Name: high-throughput protein crystallization via microdialysis
Uploaded: 2023-03-03T14:05:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis at JoVE.com

Vi anerkjenner finansiering fra Storbritannias Department of Business, Energy and Industrial Strategy (BEIS). Vi takker Alex R. Jones og Mike Shaw fra National Physical Laboratory for tilbakemeldinger på manuskriptet.

1. Forberedelse av proteinprøver
<ol><li>Forbered (gjennom rekombinante metoder eller på annen måte) og rens proteinet (e) av interesse i en egnet buffer (dvs. en som er egnet for proteinstabilitet og krystallisering) som har blitt filtrert med et 0,22 μm filter (se materialfortegnelse). Evaluer proteinkvaliteten (med hensyn til renhet, polydispergering og stabilitet) før krystallisering31. MERK: Vennligst se avsnittet om representative resultater for detaljer om proteiner og buffere som ble brukt i denne studien.</li>
	<li>Konsentrer prøven opp til 10-50 mg.mL-1 eller høyere (avhengig av proteinmålet) ved hjelp av riktig MWCO-konsentrator (se materialfortegnelse). MERK: Den konsentrerte prøven kan brukes umiddelbart til krystallisering eller lagres frosset ved -80 °C.</li>
	<li>Hvis proteinet har vært frosset, sentrifuger prøven i 10 minutter i en benksentrifuge (≥16 000 × g, ved romtemperatur eller 4 ° C) for å pelletere og fjerne uønsket materiale (f.eks. utfellinger).</li>
	<li>Aliquot proteinet i rene 200 μL PCR-rør. Oppbevares på is eller ved 4 °C hvis proteinet er ustabilt ved romtemperatur.</li>
</ol>2. Oppsett av mikrodialyseplaten
MERK: Den kommersielt tilgjengelige mikrodialyseplaten (se materialfortegnelse) består av to sider ("proteinside" og "bufferside") med en regenerert cellulosemembran (tilgjengelig i forskjellige MWCOer), som vist i figur 2.
<ol><li>Med tallerkenorientert proteinside opp, riv av og fjern det selvklebende dekselbåndet (figur 2A) fra det 200 μm trykkklebende avstandsstykket. Legg merke til posisjonen til brønn A1.</li>
	<li>Bruk en flerkanalspipette til å legge maksimalt 3,2 μL protein (trinn 1,4) i hver brønn (figur 2B). MERK: Proteinet kan også lastes ved hjelp av en pipette med gjentatt dispensering. Det er mulig å bruke en enkanals pipette, men det vil øke sannsynligheten for delvis dehydrering av dråpene som oppstår på grunn av den utvidede lastetiden.</li>
	<li>Plasser 200 μm UV-dekselfilmen (se materialfortegnelse) over 96-brønnsplaten og kontroller integriteten (figur 2C). Forsikre deg om at beskyttelsesfilmen vender oppover.</li>
	<li>Bruk en tetningsåre (se Materialfortegnelse), trykk ned UV-dekselfilmen for å aktivere og forsegle trykklimet.</li>
	<li>Inverter platen og legg merke til posisjonen til brønn A1. Sørg for at platen er orientert buffersiden opp og at brønnposisjonene speiles (figur 2D).</li>
	<li>Bruk en flerkanalspipette til å laste maksimalt 350 μl av dialyseløsningen inn i hver av brønnene (figur 2D). MERK: I dette trinnet kan enten kommersielt tilgjengelige krystallisasjonsskjermer (sparsomme matriseskjermer) eller laboratorielagde tilpassede skjermer (rutenettskjermer) brukes (se materialfortegnelse).</li>
	<li>Forsegl brønnene forsiktig med "reservoardekkfilmen" (se materialfortegnelse) (figur 2E).</li>
	<li>Plasser platen (buffersiden opp) i en egnet temperaturkontrollert inkubator (20 °C) for krystallvekst. MERK: For proteinene som ble valgt for denne studien, begynte krystallene å vises mellom 1-8 timer ved 20 ° C.</li>
	<li>For å inspisere for krystaller under mikroskopet, snu platen for å bringe proteinsiden opp og fjern beskyttelsesfilmen fra 200 μm UV-dekselfilmen (trinn 2.3), som vist i figur 2F, G.</li>
</ol>3. Storskala krystallisering ved bruk av dialyserrør
MERK: Når krystallisasjonsbetingelsene er utforsket ved bruk av mikrodialyseplaten, kan storskala krystallisering av proteinet (for seriell krystallografi eller andre formål) utføres ved bruk av dialyserrøret, som vist i figur 3. I likhet med mikrodialyseplaten er disse enhetene tilgjengelige med 3, 5, 10 og 30 kDa MWCO dialysemembraner.
<ol><li>Forbered den optimaliserte krystallisasjonsbetingelsen for vekst av mikrokrystaller i store beholdere (vedta betingelsene optimalisert ved hjelp av mikrodialyseplaten). Forsikre deg om at bufferen tidligere har blitt filtrert med et 0,2 μm filter.</li>
	<li>Pipetter proteinet inn i dialyserrøret (maksimalt volum på 0,5 ml) og forsegl enden med den medfølgende røde plasthetten (figur 3A).</li>
	<li>Plasser 500 μL dialyserrøret i en beholder av passende størrelse (avhengig av det totale volumet av dialyseoppløsningen) som inneholder det flytende stativet (se materialfortegnelsen), som vist i figur 3B. MERK: Det flytende stativet som følger med dialysersettet, rommer opptil 18 dialyserrør samtidig.</li>
	<li>Plasser beholderen stasjonær i en egnet temperaturkontrollert inkubator (20 °C) for krystallvekst.</li>
	<li>For å inspisere for krystaller, pipett 1-2 μL av løsningen på et glassdeksel. Dekk til med et nytt glassdeksel på toppen (for å forhindre overflødig dehydrering) og se under et mikroskop (se materialfortegnelse). MERK: Krystaller kan bli skadet når de klemmes mellom to glassglassglass under inspeksjonen. Krystaller kan også sees direkte ved å plassere dialyserrøret under et stereo høyforstørrelsesmikroskop.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brooks-Bartlett, J. C., Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nobel+science:+One+hundred+years+of+crystallography.">The nobel science: One hundred years of crystallography.</a> Interdisciplinary Science Reviews. 40 (3), 244-264 (2015).</li><li>Maveyraud, L., Mourey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+X-ray+crystallography+and+drug+discovery.">Protein X-ray crystallography and drug discovery.</a> Molecules. 25 (5), (2020).</li><li>Kwan, T. O. C., Axford, D., Moraes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+crystallography+in+the+era+of+modern+structural+biology.">Membrane protein crystallography in the era of modern structural biology.</a> Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2505-2524 (2020).</li><li>Birch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+art+of+integral+membrane+protein+crystallisation.">The fine art of integral membrane protein crystallisation.</a> Methods. 147, 150-162 (2018).</li><li>Gorrec, F., L&#246;we, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protocols+for+macromolecular+crystallization+at+the+MRC+laboratory+of+molecular+biology.">Automated protocols for macromolecular crystallization at the MRC laboratory of molecular biology.</a> Journal of Visualized Experiments. 131 (131), (2018).</li><li>Govada, L., Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+method+of+crystallization+to+obtain+optimal+results.">Choosing the method of crystallization to obtain optimal results.</a> Crystals. 9 (2), 106 (2019).</li><li>Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+protein+crystallisation+from+an+art+into+science.">Turning protein crystallisation from an art into science.</a> Current Opinion in Structural Biology. 14 (5), 577-583 (2004).</li><li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li><li>Gulbis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallography:+methods+and+protocols.">Protein crystallography: methods and protocols.</a> Crystallography Reviews. 24 (2), 136-143 (2018).</li><li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization:+What+have+we+learned.">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned.</a> Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 70 (9), 1117-1126 (2014).