Name: high-throughput protein crystallization via microdialysis
Uploaded: 2023-03-03T14:05:00
Duration: 6 min 18 s
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Agradecemos o financiamento do Departamento de Negócios, Energia e Estratégia Industrial (BEIS) do Reino Unido. Agradecemos a Alex R. Jones e Mike Shaw do National Physical Laboratory por seus comentários sobre o manuscrito.

1. Preparação da amostra de proteínas
<ol><li>Preparar (através de métodos recombinantes ou outros) e purificar a(s) proteína(s) de interesse num tampão adequado (isto é, susceptível de estabilidade e cristalização de proteínas) que tenha sido filtrado com um filtro de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais). Avaliar a qualidade da proteína (em termos de pureza, polidispersidade e estabilidade) antes da cristalização31. NOTA: Consulte a seção de resultados representativos para obter detalhes sobre as proteínas e tampões usados no presente estudo.</li>
	<li>Concentrar a amostra até 10-50 mg.mL-1 ou mais (dependendo do alvo proteico) usando o concentrador MWCO correto (ver Tabela de Materiais). NOTA: A amostra concentrada pode ser usada imediatamente para cristalização ou armazenada congelada a -80 °C.</li>
	<li>Se a proteína tiver sido congelada, centrifugar a amostra durante 10 minutos numa centrífuga de bancada (≥16.000 × g, à temperatura ambiente ou a 4 °C) para pellet e remover qualquer material indesejado (por exemplo, precipitados).</li>
	<li>Aliquot a proteína em tubos de PCR limpos de 200 μL. Mantê-lo no gelo ou a 4 °C se a proteína for instável à temperatura ambiente.</li>
</ol>2. Configuração da placa de microdiálise
NOTA: A placa de microdiálise comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) consiste em dois lados ('lado proteína' e 'lado tampão') com uma membrana de celulose regenerada (disponível em diferentes MWCOs), como mostrado na Figura 2.
<ol><li>Com a proteína orientada para a placa para cima, descasque e retire a fita adesiva (Figura 2A) do espaçador adesivo de pressão de 200 μm. Tome nota da posição do poço A1.</li>
	<li>Usando uma pipeta multicanal, carregar um máximo de 3,2 μL de proteína (passo 1.4) em cada poço (Figura 2B). NOTA: A proteína também pode ser carregada usando uma pipeta de dosagem repetida. O uso de uma pipeta de canal único é possível, mas aumentará a probabilidade de ocorrer desidratação parcial das gotas devido ao tempo de carregamento prolongado.</li>
	<li>Posicione a película de cobertura UV de 200 μm (ver Tabela de Materiais) sobre a placa de 96 poços e verifique sua integridade (Figura 2C). Certifique-se de que a película protetora está virada para cima.</li>
	<li>Use uma pá de vedação (consulte Tabela de Materiais), pressione a película da tampa UV para ativar e selar o adesivo de pressão.</li>
	<li>Inverta a placa e anote a posição do poço A1. Certifique-se de que a placa esteja orientada do lado do tampão para cima e que as posições do poço estejam espelhadas (Figura 2D).</li>
	<li>Usando uma pipeta multicanal, carregar no máximo 350 μL da solução de diálise em cada um dos poços (Figura 2D). NOTA: Nesta etapa, podem ser usadas telas de cristalização disponíveis comercialmente (telas de matriz esparsa) ou telas personalizadas feitas em laboratório (telas de grade) (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Selar cuidadosamente os poços com a "película de cobertura do reservatório" (ver Tabela de Materiais) (Figura 2E).</li>
	<li>Coloque a placa (lado tampão para cima) em uma incubadora adequada com temperatura controlada (20 °C) para o crescimento de cristais. NOTA: Para as proteínas selecionadas para o presente estudo, os cristais começaram a aparecer entre 1-8 h a 20 °C.</li>
	<li>Para inspecionar a presença de cristais ao microscópio, inverta a placa para trazer o lado da proteína para cima e remova a película protetora da película de cobertura UV de 200 μm (passo 2.3), como mostrado na Figura 2F,G.</li>
</ol>3. Cristalização em larga escala usando tubos dialisadores
NOTA: Uma vez que as condições de cristalização tenham sido exploradas usando a placa de microdiálise, a cristalização em larga escala da proteína (para cristalografia seriada ou outros fins) pode ser realizada usando o tubo dialisador, como mostrado na Figura 3. Assim como a placa de microdiálise, esses dispositivos estão disponíveis com membranas de diálise MWCO de 3, 5, 10 e 30 kDa.
