Name: high-throughput protein crystallization via microdialysis
Uploaded: 2023-03-03T14:05:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis at JoVE.com

Мы признаем финансирование со стороны Министерства бизнеса, энергетики и промышленной стратегии Соединенного Королевства (BEIS). Мы благодарим Алекса Р. Джонса и Майка Шоу из Национальной физической лаборатории за их отзывы о рукописи.

1. Подготовка образцов белка
<ol><li>Готовят (с помощью рекомбинантных способов или иным образом) и очищают интересующий белок (белки) в подходящем буфере (т.е. таком, который поддается стабильности и кристаллизации белка), который был отфильтрован с помощью фильтра 0,22 мкм (см. Таблицу материалов). Оцените качество белка (с точки зрения чистоты, полидисперсности и стабильности) до кристаллизации31. ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, ознакомьтесь с разделом репрезентативных результатов для получения подробной информации о белках и буферах, используемых в настоящем исследовании.</li>
	<li>Сконцентрируйте образец до 10-50 mg.mL-1 или выше (в зависимости от белковой мишени) с помощью правильного концентратора MWCO (см. Таблицу материалов). ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрированный образец можно сразу же использовать для кристаллизации или хранить в замороженном виде при -80 °C.</li>
	<li>Если белок был заморожен, центрифугируйте образец в течение 10 мин в настольной центрифуге (≥16 000 × г, при комнатной температуре или 4 °C) для гранулирования и удаления любого нежелательного материала (например, осадков).</li>
	<li>Аликвотируйте белок в чистые пробирки для ПЦР объемом 200 мкл. Храните его на льду или при температуре 4 ° C, если белок нестабилен при комнатной температуре.</li>
</ol>2. Настройка микродиализной пластины
ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступная микродиализная пластина (см. Таблицу материалов) состоит из двух сторон («белковая сторона» и «буферная сторона») с регенерированной целлюлозной мембраной (доступной в различных MWCO), как показано на рисунке 2.
<ol><li>Белковой стороной вверх, ориентированной на пластину, снимите и снимите клейкую покровную ленту (рис. 2A) с прокладки для клея под давлением 200 мкм. Обратите внимание на положение скважины А1.</li>
	<li>Используя многоканальную пипетку, загрузите максимум 3,2 мкл белка (шаг 1,4) в каждую лунку (рис. 2B). ПРИМЕЧАНИЕ: Белок также можно загрузить с помощью пипетки с повторным дозированием. Использование одноканальной пипетки возможно, но это увеличит вероятность частичного обезвоживания капель, происходящего из-за увеличенного времени загрузки.</li>
	<li>Поместите УФ-пленку размером 200 мкм (см. Таблицу материалов) над 96-луночной пластиной и проверьте ее целостность (рис. 2C). Убедитесь, что защитная пленка обращена вверх.</li>
	<li>Используйте уплотнительную лопатку (см. Таблицу материалов), прижмите УФ-пленку, чтобы активировать и запечатать клей под давлением.</li>
	<li>Переверните пластину и обратите внимание на положение колодца А1. Убедитесь, что пластина ориентирована буферной стороной вверх и что положение скважины зеркально отражено (рис. 2D).</li>
	<li>Используя многоканальную пипетку, загрузите максимум 350 мкл диализирующего раствора в каждую из лунок (рис. 2D). ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе могут быть использованы либо коммерчески доступные кристаллизационные сита (разреженные матричные грохоты), либо лабораторные сита по индивидуальному заказу (сетчатые экраны) (см. Таблицу материалов).</li>
	<li>Тщательно загерметизируйте колодцы «пленкой крышки резервуара» (см. Таблицу материалов) (рис. 2E).</li>
	<li>Поместите пластину буферной стороной вверх в подходящий инкубатор с регулируемой температурой (20 °C) для роста кристаллов. ПРИМЕЧАНИЕ: Для белков, отобранных для настоящего исследования, кристаллы начали появляться между 1-8 часами при 20 ° C.</li>
	<li>Чтобы проверить наличие кристаллов под микроскопом, переверните пластину, чтобы подвести белковой стороной вверх, и удалите защитную пленку с УФ-пленки 200 мкм (этап 2.3), как показано на рисунке 2F, G.</li>
</ol>3. Крупномасштабная кристаллизация с использованием трубок-диализаторов
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как условия кристаллизации были исследованы с использованием микродиализной пластины, крупномасштабная кристаллизация белка (для серийной кристаллографии или других целей) может быть выполнена с использованием трубки диализатора, как показано на рисунке 3. Подобно микродиализной пластине, эти устройства доступны с диализными мембранами MWCO 3, 5, 10 и 30 кДа.