</li><li>Shaw Stewart, ., D, P., Kolek, S. A., Briggs, R. A., Chayen, N. E., Baldock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+microseeding:+a+theoretical+and+practical+exploration+of+seed+stability+and+seeding+techniques+for+successful+protein+crystallization.">Random microseeding: a theoretical and practical exploration of seed stability and seeding techniques for successful protein crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Junius, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+both+on-chip+dialysis+protein+crystallization+and+in+situ+X-ray+diffraction.">A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction.</a> Lab on a Chip. 20 (2), 296-310 (2020).</li><li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control.">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), 686-698 (2020).</li><li>Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystal+growth+for+neutron+macromolecular+crystallography.">Optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. 169, (2021).</li><li>Jaho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+proteins+on+chip+by+microdialysis+for+in+situ+X-ray+diffraction+studies.">Crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ X-ray diffraction studies.</a> Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, 2501 (2011).</li><li>Ujwal, R., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+using+the+lipidic+bicelle+method.">High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method.</a> Journal of Visualized Experiments. 59, (2012).</li><li>Parker, J. L., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+crystallisation:+Current+trends+and+future+perspectives.">Membrane protein crystallisation: Current trends and future perspectives.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 922. , 61-72 (2016).</li><li>Apostolopoulou, V., Junius, N., Sear, R. P., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing+salts+and+polyethylene+glycol+into+protein+solutions:+The+effects+of+diffusion+across+semi-permeable+membranes+and+of+convection.">Mixing salts and polyethylene glycol into protein solutions: The effects of diffusion across semi-permeable membranes and of convection.</a> Crystal Growth &amp; Design. 20 (6), 3927-3936 (2020).</li><li>Neutze, R., Wouts, R., Vander Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+biomolecular+imaging+with+femtosecond+X-ray+pulses.">Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses.</a> Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).</li><li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography.">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-78 (2011).</li><li>Mizohata, E., Nakane, T., Fukuda, Y., Nango, E., Iwata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography+at+the+SACLA:+breakthrough+to+dynamic+structural+biology.">Serial femtosecond crystallography at the SACLA: breakthrough to dynamic structural biology.</a> Biophysical Reviews. 10 (2), 209-218 (2018).</li><li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation.">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).</li><li>Johansson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XFEL+structures+of+the+human+MT2+melatonin+receptor+reveal+the+basis+of+subtype+selectivity.">XFEL structures of the human MT2 melatonin receptor reveal the basis of subtype selectivity.</a> Nature. 569 (7755), 289-292 (2019).</li><li>Owen, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+fixed-target+serial+synchrotron+crystallography.">Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (4), 373-378 (2017).</li><li>Weinert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+millisecond+crystallography+for+routine+room-temperature+structure+determination+at+synchrotrons.">Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons.</a> Nature communications. 8 (1), 542 (2017).</li><li>Axford, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+states+of+a+light-sensitive+membrane+protein+captured+at+room+temperature+using+thin-film+sample+mounts.">Two states of a light-sensitive membrane protein captured at room temperature using thin-film sample mounts.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 52-58 (2022).</li><li>Nannenga, B. L., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cryo-EM+method+microcrystal+electron+diffraction+(MicroED).">The cryo-EM method microcrystal electron diffraction (MicroED).</a> Nature Methods. 16 (5), 369-379 (2019).</li><li>Nguyen, C., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+protein+structure+determination+with+MicroED.">Beyond protein structure determination with MicroED.</a> Current Opinion in Structural Biology. 64, 51-58 (2020).</li><li>Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+microcrystal+electron+diffraction+(MicroED).">An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED).</a> Annual Review of Biochemistry. 90, 431-450 (2021).</li><li>Kwan, T. O. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+biophysical+methods+for+characterisation+of+membrane+proteins.">Selection of biophysical methods for characterisation of membrane proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 2605 (2019).</li><li>Pos, K. M., Purification Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=crystallization+and+preliminary+diffraction+studies+of+AcrB,+an+inner-membrane+multi-drug+efflux+protein.">crystallization and preliminary diffraction studies of AcrB, an inner-membrane multi-drug efflux protein.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (10), 1865-1867 (2002).</li><li>Guan, L., Mirza, O., Verner, G., Iwata, S., Kaback, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+wild-type+lactose+permease.">Structural determination of wild-type lactose permease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (39), 15294-15298 (2007).</li><li>Kwan, T. O. C., Reis, R., Moraes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+measurements+of+polypeptide+samples+by+dynamic+light+scattering:+membrane+proteins,+a+case+study.">In situ measurements of polypeptide samples by dynamic light scattering: membrane proteins, a case study.</a> Methods in Molecular Biology. , 189-202 (2021).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Wickstrand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tool+for+visualizing+protein+motions+in+time-resolved+crystallography.">A tool for visualizing protein motions in time-resolved crystallography.</a> Structural Dynamics. 7 (2), 024701 (2020).</li><li>Orville, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+results+in+time+resolved+serial+femtosecond+crystallography+at+XFELs.">Recent results in time resolved serial femtosecond crystallography at XFELs.</a> Current Opinion in Structural Biology. 65, 193-208 (2020).</li><li>Schulz, E. C., Yorke, B. A., Pearson, A. R., Mehrabi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+time-resolved+serial+synchrotron+crystallography.">Best practices for time-resolved serial synchrotron crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 14-29 (2022).</li><li>Neutze, R., Br&#228;nd&#233;n, G., Schertler, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+structural+biology+using+X-ray+free+eletron+lasers.">Membrane protein structural biology using X-ray free eletron lasers.</a> Current Opinion in Structural Biology. 33, 115-125 (2015).</li><li>Wierstall, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+sample+delivery+techniques+for+serial+femtosecond+crystallography.">Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).</li><li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals.">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345 (2013).</li></ol>