<ol><li>Preparar a condição de cristalização otimizada para o crescimento de microcristais em grandes recipientes (adotando as condições otimizadas usando a placa de microdiálise). Verifique se o buffer foi previamente filtrado com um filtro de 0,2 μm.</li>
	<li>Pipetar a proteína para o tubo do dialisador (volume máximo de 0,5 mL) e selar a extremidade usando a tampa plástica vermelha incluída (Figura 3A).</li>
	<li>Coloque o tubo dialisador de 500 μL em um recipiente de tamanho adequado (dependendo do volume total da solução de diálise) contendo o rack flutuante (ver Tabela de Materiais), conforme mostrado na Figura 3B. NOTA: O rack flutuante fornecido com o kit dialisador comporta até 18 tubos dialisadores simultaneamente.</li>
	<li>Coloque o recipiente estacionário em uma incubadora adequada com temperatura controlada (20 °C) para o crescimento de cristais.</li>
	<li>Para inspecionar a presença de cristais, pipete 1-2 μL da solução em uma lâmina de tampa de vidro. Cubra com uma segunda lâmina de vidro na parte superior (para evitar o excesso de desidratação) e visualize ao microscópio (consulte a Tabela de Materiais). NOTA: Os cristais podem ser danificados quando prensados entre duas lâminas de tampa de vidro durante a inspeção. Os cristais também podem ser visualizados diretamente colocando o tubo do dialisador sob um microscópio estéreo de alta magnificação.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brooks-Bartlett, J. C., Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nobel+science:+One+hundred+years+of+crystallography.">The nobel science: One hundred years of crystallography.</a> Interdisciplinary Science Reviews. 40 (3), 244-264 (2015).</li><li>Maveyraud, L., Mourey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+X-ray+crystallography+and+drug+discovery.">Protein X-ray crystallography and drug discovery.</a> Molecules. 25 (5), (2020).</li><li>Kwan, T. O. 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Os coautores Pascelle Draper e Paul Reardon são empregados pela SWISSCI.

Atualmente, a cristalização por diálise é o método de cristalização mais subutilizado, nomeadamente devido ao baixo rendimento e à natureza tediosa das abordagens existentes, como a microdiálise com botões. Aqui, um protocolo simples, mas robusto, segue um fluxo de trabalho HTP para o crescimento de cristais de proteína por diálise através de uma placa de microdiálise comercialmente disponível e tubo de dialisador. Dependendo da proteína-alvo, a placa de microdiálise e o tubo dialisador usados no procedimento vêm com a opção de uma membrana de diálise com MWCO de 3, 5, 10 ou 30 kDa. O protocolo pode ser facilmente configurado em qualquer instalação de cristalização padrão e tem a grande vantagem de ser aplicável tanto a proteínas solúveis quanto a proteínas de membrana. No entanto, complexos proteína-proteína e proteína-ácido nucleico não foram testados durante este protocolo.