<ol><li>Подготовьте оптимизированные условия кристаллизации для выращивания микрокристаллов в больших контейнерах (приняв условия, оптимизированные с помощью микродиализной пластины). Убедитесь, что буфер был предварительно отфильтрован фильтром 0.2 мкм.</li>
	<li>Поместите белок в пробирку диализатора пипеткой (максимальный объем 0,5 мл) и запечатайте конец с помощью прилагаемого красного пластикового колпачка (рис. 3A).</li>
	<li>Поместите пробирку диализатора объемом 500 мкл в контейнер подходящего размера (в зависимости от общего объема диализирующего раствора), содержащий плавающую стойку (см. Таблицу материалов), как показано на рисунке 3B. ПРИМЕЧАНИЕ: Плавающая стойка, входящая в комплект диализатора, вмещает до 18 пробирок диализатора одновременно.</li>
	<li>Поместите контейнер в подходящий инкубатор с регулируемой температурой (20 °C) для роста кристаллов.</li>
	<li>Чтобы проверить наличие кристаллов, пипеткой нанесите 1-2 мкл раствора на предметное стекло. Накройте сверху вторым стеклянным предметным стеклом (чтобы предотвратить избыточное обезвоживание) и посмотрите под микроскопом (см. Таблицу материалов). ПРИМЕЧАНИЕ: Кристаллы могут быть повреждены при зажатии между двумя предметными стеклами во время осмотра. Кристаллы также можно увидеть непосредственно, поместив трубку диализатора под стереомикроскоп с большим увеличением.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brooks-Bartlett, J. C., Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nobel+science:+One+hundred+years+of+crystallography.">The nobel science: One hundred years of crystallography.</a> Interdisciplinary Science Reviews. 40 (3), 244-264 (2015).</li><li>Maveyraud, L., Mourey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+X-ray+crystallography+and+drug+discovery.">Protein X-ray crystallography and drug discovery.</a> Molecules. 25 (5), (2020).</li><li>Kwan, T. O. C., Axford, D., Moraes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+crystallography+in+the+era+of+modern+structural+biology.">Membrane protein crystallography in the era of modern structural biology.</a> Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2505-2524 (2020).</li><li>Birch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+art+of+integral+membrane+protein+crystallisation.">The fine art of integral membrane protein crystallisation.</a> Methods. 147, 150-162 (2018).</li><li>Gorrec, F., L&#246;we, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protocols+for+macromolecular+crystallization+at+the+MRC+laboratory+of+molecular+biology.">Automated protocols for macromolecular crystallization at the MRC laboratory of molecular biology.</a> Journal of Visualized Experiments. 131 (131), (2018).</li><li>Govada, L., Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+method+of+crystallization+to+obtain+optimal+results.">Choosing the method of crystallization to obtain optimal results.</a> Crystals. 9 (2), 106 (2019).</li><li>Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+protein+crystallisation+from+an+art+into+science.">Turning protein crystallisation from an art into science.</a> Current Opinion in Structural Biology. 14 (5), 577-583 (2004).</li><li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li><li>Gulbis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallography:+methods+and+protocols.">Protein crystallography: methods and protocols.</a> Crystallography Reviews. 24 (2), 136-143 (2018).</li><li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization:+What+have+we+learned.">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned.</a> Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 70 (9), 1117-1126 (2014).</li><li>Shaw Stewart, ., D, P., Kolek, S. A., Briggs, R. A., Chayen, N. E., Baldock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+microseeding:+a+theoretical+and+practical+exploration+of+seed+stability+and+seeding+techniques+for+successful+protein+crystallization.">Random microseeding: a theoretical and practical exploration of seed stability and seeding techniques for successful protein crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Junius, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+both+on-chip+dialysis+protein+crystallization+and+in+situ+X-ray+diffraction.">A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction.</a> Lab on a Chip. 20 (2), 296-310 (2020).</li><li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control.">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), 686-698 (2020).</li><li>Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystal+growth+for+neutron+macromolecular+crystallography.">Optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. 169, (2021).</li><li>Jaho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+proteins+on+chip+by+microdialysis+for+in+situ+X-ray+diffraction+studies.">Crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ X-ray diffraction studies.</a> Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, 2501 (2011).</li><li>Ujwal, R., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+using+the+lipidic+bicelle+method.">High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method.</a> Journal of Visualized Experiments. 59, (2012).</li><li>Parker, J. L., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+crystallisation:+Current+trends+and+future+perspectives.">Membrane protein crystallisation: Current trends and future perspectives.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 922. , 61-72 (2016).</li><li>Apostolopoulou, V., Junius, N., Sear, R. P., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing+salts+and+polyethylene+glycol+into+protein+solutions:+The+effects+of+diffusion+across+semi-permeable+membranes+and+of+convection.">Mixing salts and polyethylene glycol into protein solutions: The effects of diffusion across semi-permeable membranes and of convection.