Medforfatterne Pascelle Draper og Paul Reardon er ansatt i SWISSCI.

For tiden er krystallisering ved dialyse den mest underutnyttede krystallisasjonsmetoden, nemlig på grunn av den lave gjennomstrømningen og kjedelige naturen til de eksisterende tilnærmingene, for eksempel mikrodialyse med knapper. Her følger en enkel, men robust protokoll en HTP-arbeidsflyt for proteinkrystallvekst ved dialyse gjennom en kommersielt tilgjengelig mikrodialyseplate og dialyserrør. Avhengig av målproteinet kommer mikrodialyseplaten og dialyserrøret som brukes i prosedyren med et valg av en dialysemembran med en 3, 5, 10 eller 30 kDa MWCO. Protokollen kan enkelt settes opp i et hvilket som helst standard krystallisasjonsanlegg og har den store fordelen av å kunne brukes på både løselige og membranproteiner. Imidlertid ble protein-protein og protein-nukleinsyrekomplekser ikke testet under denne protokollen.
Som i enhver krystallisasjonstilnærming ved dialyse, er volumforholdet mellom proteinprøven og dialyseløsningen kritisk. I denne protokollen anbefales et forhold på 1:100 mellom prøven og dialyseoppløsningen, men siden mikrodialyseplaten tillater en maksimal kapasitet på 350 μL dialyseløsning, kan disse forholdene utforskes for å oppnå krystalltreff. Et volum på 1-2 μl protein brukes i den presenterte protokollen ved oppsett av krystallisasjonsplater. Dette er for å sikre at dråper settes nøyaktig med en manuell flerkanalspipette. Ved å bruke elektroniske pipetter (flerkanals eller gjentatte påføringspipetter) eller HTP væskedispenseringsroboter, kan dråper med lavere volum oppnås nøyaktig, og dermed redusere mengden protein som kreves. Videre, på grunn av de relativt lave volumene av dialysebuffer som kreves av mikrodialyseplaten (i motsetning til andre konvensjonelle dialysemetoder), er det mulig (uten omfattende bruk av ressurser) å utforske store kjemiske rom, ikke bare ved hjelp av kommersielt tilgjengelige krystallisasjonsskjermer, men også med optimaliseringsskjermer (designet rundt den første krystallisasjonstrefftilstanden).
Et kritisk trinn i den presenterte HTP-prosedyren er rettidig påføring av små proteinvolumer (0,50-3,2 μL per tilstand) til dialyseplaten for å begrense dehydrering og prøvetap. Dette kan enkelt reduseres ved å bruke en flerkanalspipett, en pipette med gjentatt dispensering eller et robotkrystallisasjonssystem. Den lange inkubasjonstiden, for eksempel mer enn 2 uker, av platene ved 20 ° C kan føre til dehydrering av proteindråpene eller skade på de nylig dannede krystallene. Å holde dialyseplatene inne i et fuktingskammer eller en forseglbar pose kan lindre denne effekten. I tillegg anbefales bruk av sterile materialer og teknikker for å unngå bakterievekst.
Som nevnt i introduksjonen, nylig, med økt behov for å forstå proteinstrukturell dynamikk for sykdomsmekanismer, protein-ligandbindende interaksjoner og protein-protein-interaksjoner, har feltet proteinrøntgenkrystallografi blitt revolusjonert gjennom utvikling av nye og eksisterende krystallisasjonsteknikker, moderne tilnærminger til krystallprøvelevering, nye generasjoner røntgenkilder og nye sofistikerte metoder for datainnsamling og behandling36 ,37,38. Derfor har fremkomsten av romtemperatur seriell mikrokrystallografi, enten utført ved hjelp av XFEL eller synkrotronlyskilder, dukket opp som et bemerkelsesverdig verktøy i strukturbiologi, spesielt innen membranproteiner39. Imidlertid kreves det tusenvis av mikrokrystaller for å generere nok data til en robust strukturløsning, noe som ikke er en lett oppgave (i det minste ved konvensjonelle krystallisasjonsmetoder). Dialysekrystallisasjonsmetoden beskrevet her muliggjør produksjon av et stort antall mikrokrystaller. Når krystallisasjonsbetingelsen for produksjon av mikrokrystaller (1-10 μm) er bestemt ved bruk av en mikrodialyseplate, kan store mengder mikrokrystaller med høy tetthet produseres ved bruk av 0,5 ml dialyserapparatet (figur 5). Disse krystallene er ideelt egnet for datainnsamling ved hjelp av faste mål eller flytende stråleprøveleveringssystemer27,40. Krystaller oppnådd gjennom denne metoden kan også være aktuelle for MicroED-applikasjoner. Imidlertid må disse kanskje freses ned til en passende størrelse og tykkelse for denne spesifikke applikasjonen, da elektroner interagerer mye sterkere med krystaller enn røntgenfotoner41.
Avslutningsvis legger krystalliseringen ved dialysetilnærming beskrevet her til de utviklende strategiene i proteinkrystallisering for strukturbestemmelse og utvider innsatsområdet enn det som kan brukes til å bestemme nye proteinmål som tidligere har vært mislykket med andre konvensjonelle metoder.