Como em qualquer abordagem de cristalização por diálise, a relação de volume entre a amostra de proteína e a solução de diálise é crítica. Nesse protocolo, recomenda-se uma relação de 1:100 entre a amostra e a solução de diálise, mas como a placa de microdiálise permite uma capacidade máxima de 350 μL de solução de diálise, essas relações podem ser exploradas para obter acertos de cristal. Um volume de 1-2 μL de proteína é utilizado no protocolo apresentado na montagem de placas de cristalização. Isso é para garantir que as gotas sejam definidas com precisão com uma pipeta multicanal manual. Usando pipetas eletrônicas (pipetas de dosagem multicanal ou repetidas) ou robôs de dosagem de líquido HTP, gotas de volumes mais baixos podem ser alcançadas com precisão, reduzindo assim a quantidade de proteína necessária. Além disso, devido aos volumes relativamente baixos de tampão de diálise requeridos pela placa de microdiálise (ao contrário de outros métodos convencionais de diálise), é possível (sem o uso extensivo de recursos) explorar grandes espaços químicos, não apenas usando telas de cristalização disponíveis comercialmente, mas também com telas de otimização (projetadas em torno da condição de acerto de cristalização inicial).
Uma etapa crítica no procedimento HTP apresentado é a aplicação oportuna de pequenos volumes de proteína (0,50-3,2 μL por condição) na placa de diálise para limitar a desidratação e a perda de amostra. Isso pode ser facilmente atenuado usando uma pipeta multicanal, uma pipeta de dosagem repetida ou um sistema de cristalização robótico. O longo tempo de incubação, como mais de 2 semanas, das placas a 20 °C pode levar à desidratação das gotículas de proteína ou danos aos cristais recém-formados. Manter as placas de diálise dentro de uma câmara de umidificação ou de uma bolsa selável pode aliviar esse efeito. Além disso, o uso de materiais e técnicas estéreis são recomendados para evitar o crescimento bacteriano.
Como mencionado na introdução, recentemente, com o aumento da necessidade de entender a dinâmica estrutural de proteínas para mecanismos de doenças, interações proteína-ligante e interações proteína-proteína, o campo da cristalografia de raios X de proteínas foi revolucionado através do desenvolvimento de técnicas de cristalização novas e existentes, abordagens modernas para a entrega de amostras de cristal, novas gerações de fontes de raios X e novos métodos sofisticados para aquisição e processamento de dados36 ,37,38. Portanto, o advento da microcristalografia seriada à temperatura ambiente, seja por meio de XFELs ou fontes de luz síncrotron, tem emergido como uma ferramenta notável na biologia estrutural, especificamente no campo das proteínas de membrana39. No entanto, milhares de microcristais são necessários para gerar dados suficientes para uma solução de estrutura robusta, o que não é uma tarefa fácil (pelo menos pelos métodos convencionais de cristalização). O método de cristalização em diálise descrito aqui permite a produção de um grande número de microcristais. Uma vez determinada a condição de cristalização para a produção de microcristais (1-10 μm) através do uso de uma placa de microdiálise, grandes quantidades de microcristais de alta densidade podem ser produzidas usando o dispositivo dialisador de 0,5 mL (Figura 5). Esses cristais são ideais para a coleta de dados usando alvos fixos ou sistemas de liberação de amostras por jato líquido27,40. Cristais obtidos através deste método também podem ser apropriados para aplicações em MicroDE. No entanto, estes podem precisar ser fresados até um tamanho e espessura adequados para essa aplicação específica, pois os elétrons interagem muito mais fortemente com cristais do que os fótons de raios X41.
Em conclusão, a abordagem de cristalização por diálise descrita aqui adiciona às estratégias evolutivas em cristalização de proteínas para determinação de estruturas e expande a gama de esforços que podem ser empregados para determinar novos alvos proteicos que anteriormente não foram bem sucedidos com outros métodos convencionais.

Ao longo do último século, a cristalografia de raios X tem sido fundamental na elucidação e compreensão do paradigma estrutura-função das macromoléculas biológicas. Até o momento, continua a ser um dos métodos mais bem-sucedidos na elucidação de estruturas de resolução atômica de muitas proteínas exclusivamente diferentes que são cruciais para a compreensão fundamental da bioquímica celular, medicina e descoberta precoce de drogas 1,2. No entanto, a cristalização de proteínas permanece um gargalo no estudo de muitos alvos proteicos, particularmente proteínas de membrana e grandes complexos proteicos3. Consequentemente, a cristalização de proteínas é quase sempre considerada uma arte devido às abordagens trabalhosas de tentativa e erro empregadas 4,5,6.