</a> Crystal Growth &amp; Design. 20 (6), 3927-3936 (2020).</li><li>Neutze, R., Wouts, R., Vander Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+biomolecular+imaging+with+femtosecond+X-ray+pulses.">Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses.</a> Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).</li><li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography.">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-78 (2011).</li><li>Mizohata, E., Nakane, T., Fukuda, Y., Nango, E., Iwata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography+at+the+SACLA:+breakthrough+to+dynamic+structural+biology.">Serial femtosecond crystallography at the SACLA: breakthrough to dynamic structural biology.</a> Biophysical Reviews. 10 (2), 209-218 (2018).</li><li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation.">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).</li><li>Johansson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XFEL+structures+of+the+human+MT2+melatonin+receptor+reveal+the+basis+of+subtype+selectivity.">XFEL structures of the human MT2 melatonin receptor reveal the basis of subtype selectivity.</a> Nature. 569 (7755), 289-292 (2019).</li><li>Owen, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+fixed-target+serial+synchrotron+crystallography.">Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (4), 373-378 (2017).</li><li>Weinert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+millisecond+crystallography+for+routine+room-temperature+structure+determination+at+synchrotrons.">Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons.</a> Nature communications. 8 (1), 542 (2017).</li><li>Axford, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+states+of+a+light-sensitive+membrane+protein+captured+at+room+temperature+using+thin-film+sample+mounts.">Two states of a light-sensitive membrane protein captured at room temperature using thin-film sample mounts.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 52-58 (2022).</li><li>Nannenga, B. L., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cryo-EM+method+microcrystal+electron+diffraction+(MicroED).">The cryo-EM method microcrystal electron diffraction (MicroED).</a> Nature Methods. 16 (5), 369-379 (2019).</li><li>Nguyen, C., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+protein+structure+determination+with+MicroED.">Beyond protein structure determination with MicroED.</a> Current Opinion in Structural Biology. 64, 51-58 (2020).</li><li>Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+microcrystal+electron+diffraction+(MicroED).">An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED).</a> Annual Review of Biochemistry. 90, 431-450 (2021).</li><li>Kwan, T. O. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+biophysical+methods+for+characterisation+of+membrane+proteins.">Selection of biophysical methods for characterisation of membrane proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 2605 (2019).</li><li>Pos, K. M., Purification Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=crystallization+and+preliminary+diffraction+studies+of+AcrB,+an+inner-membrane+multi-drug+efflux+protein.">crystallization and preliminary diffraction studies of AcrB, an inner-membrane multi-drug efflux protein.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (10), 1865-1867 (2002).</li><li>Guan, L., Mirza, O., Verner, G., Iwata, S., Kaback, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+wild-type+lactose+permease.">Structural determination of wild-type lactose permease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (39), 15294-15298 (2007).</li><li>Kwan, T. O. C., Reis, R., Moraes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+measurements+of+polypeptide+samples+by+dynamic+light+scattering:+membrane+proteins,+a+case+study.">In situ measurements of polypeptide samples by dynamic light scattering: membrane proteins, a case study.</a> Methods in Molecular Biology. , 189-202 (2021).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Wickstrand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tool+for+visualizing+protein+motions+in+time-resolved+crystallography.">A tool for visualizing protein motions in time-resolved crystallography.</a> Structural Dynamics. 7 (2), 024701 (2020).</li><li>Orville, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+results+in+time+resolved+serial+femtosecond+crystallography+at+XFELs.">Recent results in time resolved serial femtosecond crystallography at XFELs.</a> Current Opinion in Structural Biology. 65, 193-208 (2020).</li><li>Schulz, E. C., Yorke, B. A., Pearson, A. R., Mehrabi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+time-resolved+serial+synchrotron+crystallography.">Best practices for time-resolved serial synchrotron crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 14-29 (2022).</li><li>Neutze, R., Br&#228;nd&#233;n, G., Schertler, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+structural+biology+using+X-ray+free+eletron+lasers.">Membrane protein structural biology using X-ray free eletron lasers.</a> Current Opinion in Structural Biology. 33, 115-125 (2015).</li><li>Wierstall, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+sample+delivery+techniques+for+serial+femtosecond+crystallography.">Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).</li><li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals.">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345 (2013).</li></ol>

Соавторы Пасселл Дрейпер и Пол Рирдон работают в SWISSCI.