I løpet av det siste århundret har røntgenkrystallografi vært avgjørende for å belyse og forstå struktur-funksjonsparadigmet til biologiske makromolekyler. Til dags dato fortsetter det å være en av de mest vellykkede metodene for å belyse atomoppløsningsstrukturer av mange unikt forskjellige proteiner som er avgjørende for den grunnleggende forståelsen av cellebiokjemi, medisin og tidlig legemiddeloppdagelse 1,2. Imidlertid forblir proteinkrystallisering en flaskehals ved å studere mange proteinmål, spesielt membranproteiner og store proteinkomplekser3. Følgelig er proteinkrystallisering nesten alltid ansett som en kunst på grunn av de arbeidsintensive prøve-og-feil-tilnærmingene som brukes 4,5,6.
Et utfellingsmiddel tilsettes vanligvis til en proteinløsning ved høy konsentrasjon for å danne et velordnet, vanlig og repeterende gitterarrangement av proteinmolekyler, kjent som krystaller. Under gunstige forhold, som temperatur, pH, konsentrasjon og utfellingsmiddel, dannes til slutt en overmettet løsning, etterfulgt av krystallkjernedannelse og vekst 7,8. Selv om det har vært mange fremskritt i krystallisasjonsforsøksoppsett, hovedsakelig med utvikling av robotsystemer med høy gjennomstrømning og tilgjengeligheten av ferdige "sparsomme matrise" -skjermer, har de generelle tilnærmingene til proteinkrystallisering stort sett vært uendret gjennom årene. Vanlige eksperimentelle proteinkrystallisasjonsteknikker inkluderer dampdiffusjon (hengende dråpe og sittende dråpe)9, mikrobatch (under olje)10,11, fri grensesnittdiffusjon (mikrofluidiske enheter)12 og dialyse (ved hjelp av knapper og andre teknikker)13,14,15. Imidlertid finnes det også andre mer spesialiserte oppsett, for eksempel mesofasetilnærminger for krystallisering av membranproteiner16,17. Mens flertallet av røntgenproteinstrukturer deponert i Protein Data Bank hittil har blitt løst gjennom krystallisering ved dampdiffusjonsmetoder 6,18, synes andre tilnærminger, som krystallisering ved dialyse, å være underutnyttet, sannsynligvis på grunn av de praktiske aspektene knyttet til deres eksperimentelle oppsett.
Krystallisering ved dialyse er ganske enkelt avhengig av langsom diffusjon av oppløsninger (utfellingsmidler, ioner, tilsetningsstoffer og buffere) gjennom en semi-permeabel membran som samtidig forhindrer proteinmolekyler i å sirkulere. På denne måten bringes proteinoppløsningen langsomt i likevekt, med bunnfallet som når den nødvendige konsentrasjonen for å krystallisere. Systemets kinetikk avhenger av temperatur, utfellingskonsentrasjon og cellulosemembranens molekylvektavskjæring (MWCO)19. Hittil har det mest populære krystalliseringsoppsettet ved dialyse vært å bruke mikrodialyseknapper laget av gjennomsiktige akrylplater. Disse er vanligvis nedsenket i reservoarer (for det meste ved bruk av dampdiffusjonshengende dråpeplater) som inneholder krystallisasjonsutfellingsløsninger. Denne metoden med lavere gjennomstrømning krever imidlertid også spesifikk montering for å forsegle proteinløsningen i dialysemembranen plassert over knappkammeret, som illustrert i figur 1. Videre er luftbobler fanget mellom dialysemembranen og proteinløsningen et hyppig problem som svekker krystallveksten. En annen begrensning av metoden er prøvekravene, hvor mye høyere konsentrasjoner og volumer er nødvendig sammenlignet med dampdiffusjonsmetoder, for å imøtekomme dialyseknappene. Derfor har krystallisering ved hjelp av mikrodialyseknapper blitt oppfattet som en lite tiltalende metode, spesielt for vanskelige mål som membranproteiner, hvis renseutbytte er frustrerende lavt. Nylig har mikrofluidiske enheter blitt utviklet for å lette proteinkrystallisering ved dialyse15. Disse brikkene er også designet for å ha høy røntgentransparens med lav bakgrunn, slik at sjetongene kan brukes til in situ datainnsamling ved romtemperatur, og eliminerer dermed ulempen ved høsting og kryokjølingskrystaller. Til tross for disse fremskrittene er tilnærmingen fortsatt svært lav gjennomstrømning og dyr.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig01.jpg"> Figur 1 Skjematisk fremstilling av krystallisasjon ved dialyse med dialyseknapper. (A) Skjematisk fremstilling av en krystallisasjonsdialyseknapp. (B) Proteinoppløsningen tilsettes til knappekammeret i mikrodialyse. (C) Dialysemembranen holdes til mikrodialyseknappen ved hjelp av en gummiring (O-ring) påført via en applikator. (D) Dialyseknappen er klar til å senkes ned i reservoaret som inneholder krystallisasjonsløsningen (dialyseoppløsning), som vist i (E). Hetteglasset med nedsenket dialyseknapp må være forseglet for å unngå fordampning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Her presenteres en enkel protokoll for screening av proteinkrystallisasjonsbetingelser og krystallvekst ved bruk av 96-brønns dialyseplate med høy gjennomstrømning. Disse engangsplatene er konstruert for å brukes på samme måte som dampdiffusjonskrystallisasjonsplatene (pipette deretter tetning), som vist i figur 2. Platene har plass til opptil 3,2 μL protein og 350 μL dialyseløsning. Hver brønn har en separat regenerert cellulosemembran for å hindre krysskontaminering mellom brønnene. Oppsettet tar rundt 10 minutter å fullføre og krever ikke noe spesialisert utstyr i tillegg til det som finnes i alle standard krystallisasjonslaboratorier. Fire forskjellige proteiner, inkludert to membranproteiner, brukes til å demonstrere og validere denne tilnærmingen som en effektiv metode for høy gjennomstrømning (HTP) proteinkrystallografi.