Um agente precipitante é geralmente adicionado a uma solução proteica em alta concentração para formar um arranjo de rede bem ordenado, regular e repetitivo de moléculas de proteína, conhecidas como cristais. Sob condições favoráveis, como temperatura, pH, concentração e agente precipitante, uma solução supersaturada acaba se formando, seguida de nucleação e crescimento de cristais 7,8. Embora tenha havido muitos avanços nas configurações de testes de cristalização, predominantemente com o desenvolvimento de sistemas robóticos de alto rendimento e a disponibilidade de telas prontas de "matriz esparsa", as abordagens gerais para cristalização de proteínas permaneceram praticamente inalteradas ao longo dos anos. Técnicas experimentais comuns de cristalização de proteínas incluem difusão de vapor (drop suspenso e drop sentado)9, microbatch (sob óleo)10,11, difusão em interface livre (dispositivos microfluídicos)12 e diálise (usando botões e outras técnicas)13,14,15. Entretanto, outras configurações mais especializadas também existem, como as abordagens de mesofase para cristalização de proteínas de membrana16,17. Enquanto a maioria das estruturas de proteínas de raios X depositadas no Protein Data Bank foi resolvida até o momento por cristalização por métodos de difusão de vapor 6,18, outras abordagens, como a cristalização por diálise, parecem ser subutilizadas, provavelmente devido aos aspectos práticos relacionados à sua configuração experimental.
A cristalização por diálise depende simplesmente da difusão lenta de solutos (precipitantes, íons, aditivos e tampões) através de uma membrana semipermeável que simultaneamente impede a circulação de moléculas proteicas. Dessa forma, a solução proteica é lentamente colocada em equilíbrio, com o precipitante atingindo a concentração necessária para cristalizar. A cinética do sistema depende da temperatura, da concentração de precipitantes e do ponto de corte de peso molecular da membrana de celulose (MWCO)19. Até o momento, a configuração de cristalização mais popular por diálise tem sido o uso de botões de microdiálise feitos de folhas de acrílico transparentes. Estes são geralmente imersos em reservatórios (principalmente usando placas suspensas de difusão de vapor) contendo as soluções precipitantes de cristalização. No entanto, esse método de menor rendimento também requer montagem específica para selar a solução proteica dentro da membrana de diálise colocada sobre a câmara botão, como ilustrado na Figura 1. Além disso, bolhas de ar aprisionadas entre a membrana de diálise e a solução proteica são um problema frequente que prejudica o crescimento de cristais. Outra restrição do método são as necessidades de amostra, em que concentrações e volumes muito maiores são necessários em comparação com os métodos de difusão de vapor, para acomodar os botões de diálise. Portanto, a cristalização usando botões de microdiálise tem sido percebida como um método pouco atraente, especialmente para alvos difíceis como proteínas de membrana, cujos rendimentos de purificação são frustrantemente baixos. Recentemente, dispositivos microfluídicos foram desenvolvidos para facilitar a cristalização de proteínas por diálise15. Esses chips também foram projetados para ter alta transparência de raios-X com baixo fundo, permitindo que os chips sejam usados para coleta de dados in situ à temperatura ambiente, eliminando assim o inconveniente de colher e crioresfriamento de cristais. Apesar desses avanços, a abordagem ainda é muito baixa e cara.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática da cristalização por diálise utilizando botões de diálise. (A) Representação esquemática de um botão de diálise de cristalização. (B) A solução proteica é adicionada à câmara botão de microdiálise. (C) A membrana de diálise é presa ao botão de microdiálise com a ajuda de um anel de borracha (O-ring) aplicado através de um aplicador. (D) O botão de diálise está pronto para ser imerso no reservatório que contém a solução de cristalização (solução de diálise), como mostrado em (E). O frasco para injetáveis que contém o botão de diálise imerso deve ser selado para evitar a evaporação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Aqui, um protocolo simples é apresentado para a triagem de condições de cristalização de proteínas e crescimento de cristais usando a placa de diálise de alto rendimento de 96 poços. Essas placas descartáveis são