В настоящее время кристаллизация диализом является наиболее малоиспользуемым методом кристаллизации, а именно из-за низкой пропускной способности и утомительного характера существующих подходов, таких как микродиализ с помощью кнопок. Здесь простой, но надежный протокол следует рабочему процессу HTP для выращивания кристаллов белка путем диализа через коммерчески доступную микродиализную пластину и пробирку диализатора. В зависимости от целевого белка микродиализная пластина и диализаторная трубка, используемые в процедуре, поставляются с выбором диализной мембраны с MWCO 3, 5, 10 или 30 кДа. Протокол может быть легко настроен на любой стандартной кристаллизационной установке и имеет большое преимущество, заключающееся в том, что он применим как к растворимым, так и к мембранным белкам. Однако белок-белковые и белково-нуклеиновые кислоты не тестировались во время этого протокола.
Как и в любом подходе к кристаллизации с помощью диализа, объемное соотношение между образцом белка и диализным раствором имеет решающее значение. В этом протоколе рекомендуется соотношение 1:100 между образцом и диализным раствором, но, поскольку микродиализная пластина допускает максимальную емкость 350 мкл диализного раствора, эти соотношения могут быть исследованы для получения кристаллических ударов. Объем 1-2 мкл белка используется в представленном протоколе при настройке кристаллизационных пластин. Это необходимо для того, чтобы капли точно схватывались с помощью ручной многоканальной пипетки. Используя электронные пипетки (многоканальные или дозирующие пипетки с повторным дозированием) или роботы для дозирования жидкости HTP, можно точно получить капли меньшего объема, тем самым снижая количество необходимого белка. Кроме того, из-за относительно небольших объемов диализного буфера, необходимого для микродиализной пластины (в отличие от других традиционных методов диализа), можно (без широкого использования ресурсов) исследовать большие химические пространства не только с использованием коммерчески доступных кристаллизационных экранов, но и с оптимизационными экранами (разработанными с учетом начальных условий кристаллизации).
Важнейшим этапом в представленной процедуре ПВТ является своевременное нанесение небольших объемов белка (0,50-3,2 мкл на условие) на диализную пластину для ограничения обезвоживания и потери образца. Это можно легко смягчить, используя многоканальную дозирующую дозаторную дозаторную дозатор или роботизированную систему кристаллизации. Длительное время инкубации, например, более 2 недель, пластин при 20 ° C может привести к обезвоживанию белковых капель или повреждению недавно образовавшихся кристаллов. Хранение диализных пластин в увлажняющей камере или герметичном пакете может смягчить этот эффект. Кроме того, рекомендуется использовать стерильные материалы и методы, чтобы избежать роста бактерий.
Как упоминалось во введении, в последнее время, в связи с возросшей потребностью в понимании структурной динамики белка для механизмов заболевания, взаимодействий связывания белка с лигандом и взаимодействия белка с белком, область рентгеновской кристаллографии белков претерпела революцию благодаря разработке новых и существующих методов кристаллизации, современных подходов к доставке образцов кристаллов, новых поколений источников рентгеновского излучения и новых сложных методов сбора и обработки данных36 ,37,38. Таким образом, появление серийной микрокристаллографии при комнатной температуре, выполненной с использованием XFEL или источников синхротронного излучения, стало замечательным инструментом в структурной биологии, особенно в области мембранных белков39. Тем не менее, тысячи микрокристаллов необходимы для получения достаточного количества данных для надежного структурного решения, что является непростой задачей (по крайней мере, при обычных методах кристаллизации). Описанный здесь метод диализной кристаллизации позволяет производить большое количество микрокристаллов. После того, как условия кристаллизации для производства микрокристаллов (1-10 мкм) были определены с помощью микродиализной пластины, с помощью диализатора объемом 0,5 мл можно получить большое количество микрокристаллов высокой плотности (рис. 5). Эти кристаллы идеально подходят для сбора данных с использованием фиксированных мишеней или систем доставки проб жидкой струей27,40. Кристаллы, полученные с помощью этого метода, также могут быть пригодны для применения MicroED. Однако их, возможно, придется измельчить до подходящего размера и толщины для этого конкретного применения, поскольку электроны гораздо сильнее взаимодействуют с кристаллами, чем рентгеновские фотоны41.
В заключение, описанный здесь подход к кристаллизации диализом дополняет развивающиеся стратегии кристаллизации белка для определения структуры и расширяет диапазон усилий, которые могут быть использованы для определения новых белковых мишеней, которые ранее не увенчались успехом при использовании других традиционных методов.

За последнее столетие рентгеновская кристаллография сыграла решающую роль в выяснении и понимании структурно-функциональной парадигмы биологических макромолекул. На сегодняшний день он продолжает оставаться одним из наиболее успешных методов выяснения структур атомного разрешения многих уникальных белков, которые имеют решающее значение для фундаментального понимания биохимии клеток, медицины и раннего открытия лекарств 1,2. Однако кристаллизация белка остается узким местом в изучении многих белковых мишеней, особенно мембранных белков и крупных белковых комплексов3. Следовательно, кристаллизация белка почти всегда считается искусством из-за трудоемких методов проб и ошибок, используемых 4,5,6.