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig02.jpg"> Figur 2: Arbeidsflyt for krystallisering ved bruk av mikrodialyseplaten. (A) Fjerning av det røde limet "dekselfilm". (B) Dispensering av proteindråpene i hver av dråpebrønnene. (C) Brønnene er dekket med UV "dekkfilm". (D) Platen er invertert for å legge til dialyseløsninger (eller krystallisasjonsskjerm). (E) Platen er forseglet og inkubert. (F,G) Mikroskop inspeksjon av dråpene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Bruken av denne krystalliseringen ved dialyseprotokoll ble demonstrert ved bruk av 0,5 ml dialyserrør (figur 3) for storskala (hundrevis til tusenvis) produksjon av mikrokrystaller, egnet for toppmoderne datainnsamlingsmetoder som seriell krystallografi ved begge XFEL-anleggene 20,21,22,23,24 og synkrotroner25,26,27 , samt for MicroED28,29,30 tilnærminger.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig03.jpg"> Figur 3: Storskala mikrodialysekrystallisering ved bruk av dialyserrøret. (A) Skjematisk fremstilling av 0,5 ml dialyserrøret. (B) Sidevisning av et beger som inneholder krystallisasjonsløsningen og det flytende rørstativet som holder et dialyserrør. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0620</td>
			<td>For aliquoting protein solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>17823----------K</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate filters. For filtering dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSTF04700</td>
			<td>Membrane filters for filtering large volumes of buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 0.5 &#8211; 10 &#181;L Research plus pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000028</td>
			<td>For dispensing protein drops onto the Diaplate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 30 &#8211; 300 &#181;L Eppendorf Research plus pipette&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000060</td>
			<td>For dispensing dialysis solutions on the Diaplate reservoirs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15889152</td>
			<td>For use with syringe filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2.2 mL deep-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0788</td>
			<td>Polypropylene deep-well storage plates; for preparing screens using the Hamilton Microlab STARlet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000565</td>
			<td>With rotor FA-24x2 with a maximum g-force of 21,300 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diacon dialyser</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W72010</td>
			<td>Dialyzer tubes with a regenerated cellulose membrane with a molecular weight cut-off of 10 kDa. Ideal for protein solutions of up to 0.5 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaplate 96-well plate</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W82010</td>
			<td>Microdialysis plate. The Diaplate consists of two sides with a regenerated cellulose membrane in-between with a molecular weight cut-off of 10 kDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For holding dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating rack</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diacon kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor-standing vibration-free incubator</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD5-01</td>
			<td>400 L temperature-controlled incubator set to 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 C stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Planapo 1.0x objective, 7.8x &#8211; 160x zoom range with DMC 4500 camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memgold2</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-64</td>
			<td>Sparse-matrix screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlab STARlet</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable bottle top filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>DS0320-5045</td>
			<td>For fitering large volumes of buffers, for use with 0.22 &#181;m membrane filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing paddle</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput protein crystallization via microdialysis