projetadas para serem usadas de forma semelhante às placas de cristalização por difusão de vapor (pipeta e vedação), como mostra a Figura 2. As placas podem acomodar até 3,2 μL de proteína e 350 μL de solução de diálise. Cada poço possui uma membrana de celulose regenerada separada para evitar a contaminação cruzada entre os poços. A configuração leva cerca de 10 min para ser concluída e não requer nenhum equipamento especializado além do que pode ser encontrado em todos os laboratórios de cristalização padrão. Quatro proteínas diferentes, incluindo duas proteínas de membrana, são usadas para demonstrar e validar esta abordagem como um método eficaz para cristalografia de proteínas de alto rendimento (HTP).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig02.jpg"> Figura 2: Fluxo de cristalização utilizando a placa de microdiálise. (A) Remoção do adesivo vermelho "cover film". (B) Dispensar as gotículas de proteína em cada um dos poços de gota. (C) Os poços são cobertos com a "película de cobertura" UV. (D) A placa é invertida para adicionar as soluções de diálise (ou tela de cristalização). (E) A placa é selada e incubada. (F,G) Inspeção microscópica das gotas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O uso dessa cristalização por protocolo dialítico foi demonstrado utilizando o tubo dialisador de 0,5 mL (Figura 3) para a produção em larga escala (centenas a milhares) de microcristais, adequado para métodos de coleta de dados de última geração, como cristalografia seriada em ambas as instalações XFEL 20,21,22,23,24 e síncrotrons25,26,27 , bem como para abordagens MicroED28,29,30.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig03.jpg"> Figura 3: Cristalização em larga escala da microdiálise com o tubo do dialisador. (A) Representação esquemática do tubo dialisador de 0,5 mL. (B) Vista lateral de um copo contendo a solução de cristalização e o rack de tubo flutuante segurando um tubo dialisador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0620</td>
			<td>For aliquoting protein solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>17823----------K</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate filters. For filtering dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSTF04700</td>
			<td>Membrane filters for filtering large volumes of buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 0.5 &#8211; 10 &#181;L Research plus pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000028</td>
			<td>For dispensing protein drops onto the Diaplate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 30 &#8211; 300 &#181;L Eppendorf Research plus pipette&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000060</td>
			<td>For dispensing dialysis solutions on the Diaplate reservoirs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15889152</td>
			<td>For use with syringe filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2.2 mL deep-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0788</td>
			<td>Polypropylene deep-well storage plates; for preparing screens using the Hamilton Microlab STARlet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000565</td>
			<td>With rotor FA-24x2 with a maximum g-force of 21,300 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diacon dialyser</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W72010</td>
			<td>Dialyzer tubes with a regenerated cellulose membrane with a molecular weight cut-off of 10 kDa. Ideal for protein solutions of up to 0.5 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaplate 96-well plate</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W82010</td>
			<td>Microdialysis plate. The Diaplate consists of two sides with a regenerated cellulose membrane in-between with a molecular weight cut-off of 10 kDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For holding dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating rack</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diacon kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor-standing vibration-free incubator</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD5-01</td>
			<td>400 L temperature-controlled incubator set to 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 C stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Planapo 1.0x objective, 7.8x &#8211; 160x zoom range with DMC 4500 camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memgold2</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-64</td>