Осаждающий агент обычно добавляют в белковый раствор с высокой концентрацией с образованием хорошо упорядоченного, правильного и повторяющегося решетчатого расположения белковых молекул, известных как кристаллы. При благоприятных условиях, таких как температура, рН, концентрация и осаждающий агент, в конечном итоге образуется пересыщенный раствор с последующим зарождением кристаллов и ростом 7,8. Несмотря на то, что было достигнуто много успехов в пробных установках кристаллизации, главным образом с развитием высокопроизводительных роботизированных систем и наличием готовых экранов с «разреженной матрицей», общие подходы к кристаллизации белков в значительной степени оставались неизменными на протяжении многих лет. Распространенные экспериментальные методы кристаллизации белка включают диффузию пара (висячая капля и сидячая капля)9, микропорцию (под маслом)10,11, диффузию со свободным интерфейсом (микрофлюидные устройства)12 и диализ (с использованием кнопок и других методов)13,14,15. Однако существуют и другие, более специализированные установки, такие как мезофазные подходы для кристаллизации мембранных белков16,17. В то время как большинство рентгеновских белковых структур, депонированных в Банке данных о белках, до сих пор были решены путем кристаллизации методами диффузиипара 6,18, другие подходы, такие как кристаллизация диализом, по-видимому, недостаточно используются, вероятно, из-за практических аспектов, связанных с их экспериментальной установкой.
Кристаллизация диализом просто основана на медленной диффузии растворенных веществ (осадителей, ионов, добавок и буферов) через полупроницаемую мембрану, которая одновременно предотвращает циркуляцию белковых молекул. Таким образом, белковый раствор медленно приводится в равновесие, при этом осадитель достигает необходимой концентрации для кристаллизации. Кинетика системы зависит от температуры, концентрации осадка и отсечки молекулярной массы целлюлозной мембраны (MWCO)19. На сегодняшний день наиболее популярной установкой кристаллизации с помощью диализа является использование кнопок микродиализа из прозрачных акриловых листов. Они обычно погружаются в резервуары (в основном с использованием подвесных капельных пластин для диффузии пара), содержащие растворы осаждающих кристаллизации. Однако этот метод с более низкой пропускной способностью также требует специальной сборки для герметизации белкового раствора внутри диализной мембраны, размещенной над кнопочной камерой, как показано на рисунке 1. Кроме того, пузырьки воздуха, застрявшие между диализной мембраной и белковым раствором, являются частой проблемой, которая ухудшает рост кристаллов. Еще одним ограничением метода являются требования к образцам, в соответствии с которыми необходимы гораздо более высокие концентрации и объемы по сравнению с методами диффузии пара для размещения кнопок диализа. Поэтому кристаллизация с помощью кнопок микродиализа воспринимается как непривлекательный метод, особенно для сложных мишеней, таких как мембранные белки, выход очистки которых удручающе низок. Недавно были разработаны микрофлюидные устройства для облегчения кристаллизации белка путем диализа15. Эти чипы также были разработаны, чтобы иметь высокую рентгеновскую прозрачность с низким фоном, что позволяет использовать чипы для сбора данных in situ при комнатной температуре, тем самым устраняя неудобства сбора и криоохлаждения кристаллов. Несмотря на эти достижения, этот подход по-прежнему очень низкопроизводительный и дорогой.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig01.jpg"> Рисунок 1: Схематическое изображение кристаллизации диализом с использованием кнопок диализа. (А) Схематическое изображение кнопки кристаллизационного диализа. (B) Белковый раствор добавляют в камеру кнопки микродиализа. (C) Диализная мембрана удерживается на кнопке микродиализа с помощью резинового кольца (уплотнительного кольца), приложенного через аппликатор. (D) Кнопка диализа готова к погружению в резервуар, содержащий кристаллизационный раствор (диализирующий раствор), как показано на (E). Флакон с погружной кнопкой диализа должен быть запечатан, чтобы избежать испарения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Здесь представлен простой протокол для скрининга условий кристаллизации белка и роста кристаллов с использованием 96-луночной высокопроизводительной диализной пластины. Эти одноразовые пластины предназначены для использования аналогично кристаллизационным пластинам для диффузии пара (пипетка, затем уплотнение), как показано на рисунке 2. Пластины вмещают до 3,2 мкл белка и 350 мкл диализного раствора. Каждая скважина имеет отдельную регенерированную целлюлозную мембрану для предотвращения перекрестного загрязнения между скважинами. Установка занимает около 10 минут и не требует какого-либо специального оборудования, кроме того, что можно найти во всех стандартных кристаллизационных лабораториях. Четыре различных белка, в том числе два мембранных белка, используются для демонстрации и подтверждения этого подхода в качестве эффективного метода кристаллографии белков с высокой пропускной способностью (HTP).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig02.jpg"> Рисунок 2: Процесс кристаллизации с использованием микродиализной пластины. А) Удаление красной клейкой "покровной пленки". (B) Дозирование капель белка в каждую из капельных лунок. (C) Колодцы покрыты УФ-пленкой. (D) Пластина перевернута для добавления диализных растворов (или кристаллизационного экрана). (E) Пластина запечатывается и инкубируется. (Ф,Г) Микроскопический осмотр капель. