moderna scoperta di farmaci. Ad oggi, la cristallografia a raggi X rimane il metodo di maggior successo per risolvere strutture proteiche tridimensionali a risoluzione atomica. Con i recenti progressi nella cristallografia seriale, utilizzando laser a elettroni liberi a raggi X (XFEL) o sorgenti di luce di sincrotrone, la cristallografia proteica è progredita verso la frontiera successiva, dove la capacità di acquisire dati risolti nel tempo fornisce importanti intuizioni meccanicistiche sul comportamento delle molecole biologiche a temperatura ambiente. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro HTP (High-Throughput) semplice per lo screening delle condizioni di cristallizzazione attraverso l'uso di una piastra di dialisi a 96 pozzetti. Queste piastre seguono lo standard della Society for Biomolecular Screening (SBS) e possono essere facilmente configurate utilizzando qualsiasi laboratorio di cristallizzazione standard. Una volta identificate le condizioni ottimali, è possibile produrre grandi quantità di cristalli (centinaia di microcristalli) utilizzando il dializzatore. Per convalidare la robustezza e la versatilità di questo approccio, sono state cristallizzate quattro diverse proteine, tra cui due proteine di membrana.

Quattro proteine sono state cristallizzate utilizzando la piastra di microdialisi (con membrane MWCO da 10 kDa), incluse due proteine di membrana. Il lisozima albume d'uovo di gallina dalla polvere liofilizzata (vedi Tabella dei materiali) è stato preparato a 50 mg.mL-1 in 20 mM NaOAc (pH 4,5) e la taumatina liofilizzata (vedi Tabella dei materiali) è stata sciolta in acqua ad una concentrazione finale di 25 mg.mL-1. Le due proteine di membrana utilizzate in questo studio erano la pompa di efflusso multifarmaco AcrB di E. coli e il trasportatore del lattosio di E. coli LacY. L'AcrB è stato espresso utilizzando cellule C43 (DE3) e purificato mediante cromatografia di affinità Ni-NTA e cromatografia ad esclusione dimensionale in 10 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl, 0,03% (p/v) n-dodecil-β-D-maltoside (DDM) e 5% (v/v) glicerolo32. Successivamente, la proteina è stata concentrata utilizzando un concentratore centrifugo MWCO da 100 kDa a una concentrazione finale di 6 mg.mL-1. LacY è stato espresso anche nelle cellule C43 (DE3), purificate mediante cromatografia di affinità Ni-sefosio seguita da cromatografia di esclusione dimensionale in 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,03% (p/v) DDM e concentrato utilizzando un concentratore MWCO da 100 kDa a 10 mg.mL-1 4,33.
Per le proteine del lisozima e della taumatina, la piastra di microdialisi a 96 pozzetti è stata riempita con uno schermo a griglia di cristallizzazione preparato internamente come soluzione di dialisi, mentre per la proteina di membrana AcrB, uno schermo griglia è stato preparato internamente da una condizione di cristallizzazione precedentemente pubblicata34. Per LacY, le condizioni iniziali di successo sono state trovate da uno schermo commerciale (vedi Tabella dei materiali) e ulteriormente ottimizzate con uno schermo a griglia realizzato internamente. Il rapporto di caduta di cristallizzazione per lisozima, taumatina e AcrB era 1:100, con 2 μL di proteine per 200 μL di precipitante (soluzione di dialisi). Anche le gocce di cristallizzazione di LacY erano in rapporto 1:100, con 1 μL di proteine per 100 μL di soluzione di dialisi, a causa di una minore quantità di proteine disponibili.