Å forstå struktur-funksjonsforholdene til makromolekyler, som proteiner, på molekylært nivå er avgjørende for biomedisin og moderne legemiddeloppdagelse. Til dags dato er røntgenkrystallografi fortsatt den mest vellykkede metoden for å løse tredimensjonale proteinstrukturer ved atomoppløsning. Med nylige fremskritt innen seriell krystallografi, enten ved bruk av røntgenfrie elektronlasere (XFEL) eller synkrotronlyskilder, har proteinkrystallografi kommet til neste grense, hvor evnen til å skaffe tidsoppløste data gir viktig mekanistisk innsikt i oppførselen til biologiske molekyler ved romtemperatur. Denne protokollen beskriver en enkel arbeidsflyt med høy gjennomstrømning (HTP) for screening av krystallisasjonsforhold ved bruk av en 96-brønns dialyseplate. Disse platene følger Society for Biomolecular Screening (SBS) standard og kan enkelt settes opp ved hjelp av et hvilket som helst standard krystallisasjonslaboratorium. Når optimale forhold er identifisert, kan store mengder krystaller (hundrevis av mikrokrystaller) produseres ved hjelp av dialysatoren. For å validere robustheten og allsidigheten til denne tilnærmingen ble fire forskjellige proteiner krystallisert, inkludert to membranproteiner.