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Использование этой кристаллизации по протоколу диализа было продемонстрировано с использованием пробирки диализатора объемом 0,5 мл (рис. 3) для крупномасштабного (от сотен до тысяч) производства микрокристаллов, пригодных для современных методов сбора данных, таких как серийная кристаллография на установках XFEL 20,21,22,23,24 и синхротронах25,26,27 , а также для подходов MicroED28,29,30.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig03.jpg"> Рисунок 3: Крупномасштабная кристаллизация микродиализа с использованием трубки диализатора . (A) Схематическое изображение пробирки диализатора объемом 0,5 мл. (B) Вид сбоку стакана, содержащего кристаллизационный раствор, и плавающей стойки для трубки, содержащей трубку диализатора. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0620</td>
			<td>For aliquoting protein solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>17823----------K</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate filters. For filtering dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSTF04700</td>
			<td>Membrane filters for filtering large volumes of buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 0.5 &#8211; 10 &#181;L Research plus pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000028</td>
			<td>For dispensing protein drops onto the Diaplate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 30 &#8211; 300 &#181;L Eppendorf Research plus pipette&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000060</td>
			<td>For dispensing dialysis solutions on the Diaplate reservoirs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15889152</td>
			<td>For use with syringe filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2.2 mL deep-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0788</td>
			<td>Polypropylene deep-well storage plates; for preparing screens using the Hamilton Microlab STARlet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000565</td>
			<td>With rotor FA-24x2 with a maximum g-force of 21,300 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diacon dialyser</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W72010</td>
			<td>Dialyzer tubes with a regenerated cellulose membrane with a molecular weight cut-off of 10 kDa. Ideal for protein solutions of up to 0.5 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaplate 96-well plate</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W82010</td>
			<td>Microdialysis plate. The Diaplate consists of two sides with a regenerated cellulose membrane in-between with a molecular weight cut-off of 10 kDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For holding dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating rack</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diacon kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor-standing vibration-free incubator</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD5-01</td>
			<td>400 L temperature-controlled incubator set to 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 C stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Planapo 1.0x objective, 7.8x &#8211; 160x zoom range with DMC 4500 camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memgold2</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-64</td>
			<td>Sparse-matrix screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlab STARlet</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable bottle top filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>DS0320-5045</td>
			<td>For fitering large volumes of buffers, for use with 0.22 &#181;m membrane filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing paddle</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput protein crystallization via microdialysis

Понимание структурно-функциональных взаимосвязей макромолекул, таких как белки, на молекулярном уровне жизненно важно для биомедицины и современных изобретений лекарств. На сегодняшний день рентгеновская кристаллография остается наиболее успешным методом решения трехмерных белковых структур с атомным разрешением. Благодаря недавним достижениям в области серийной кристаллографии, использующим рентгеновские лазеры на свободных электронах (XFEL) или источники синхротронного излучения, кристаллография белков вышла на новый уровень, где способность получать данные с временным разрешением обеспечивает важное механистическое понимание поведения биологических молекул при комнатной температуре. Этот протокол описывает простой рабочий процесс с высокой пропускной способностью (HTP) для скрининга условий кристаллизации с использованием 96-луночной диализной пластины. Эти планшеты соответствуют стандарту Общества биомолекулярного скрининга (SBS) и могут быть легко установлены с помощью любой стандартной кристаллизационной лаборатории. Как только оптимальные условия определены, с помощью диализатора можно получить большое количество кристаллов (сотни микрокристаллов). Чтобы подтвердить надежность и универсальность этого подхода, были кристаллизованы четыре различных белка, в том числе два мембранных белка.