I cristalli di tutte e quattro le proteine, comprese le proteine di membrana, hanno iniziato ad apparire tra 1-8 ore a 20 °C dopo la configurazione con la piastra di microdialisi. In questo caso, non è stato necessario integrare la soluzione di dialisi con detergente per la cristallizzazione delle proteine di membrana, tipicamente eseguita durante il processo di dialisi standard per prevenire l'aggregazione proteica della membrana, poiché ci si aspettava che le micelle detergenti fossero più grandi dell'MWCO delle membrane di dialisi35.
Dopo la riuscita cristallizzazione delle proteine sulla piastra di microdialisi (Figura 4), sono state osservate condizioni di cristallizzazione e la cristallizzazione su larga scala mediante dialisi è stata eseguita utilizzando il tubo dializzatore con le stesse membrane di dialisi MWCO da 10 kDa. Migliaia di microcristalli per ciascuna delle singole proteine sono cresciuti all'interno del dializzatore, come mostrato nella Figura 5. Per la cristallizzazione della taumatina, 250 μL di proteine sono stati caricati sul dializzatore e dializzati contro 50 ml (rapporto 1:200). Per AcrB, 250 μL di proteine sono stati dializzati contro 25 ml di soluzione di dialisi (1:100). Anche la cristallizzazione di LacY è stata stabilita allo stesso rapporto con 100 μL di proteine per 10 ml di soluzione di dialisi.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig04.jpg"> Figura 4: I cristalli vengono coltivati mediante dialisi utilizzando la piastra di microdialisi. Il protocollo dimostra l'applicabilità del setup con proteine solubili: (A) Il lisozima è stato dializzato contro 0,1 M NaOAc (pH 4,0), 0,5 M NaCl e 25% (v / v) glicerolo. (B) Thaumatin è stato dializzato contro 0,1 M Bis-tris propano (pH 6,6), 1 M K / Na tartrato e 18% (v / v) glicole etilenico. I cristalli sono stati ottenuti anche per le proteine di membrana: (C) AcrB è stato dializzato contro 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl e 20% (v / v) PEG-400. (D) LacY è stato dializzato contro 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl e 32% (v/v) PEG-300. Le immagini sono state catturate utilizzando un microscopio stereo ad alto ingrandimento con un polarizzatore incrociato. Barre della scala: (A,B,D) = 1 mm; (C) = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig05.jpg"> Figura 5: Immagini rappresentative di cristalli proteici di membrana cresciuti mediante dialisi mediante tubo dializzatore. (A) Immagine che mostra il tubo pieno di microcristalli (indicato dalla freccia nera). (B) Immagine microscopica di 2 μL da un impasto di cristalli di taumatina cresciuti mediante dialisi utilizzando il tubo dializzatore da 0,5 ml, dializzato contro propano Bis-Tris 0,1 M (pH 6,6), tartrato di 1,4 M K/Na e glicole etilenico al 18% (v/v). (C) Immagini in campo scuro (a sinistra) e in campo chiaro (a destra) di microcristalli di AcrB cresciuti per dialisi contro 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl e 20% (v/v) PEG-400. (D) Immagini in campo scuro (a sinistra) e in campo chiaro (a destra) di microcristalli di LacY cresciuti mediante dialisi contro 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl e 32% (v/v) PEG-300. Si osservano alcuni precipitati. Barre della scala: (B,D) = 200 μm; (C) = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