Fire proteiner ble krystallisert ved hjelp av mikrodialyseplaten (med 10 kDa MWCO-membraner), inkludert to membranproteiner. Kyllingeggehvitlysozymet fra det lyofiliserte pulveret (se materialtabellen) ble fremstilt ved 50 mg.mL-1 i 20 mM NaOAc (pH 4,5), og det lyofiliserte thaumatinet (se materialtabell) ble oppløst i vann til en endelig konsentrasjon på 25 mg.mL-1. De to membranproteinene som ble brukt i denne studien var E. coli multidrug efflux pump AcrB og E. coli laktosetransportøren LacY. AcrB ble uttrykt ved bruk av C43 (DE3) celler og renset ved Ni-NTA affinitetskromatografi og størrelse-eksklusjonskromatografi i 10 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl, 0,03% (w / v) n-dodecyl-β-D-maltosid (DDM) og 5% (v / v) glyserol32. Deretter ble proteinet konsentrert ved hjelp av en 100 kDa MWCO sentrifugalkonsentrator til en endelig konsentrasjon på 6 mg.mL-1. LacY ble også uttrykt i C43 (DE3) celler, renset av Ni-sepharose affinitetskromatografi etterfulgt av størrelse-eksklusjonskromatografi i 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,03% (w / v) DDM, og konsentrert ved hjelp av en 100 kDa MWCO konsentrator til 10 mg.mL-1 4,33.
For lysozym- og thaumatinproteinene ble 96-brønns mikrodialyseplaten fylt med en krystallisasjonsgitterskjerm fremstilt internt som dialyseløsningen, mens for membranproteinet AcrB ble det utarbeidet en rutenettskjerm internt fra en tidligere publisert krystallisasjonstilstand34. For LacY ble de første treffforholdene funnet fra en kommersiell skjerm (se materialfortegnelse) og ytterligere optimalisert med en rutenettskjerm laget internt. Krystallisasjonsdråpeforholdet for lysozym, thaumatin og AcrB var 1:100, med 2 μL protein til 200 μL utfellingsmiddel (dialyseløsning). LacY-krystalliseringsdråper var også i forholdet 1:100, med 1 μL protein til 100 μL dialyseløsning, på grunn av en lavere mengde tilgjengelig protein.
Krystaller fra alle fire proteiner, inkludert membranproteinene, begynte å dukke opp mellom 1-8 timer ved 20 °C etter oppsett med mikrodialyseplaten. I dette tilfellet var det ikke nødvendig å supplere dialyseløsningen med vaskemiddel for membranproteinkrystallisering, vanligvis gjort under standard dialyseprosess for å forhindre membranproteinaggregering, da vaskemiddelmicellene ble forventet å være større enn MWCO i dialysemembranene35.
Etter den vellykkede krystalliseringen av proteinene på mikrodialyseplaten (figur 4) ble krystallisasjonsbetingelser notert, og storskala krystallisering ved dialyse ble utført ved bruk av dialyserrøret med de samme 10 kDa MWCO-dialysemembranene. Tusenvis av mikrokrystaller for hvert av de individuelle proteinene vokste inne i dialysatoren, som vist i figur 5. For thaumatinkrystallisering ble 250 μL protein lastet på dialysatoren og dialysert mot 50 ml (1:200-forhold). For AcrB ble 250 μL protein dialysert mot 25 ml dialyseoppløsning (1:100). LacY-krystallisering ble også satt opp i samme forhold med 100 μL protein til 10 ml dialyseløsning.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig04.jpg"> Figur 4: Krystaller dyrkes ved dialyse ved hjelp av mikrodialyseplaten. Protokollen demonstrerer anvendeligheten av oppsettet med løselige proteiner: (A) Lysozym ble dialysert mot 0,1 M NaOAc (pH 4,0), 0,5 M NaCl og 25% (v / v) glyserol. (B) Thaumatin ble dialysert mot 0,1 M Bis-tris propan (pH 6,6), 1 M K/Na-tartrat og 18 % (v/v) etylenglykol. Krystaller ble også oppnådd for membranproteiner: (C) AcrB ble dialysert mot 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl og 20 % (v/v) PEG-400. (D) LacY ble dialysert mot 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl og 32 % (v/v) PEG-300. Bildene ble tatt med et stereomikroskop med høy forstørrelse med krysspolarisator. Skalastenger: (A,B,D) = 1 mm; (C) = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig05.jpg"> Figur 5: Representative bilder av membranproteinkrystaller dyrket ved dialyse ved bruk av dialyserrøret. (A) Bilde som viser røret fullt av mikrokrystaller (indikert med den svarte pilen). (B) Mikroskopisk bilde av 2 μL fra en oppslemming av thaumatinkrystaller dyrket ved dialyse ved bruk av 0,5 ml dialyserrøret, dialysert mot 0,1 M Bis-Tris-propan (pH 6,6), 1,4 M K/Na-tartrat og 18 % (v/v) etylenglykol. (C) Mørkefelt (venstre) og lysfelt (høyre) bilder av AcrB mikrokrystaller dyrket ved dialyse mot 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl og 20% (v / v) PEG-400. (D) Mørkefelt (venstre) og lysfelt (høyre) bilder av LacY mikrokrystaller dyrket ved dialyse mot 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl og 32% (v / v) PEG-300. Noen utfellinger observeres. Skala barer: (B,D) = 200 μm; (C) = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis at JoVE.com

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Den presenterte protokollen beskriver en enkel tilnærming for screening av proteinkrystallisasjonsbetingelser og krystallvekst ved bruk av en 96-brønns dialyseplate med høy gjennomstrømning. Bruken av dialyserrør for storskala vekst av mikrokrystaller er også demonstrert for seriell krystallografi og MicroED-applikasjoner.