Четыре белка кристаллизовали с помощью микродиализной пластины (с мембранами MWCO 10 кДа), включая два мембранных белка. Лизоцим куриного яичного белка из лиофилизированного порошка (см. Таблицу материалов) готовили при 50 mg.mL-1 в 20 мМ NaOAc (рН 4,5), а лиофилизированный тауматин (см. Таблицу материалов) растворяли в воде до конечной концентрации 25 mg.mL-1. Двумя мембранными белками, использованными в этом исследовании, были мультилекарственный отток E. coli AcrB и переносчик лактозы E. coli LacY. AcrB экспрессировали с использованием клеток C43 (DE3) и очищали с помощью аффинной хроматографии Ni-NTA и эксклюзионной хроматографии в 10 мМ Tris (pH 7,5), 300 мМ NaCl, 0,03% (мас./об.) n-додецил-β-D-мальтозида (DDM) и 5% (об./об.) глицерина32. Впоследствии белок концентрировали с помощью центробежного концентратора MWCO мощностью 100 кДа до конечной концентрации 6 mg.mL-1. LacY также экспрессировали в клетках C43 (DE3), очищали с помощью сродственной хроматографии Ni-сефарозы с последующей эксклюзионной хроматографией в 20 мМ Tris (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 0,03% (мас./об.) DDM, и концентрировали с помощью концентратора MWCO мощностью 100 кДа до 10 mg.mL-1 4,33.
Для белков лизоцима и тауматина 96-луночная микродиализная пластина была заполнена экраном кристаллизационной решетки, приготовленным на месте в качестве диализного раствора, в то время как для мембранного белка AcrB сетчатый экран был приготовлен на месте из ранее опубликованного условиякристаллизации 34. Для LacY первоначальные условия попадания были найдены на коммерческом экране (см. Таблицу материалов) и дополнительно оптимизированы с помощью сетчатого экрана, изготовленного собственными силами. Соотношение капель кристаллизации лизоцима, тауматина и AcrB составляло 1:100 при 2 мкл белка на 200 мкл осадителя (диализного раствора). Капли кристаллизации LacY также были в соотношении 1:100, с 1 мкл белка на 100 мкл диализного раствора из-за меньшего количества доступного белка.
Кристаллы всех четырех белков, включая мембранные белки, начали появляться между 1-8 часами при 20 ° C после установки с помощью микродиализной пластины. В этом случае не было необходимости дополнять диализный раствор детергентом для кристаллизации мембранного белка, обычно выполняемой во время стандартного процесса диализа для предотвращения агрегации мембранных белков, поскольку ожидалось, что мицеллы детергента будут больше, чем MWCO диализных мембран35.
После успешной кристаллизации белков на микродиализной пластине (рис. 4) были отмечены условия кристаллизации, и была проведена крупномасштабная кристаллизация диализом с использованием трубки диализатора с теми же диализными мембранами MWCO мощностью 10 кДа. Тысячи микрокристаллов для каждого из отдельных белков росли внутри диализатора, как показано на рисунке 5. Для кристаллизации тауматина 250 мкл белка загружали в диализатор и диализовали против 50 мл (соотношение 1:200). Для AcrB диализовали 250 мкл белка на 25 мл диализирующего раствора (1:100). Кристаллизация LacY также была установлена в том же соотношении со 100 мкл белка на 10 мл диализного раствора.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig04.jpg"> Рисунок 4: Кристаллы выращивают диализом с использованием микродиализной пластины. Протокол демонстрирует применимость установки с растворимыми белками: (А) лизоцим диализовали против 0,1 М NaOAc (рН 4,0), 0,5 М NaCl и 25% (об./об.) глицерина. (B) Тауматин диализировали против 0,1 М бис-триспропана (рН 6,6), 1 М тартрата К/На и 18% (об./об.) этиленгликоля. Также были получены кристаллы мембранных белков: (C) AcrB диализировали против 0,1 М MES (рН 5,5), 0,3 М NaCl и 20% (об. / об.) PEG-400. (D) LacY диализировали против 0,1 М MES (рН 6,5), 0,1 М NaCl и 32% (об. / об.) PEG-300. Изображения были получены с помощью стереомикроскопа с большим увеличением и перекрестным поляризатором. Масштабные линейки: (A, B, D) = 1 мм; (C) = 200 мкм. Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig04large.jpg" target="_blank">нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig05.jpg"> Рисунок 5: Репрезентативные изображения мембранных белковых кристаллов, выращенных диализом с использованием пробирки диализатора. (A) Изображение, показывающее пробирку, заполненную микрокристаллами (обозначено черной стрелкой). (B) Микроскопическое изображение 2 мкл из суспензии кристаллов тауматина, выращенной диализом с использованием пробирки диализатора объемом 0,5 мл, диализованной против 0,1 М бис-триспропана (рН 6,6), 1,4 М тартрата K/Na и 18% (об./об.) этиленгликоля. (C) Темное поле (слева) и светлопольное (справа) изображения микрокристаллов AcrB, выращенных диализом, против 0,1 М MES (рН 5,5), 0,3 М NaCl и 20% (об./об.) PEG-400. (D) Изображения в темноте (слева) и светлом поле (справа) микрокристаллов LacY, выращенных с помощью диализа, против 0,1 М MES (рН 6,5), 0,1 М NaCl и 32% (об. / об.) PEG-300. Наблюдаются некоторые осадки. Масштабные линейки: (B,D) = 200 мкм; (C) = 500 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis at JoVE.com

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Представленный протокол описывает простой подход к скринингу условий кристаллизации белка и роста кристаллов с использованием 96-луночной высокопроизводительной диализной пластины. Использование трубок-диализаторов для крупномасштабного выращивания микрокристаллов также продемонстрировано для серийной кристаллографии и приложений MicroED.