			<td>Sparse-matrix screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlab STARlet</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable bottle top filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>DS0320-5045</td>
			<td>For fitering large volumes of buffers, for use with 0.22 &#181;m membrane filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing paddle</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput protein crystallization via microdialysis

A compreensão das relações estrutura-função de macromoléculas, como proteínas, em nível molecular é vital para a biomedicina e a descoberta de fármacos modernos. Até o momento, a cristalografia de raios X continua sendo o método mais bem sucedido para resolver estruturas de proteínas tridimensionais em resolução atômica. Com os recentes avanços na cristalografia seriada, seja usando lasers de elétrons livres de raios X (XFELs) ou fontes de luz síncrotron, a cristalografia de proteínas progrediu para a próxima fronteira, onde a capacidade de adquirir dados resolvidos no tempo fornece importantes insights mecanicistas sobre o comportamento de moléculas biológicas à temperatura ambiente. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho simples de alto rendimento (HTP) para triagem de condições de cristalização através do uso de uma placa de diálise de 96 poços. Essas placas seguem o padrão da Society for Biomolecular Screening (SBS) e podem ser facilmente configuradas usando qualquer laboratório de cristalização padrão. Uma vez identificadas as condições ideais, grandes quantidades de cristais (centenas de microcristais) podem ser produzidas usando o dialisador. Para validar a robustez e versatilidade desta abordagem, quatro proteínas diferentes foram cristalizadas, incluindo duas proteínas de membrana.

Quatro proteínas foram cristalizadas usando a placa de microdiálise (com membranas de MWCO de 10 kDa), incluindo duas proteínas de membrana. A lisozima clara de ovo de galinha a partir do pó liofilizado (ver Tabela de Materiais) foi preparada a 50 mg.mL-1 em NaOAc 20 mM (pH 4,5), e a taumatina liofilizada (ver Tabela de Materiais) foi dissolvida em água até uma concentração final de 25 mg.mL-1. As duas proteínas de membrana utilizadas neste estudo foram a bomba de efluxo multidrogas AcrB de E. coli e o transportador de lactose LacY de E. coli. A AcrB foi expressa usando células C43 (DE3) e purificada por cromatografia de afinidade Ni-NTA e cromatografia de exclusão de tamanho em Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 300 mM, 0,03% (p/v) n-dodecil-β-D-maltosídeo (DDM) e 5% (v/v) glicerol32. Posteriormente, a proteína foi concentrada usando um concentrador centrífugo MWCO de 100 kDa até uma concentração final de 6 mg.mL-1. O LacY também foi expresso em células C43 (DE3), purificado por cromatografia de afinidade com Ni-sepharose, seguido de cromatografia de exclusão de tamanho em Tris 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, DDM 0,03% (p/v) e concentrado usando concentrador MWCO de 100 kDa para 10 mg.mL-1 4,33.
Para as proteínas lisozima e taumatina, a placa de microdiálise de 96 poços foi preenchida com uma tela de grade de cristalização preparada internamente como solução de diálise, enquanto para a proteína de membrana AcrB, uma tela de grade foi preparada internamente a partir de uma condição de cristalização previamente publicada34. Para o LacY, as condições iniciais de acerto foram encontradas a partir de uma tela comercial (veja Tabela de Materiais) e otimizadas com uma tela de grade feita internamente. A razão de queda de cristalização para lisozima, taumatina e AcrB foi de 1:100, com 2 μL de proteína para 200 μL de precipitante (solução de diálise). As gotas de cristalização de LacY também foram na proporção de 1:100, com 1 μL de proteína para 100 μL de solução de diálise, devido à menor quantidade de proteína disponível.
Os cristais das quatro proteínas, incluindo as proteínas de membrana, começaram a aparecer entre 1-8 h a 20 °C após a instalação com a placa de microdiálise. Nesse caso, não foi necessário complementar a solução de diálise com detergente para a cristalização da proteína de membrana, tipicamente feita durante o processo padrão de diálise para evitar a agregação proteica de membrana, pois esperava-se que as micelas em detergente fossem maiores que a MWCO das membranas de diálise35.