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High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Il protocollo presentato descrive un approccio semplice per lo screening delle condizioni di cristallizzazione delle proteine e la crescita dei cristalli utilizzando una piastra di dialisi ad alto rendimento a 96 pozzetti. L'uso di tubi dializzatori per la crescita su larga scala di microcristalli è dimostrato anche per la cristallografia seriale e le applicazioni MicroED.

Cristallizzazione delle proteine ad alto rendimento tramite microdialisi

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

La cristallizzazione mediante dialisi è un metodo sottoutilizzato. Questo protocollo presenta un approccio Novo a questo, che aumenterà la gamma di strategie di cristallizzazione attualmente disponibili per la determinazione strutturata. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è ad alta produttività, semplice da configurare senza necessità di attrezzature specialistiche e consente un facile monitoraggio della crescita dei cristalli.La persona che esegue questa tecnica deve avere dimestichezza con il pipettaggio a basso volume e con l'uso di pipette multicanale. Le gocce devono essere pipettate il più possibile per prevenire la disidratazione parziale. Per impostare l'esperimento di microdialisi, posizionare una piastra di microdialisi a 96 pozzetti disponibile in commercio nell'orientamento rivolto verso l'alto delle proteine e rimuovere il nastro adesivo di copertura staccando il distanziatore adesivo a pressione da 200 micron.Dopo aver staccato il nastro adesivo di copertura, notare la posizione del pozzetto A1. Successivamente, utilizzando una pipetta multicanale, caricare un massimo di 3,2 microlitri di campione proteico adeguatamente preparato in ciascun pozzetto. Posizionare correttamente la pellicola di copertura UV da 200 micron sulla piastra a 96 pozzetti con la pellicola rivolta verso l'alto. Quindi, per attivare e sigillare l'adesivo a pressione, premere verso il basso sulla pellicola di copertura UV utilizzando una paletta sigillante e verificarne l'integrità.Ora, capovolgere la piastra per portarla all'orientamento del lato tampone verso l'alto e prendere nota della posizione speculare del pozzetto contrassegnato A1. Utilizzando una pipetta multicanale, caricare un massimo di 350 microlitri della soluzione di dialisi in ciascun pozzetto della piastra e sigillare accuratamente i pozzetti con il film di copertura del serbatoio. Quindi, posizionare la piastra con il lato tampone verso l'alto all'interno di un'incubatrice adatta a temperatura controllata a 20 gradi Celsius per consentire la crescita dei cristalli. Per esaminare la formazione di cristalli al microscopio, rimuovere la pellicola protettiva di copertura dalla pellicola di copertura UV da 200 micron e posizionare la piastra sotto l'oculare con il lato proteico rivolto verso l'alto.Per impostare un esperimento di cristallizzazione su larga scala, adottare le condizioni in cui si è verificata la crescita dei microcristalli nella piastra di microdialisi e replicare le stesse condizioni in contenitori di grandi dimensioni. Selezionare la dimensione del contenitore in base al volume della soluzione di dialisi. Pipettare un volume massimo di 500 microlitri di campione proteico nel tubo del dializzatore prima di sigillare il tubo utilizzando il tappo di plastica rosso.Posizionare il tubo dializzatore sigillato da 500 microlitri nel rack galleggiante all'interno del contenitore riempito con la soluzione di dialisi. Quindi, posizionare il contenitore indisturbato all'interno di un'incubatrice a temperatura controllata adatta a 20 gradi Celsius per ottenere una crescita cristallina. Per verificare la formazione di cristalli, pipettare da uno a due microlitri della soluzione dal dializzatore su un vetrino di vetro.Coprire la soluzione sul vetrino con un altro vetrino e visualizzarlo al microscopio. Le immagini catturate utilizzando un microscopio stereo ad alto ingrandimento hanno mostrato la riuscita formazione di microcristalli di quattro proteine utilizzando le piastre di microdialisi con membrane di cutoff del peso molecolare da 10 kilodalton. Si è scoperto che il lisozima forma cristalli quando dializzato contro l'acetato di sodio molare 0,1 a pH 4 contenente additivi appropriati.La domatina ha formato cristalli quando dializzati contro 0,1 molari bis-tris propano a pH 6,6 contenenti additivi appropriati. Le condizioni di dialisi ottimizzate hanno portato alla formazione di microcristalli da parte delle proteine di membrana, vale a dire la proteina AcrB della pompa di efflusso multifarmaco E.coli e il trasportatore del lattosio E.coli LacY. La cristallizzazione su larga scala nei tubi dializzatori che impiegano le condizioni di dialisi ottimizzate ottenute dagli esperimenti di microdialisi ha portato alla formazione di migliaia di microcristalli per ciascuna delle proteine.Per la cristallizzazione della fomitina, sono stati dializzati 250 microlitri di proteine contro 50 millilitri della soluzione di dialisi. Per AcrB, 250 microlitri della proteina sono stati dializzati contro 25 microlitri di soluzione di dialisi. Anche la cristallizzazione LacY è stata impostata allo stesso rapporto, con 100 microlitri di proteine per 10 millilitri di soluzione di dialisi.Quando si inverte la piastra verso l'alto, è importante notare la posizione di A1, in modo che le soluzioni dallo schermo di cristallizzazione possano essere erogate di conseguenza. I cristalli ottenuti da questo metodo possono essere utilizzati per applicazioni a valle, come la cristallografia seriale e la micro ED.

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High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

High Throughput, assoluta determinazione del contenuto di una proteina selezionato presso i livelli del tessuto utilizzando quantitativi Dot Blot analisi (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Tecnologia di Microarray di proteina extracellulare per il rilevamento di Throughput elevato di interazioni recettore-ligando bassa affinità

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Screening strategico e caratterizzazione del complesso di segnalazione delle proteine Visual GPCR-mini-G per una cristallizzazione di successo

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Un sistema di purificazione delle proteine ad alta produttività economico e versatile che utilizza un adattatore a piastre multi-colonna

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Un saggio di fluorescenza del calcio "a doppia aggiunta" per lo screening ad alta produttività dei recettori accoppiati a proteine G ricombinanti

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Screening ad alta produttività per ottenere colpi cristallini per la cristallografia proteica

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...