Proteinkrystallisering med høy gjennomstrømning via mikrodialyse

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

Krystallisering ved dialyse er en underutnyttet metode. Denne protokollen presenterer en Novo-tilnærming til dette, noe som vil øke omfanget av krystallisasjonsstrategier som for tiden er tilgjengelige for strukturert bestemmelse. De viktigste fordelene med denne teknikken er at den er høy gjennomstrømning, enkel å sette opp uten spesialutstyr som kreves, og muliggjør enkel overvåking av krystallvekst.Personen som utfører denne teknikken må være komfortabel med lavvolumpipettering og bruk av flerkanalspipetter. Dråpene må pipetteres så tilstrekkelig som mulig for å forhindre delvis dehydrering. For å sette opp mikrodialyseeksperimentet, plasser en kommersielt tilgjengelig 96-brønns mikrodialyseplate i proteinsiden opp orientering og fjern limdekselbåndet ved å fjerne 200-mikron trykkklebende avstandsstykke.Etter å ha skrelt av limdekselbåndet, merk posisjonen til brønn A1. Deretter laster du maksimalt 3,2 mikroliter riktig tilberedt proteinprøve i hver brønn ved hjelp av en flerkanalspipett. Plasser 200-mikron UV-dekselfilmen riktig over 96-brønnplaten med filmen vendt opp. Deretter, for å aktivere og forsegle trykklimet, trykk ned på UV-dekselfilmen med en tetningspadle og kontroller integriteten.Snu nå platen for å bringe den til buffersiden opp og legg merke til den speilvendte posisjonen til den markerte brønnen A1. Bruk en flerkanals pipette, last maksimalt 350 mikroliter av dialyseoppløsningen inn i hver brønn på platen og forsegl brønnene forsiktig med reservoardekselfilmen. Deretter plasserer du platen i buffersiden opp i en passende temperaturkontrollert inkubator ved 20 grader Celsius for å tillate krystallvekst. For å undersøke krystalldannelse under mikroskopet, fjern beskyttelsesdekselfilmen fra 200-mikron UV-dekselfilmen og plasser platen under okularet med proteinsiden vendt oppover.For å sette opp et storskala krystallisasjonseksperiment, vedta forholdene der mikrokrystallvekst oppstod i mikrodialyseplaten og replikere de samme forholdene i store beholdere. Velg beholderstørrelse avhengig av volumet på dialyseoppløsningen. Pipett et maksimalt volum på 500 mikroliter proteinprøve inn i dialyserrøret før forsegling av røret ved hjelp av den røde plasthetten.Plasser det forseglede 500 mikroliter dialyserrøret i flytestativet inne i beholderen fylt med dialyseoppløsning. Deretter plasserer beholderen uforstyrret inne i en egnet temperaturkontrollert inkubator ved 20 grader Celsius for å oppnå krystallvekst. For å kontrollere dannelsen av krystaller, pipett en til to mikroliter av løsningen fra dialysatoren på et glassdeksel.Dekk løsningen på lysbildet med et annet glassglass og se det under et mikroskop. Bilder tatt med et stereomikroskop med høy forstørrelse viste vellykket mikrokrystalldannelse av fire proteiner ved hjelp av mikrodialyseplatene med 10 kilodalton molekylvektavskjæringsmembraner. Lysozym ble funnet å danne krystaller når det ble dialysert mot 0,1 molar natriumacetat ved pH 4 inneholdende passende tilsetningsstoffer.Domatin dannet krystaller når det ble dialysert mot 0,1 molar bis-tris propan ved pH 6,6 inneholdende passende tilsetningsstoffer. Optimaliserte dialyseforhold førte til mikrokrystalldannelse av membranproteinene, nemlig E.coli multidrug efflux pump protein AcrB og E.coli laktosetransportøren LacY. Storskala krystallisering i dialyserrørene ved bruk av de optimaliserte dialyseforholdene oppnådd fra mikrodialyseforsøkene førte til dannelsen av tusenvis av mikrokrystaller for hvert av proteinene.For krystallisering av fomitin ble 250 mikroliter protein dialysert mot 50 ml av dialyseoppløsningen. For AcrB ble 250 mikroliter av proteinet dialysert mot 25 mikroliter dialyseoppløsning. LacY-krystalliseringen ble også satt opp i samme forhold, med 100 mikroliter protein til 10 ml dialyseløsning.Når du vender platen til buffersiden opp, er det viktig å merke posisjonen til A1, slik at løsninger fra krystallisasjonsskjermen kan dispenseres tilsvarende. Krystallene oppnådd fra denne metoden kan brukes til nedstrøms applikasjoner, for eksempel seriell krystallografi og mikro ED.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produksjon, krystallisering og struktur Bestemmelse av<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-en via Microseeding og sink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Høy gjennomstrømning, absolutt vilje av innholdet i et valgt Protein på vev nivåer ved hjelp av kvantitative Dot Blot analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi for høy gjennomstrømning påvisning av lav affinitet reseptor-Ligand interaksjoner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisk screening og karakterisering av Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for vellykket krystallisering

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Et økonomisk og allsidig proteinrensesystem med høy gjennomstrømning ved hjelp av en adapter med flere kolonner

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

En "dual-addisjon" kalsiumfluorescensanalyse for høy gjennomstrømningsscreening av rekombinante G-proteinkoblede reseptorer

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Høy gjennomstrømningsscreening for å oppnå krystalltreff for proteinkrystallografi

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

High-throughput bildebasert kvantifisering av mitokondriell DNA-syntese og distribusjon

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...