Após a cristalização bem sucedida das proteínas na placa de microdiálise (Figura 4), as condições de cristalização foram observadas, e a cristalização em larga escala por diálise foi realizada usando o tubo dialisador com as mesmas membranas de diálise MWCO de 10 kDa. Milhares de microcristais para cada uma das proteínas individuais cresceram dentro do dialisador, como mostrado na Figura 5. Para cristalização da taumatina, 250 μL de proteína foram carregados no dialisador e dialisados contra 50 mL (proporção 1:200). Para AcrB, 250 μL de proteína foram dialisados contra 25 mL de solução de diálise (1:100). A cristalização de LacY também foi estabelecida na mesma proporção com 100 μL de proteína para 10 mL de solução de diálise.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig04.jpg"> Figura 4: Os cristais são cultivados por diálise usando a placa de microdiálise. O protocolo demonstra a aplicabilidade do arranjo com proteínas solúveis: (A) A lisozima foi dialisada contra NaOAc 0,1 M (pH 4,0), NaCl 0,5 M e glicerol a 25% (v/v). (B) A taumatina foi dialisada contra propano Bis-tris 0,1 M (pH 6,6), tartarato K/Na 1 M e etilenoglicol a 18% (v/v). Cristais também foram obtidos para proteínas de membrana: (C) AcrB foi dialisado contra 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl e 20% (v/v) PEG-400. (D) LacY foi dialisado contra 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl e 32% (v/v) PEG-300. As imagens foram capturadas utilizando-se microscópio estéreo de alta magnificação com polarizador cruzado. Barras de escala: (A,B,D) = 1 mm; (C) = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig05.jpg"> Figura 5: Imagens representativas dos cristais de proteína de membrana cultivados por diálise com o tubo dialisador. (A) Imagem mostrando o tubo cheio de microcristais (indicada pela seta preta). (B) Imagem microscópica de 2 μL de uma lama de cristais de taumatina cultivada por diálise usando o tubo dialisador de 0,5 mL, dialisada contra propano Bis-Tris 0,1 M (pH 6,6), tartarato de K/Na 1,4 M e etilenoglicol a 18% (v/v). (C) Imagens de campo escuro (esquerda) e campo claro (direita) de microcristais AcrB cultivados por diálise contra 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl e 20% (v/v) PEG-400. (D) Imagens de campo escuro (esquerda) e campo claro (direita) de microcristais de LacY cultivados por diálise contra 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M de NaCl e 32% (v/v) de PEG-300. Alguns precipitados são observados. Barras de escala: (B,D) = 200 μm; (C) = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

O protocolo apresentado descreve uma abordagem direta para triagem de condições de cristalização de proteínas e crescimento de cristais usando uma placa de diálise de alto rendimento de 96 poços. O uso de tubos dialisadores para o crescimento em larga escala de microcristais também é demonstrado para aplicações de cristalografia seriada e MicroDE.

Cristalização de proteínas de alto rendimento via microdiálise

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

A cristalização por diálise é um método subutilizado. Este protocolo apresenta uma nova abordagem para isso, o que aumentará a gama de estratégias de cristalização atualmente disponíveis para determinação estruturada. As principais vantagens desta técnica são que é de alto rendimento, simples de configurar sem a necessidade de equipamento especializado, e permite fácil monitoramento do crescimento de cristais.O indivíduo que executa esta técnica deve estar confortável com pipetagem de baixo volume e usando pipetas multicanal. As gotas devem ser pipetadas o mais suficientemente possível para evitar a desidratação parcial. Para configurar o experimento de microdiálise, coloque uma placa de microdiálise de 96 poços disponível comercialmente na orientação do lado da proteína para cima e remova a fita adesiva da tampa descascando o espaçador adesivo de pressão de 200 mícrons.Após descascar a fita adesiva, observe a posição do poço A1. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, carregue um máximo de 3,2 microlitros de amostra de proteína adequadamente preparada em cada poço. Posicione corretamente a película de cobertura UV de 200 mícrons sobre a placa de 96 poços com a película virada para cima. Em seguida, para ativar e selar o adesivo de pressão, pressione a película da tampa UV usando uma pá de vedação e verifique sua integridade.Agora, inverta a placa para trazê-la para a orientação do lado do buffer para cima e tome nota da posição espelhada do poço marcado A1. Usando uma pipeta multicanal, carregue um máximo de 350 microlitros da solução de diálise em cada poço da placa e sele cuidadosamente os poços com a película de cobertura do reservatório. Em seguida, coloque a placa na orientação do lado do tampão para cima dentro de uma incubadora adequada com temperatura controlada a 20 graus Celsius para permitir o crescimento de cristais. Para examinar a formação de cristais ao microscópio, remova a película protetora da película de cobertura UV de 200 mícrons e coloque a placa abaixo da ocular com o lado da proteína voltado para cima.Para montar um experimento de cristalização em larga escala, adotar as condições em que ocorreu o crescimento de microcristais na placa de microdiálise e replicar as mesmas condições em grandes recipientes. Selecione o tamanho do recipiente dependendo do volume da solução de diálise. Pipetar um volume máximo de 500 microlitros de amostra de proteína para o tubo do dialisador antes de selar o tubo usando a tampa plástica vermelha.Coloque o tubo dialisador selado de 500 microlitros no rack flutuante dentro do recipiente cheio de solução de diálise. Em seguida, coloque o recipiente sem ser perturbado dentro de uma incubadora adequada com temperatura controlada a 20 graus Celsius para obter o crescimento de cristais. Para verificar a formação de cristais, pipete de um a dois microlitros da solução do dialisador para uma tampa de vidro.Cubra a solução na lâmina com outra lâmina de vidro e visualize-a ao microscópio. Imagens capturadas usando um microscópio estéreo de alta magnificação mostraram a formação bem-sucedida de microcristais de quatro proteínas usando as placas de microdiálise com membranas de corte de peso molecular de 10 quilodaltons. A lisozima formou cristais quando dialisada contra acetato de sódio 0,1 molar em pH 4 contendo aditivos apropriados.A domatina formou cristais quando dialisada contra propano bis-tris 0,1 molar em pH 6,6 contendo aditivos apropriados. Condições otimizadas de diálise levaram à formação de microcristais pelas proteínas de membrana, nomeadamente a proteína de bomba de efluxo multidroga AcrB de E.coli e o transportador de lactose de E.coli LacY. A cristalização em larga escala nos tubos do dialisador empregando as condições otimizadas de diálise obtidas a partir dos experimentos de microdiálise levou à formação de milhares de microcristais para cada uma das proteínas.Para cristalização da fomitina, 250 microlitros de proteína foram dialisados contra 50 mililitros da solução de diálise. Para AcrB, 250 microlitros da proteína foram dialisados contra 25 microlitros de solução de diálise. A cristalização de LacY também foi estabelecida na mesma proporção, com 100 microlitros de proteína para 10 mililitros de solução de diálise.Ao inverter a placa para o lado tampão para cima, é importante observar a posição de A1, para que as soluções da tela de cristalização possam ser dispensadas de acordo. Os cristais obtidos a partir deste método podem ser utilizados para aplicações downstream, tais como cristalografia serial e micro ED.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Método para a identificação de molécula pequena inibidores da interacção proteína-proteína entre HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bioquímica

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produção, cristalização e determinação da estrutura de<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via microdispersão e Zinco-SAD

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Alto Throughput, absoluta determinação do conteúdo de uma proteína selecionada em níveis de tecido usando quantitativa Dot Blot Analysis (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

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High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Quantificação baseada em imagens de alto rendimento da síntese e distribuição do DNA mitocondrial

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...