Высокопроизводительная кристаллизация белка с помощью микродиализа

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

Кристаллизация диализом является недостаточно используемым методом. Этот протокол представляет собой подход Novo к этому, который расширит диапазон стратегий кристаллизации, доступных в настоящее время для структурированного определения. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он обладает высокой пропускной способностью, прост в настройке без специального оборудования и позволяет легко контролировать рост кристаллов.Человек, выполняющий эту технику, должен чувствовать себя комфортно при малообъемном пипетировании и использовании многоканальных пипеток. Капли необходимо пипетировать как можно в достаточной степени, чтобы предотвратить частичное обезвоживание. Чтобы начать эксперимент по микродиализу, поместите коммерчески доступную 96-луночную пластину для микродиализа в ориентацию белка вверх и удалите клейкую покровную ленту, отклеив 200-микронную клейкую прокладку под давлением.Отклеив клейкую покровную ленту, обратите внимание на положение скважины А1. Затем с помощью многоканальной пипетки загрузите в каждую лунку максимум 3,2 микролитра правильно подготовленного образца белка. Правильно расположите 200-микронную УФ-пленку над 96-луночной пластиной пленкой вверх. Затем, чтобы активировать и запечатать прижимной клей, надавите на УФ-пленку с помощью уплотнительной лопатки и проверьте ее целостность.Теперь переверните пластину, чтобы привести ее к ориентации буферной стороной вверх, и обратите внимание на зеркальное положение отмеченной скважины A1. Используя многоканальную пипетку, загрузите максимум 350 микролитров диализирующего раствора в каждую лунку пластины и тщательно запечатайте лунки пленкой крышки резервуара. Затем поместите пластину буферной стороной вверх внутрь подходящего инкубатора с регулируемой температурой при температуре 20 градусов Цельсия, чтобы обеспечить рост кристаллов. Чтобы исследовать образование кристаллов под микроскопом, снимите защитную пленку с 200-микронной УФ-пленки и поместите пластину под окуляр белковой стороной вверх.Чтобы провести крупномасштабный эксперимент по кристаллизации, примите условия, в которых происходил рост микрокристаллов в микродиализной пластине, и воспроизведите те же условия в больших контейнерах. Размер емкости подбирается в зависимости от объема диализирующего раствора. Пипетка максимального объема 500 микролитров образца белка помещается в пробирку диализатора перед запечатыванием пробирки с помощью красного пластикового колпачка.Поместите герметичную пробирку диализатора объемом 500 микролитров в плавающую стойку внутри контейнера, заполненного диализирующим раствором. Затем поместите контейнер в подходящий инкубатор с регулируемой температурой при температуре 20 градусов Цельсия для достижения роста кристаллов. Чтобы проверить образование кристаллов, пипеткой нанесите один-два микролитра раствора из диализатора на предметное стекло.Накройте раствор на предметном стекле другим предметным стеклом и рассмотрите его под микроскопом. Изображения, полученные с помощью стереомикроскопа с большим увеличением, показали успешное образование микрокристаллов четырех белков с использованием микродиализных пластин с 10-килодальтонными мембранами с молекулярной массой. Было обнаружено, что лизоцим образует кристаллы при диализе против 0,1 молярного ацетата натрия при рН 4, содержащего соответствующие добавки.Доматин образовывал кристаллы при диализе против 0,1 молярного бис-триса пропана при рН 6,6, содержащего соответствующие добавки. Оптимизированные условия диализа привели к образованию микрокристаллов мембранными белками, а именно белком мультилекарственного насоса E.coli AcrB и переносчиком лактозы E.coli LacY. Крупномасштабная кристаллизация в пробирках диализатора с использованием оптимизированных условий диализа, полученных в результате экспериментов по микродиализу, привела к образованию тысяч микрокристаллов для каждого из белков.Для кристаллизации фомитина диализовали 250 микролитров белка против 50 миллилитров диализирующего раствора. Для AcrB диализовали 250 микролитров белка против 25 микролитров диализного раствора. Кристаллизация LacY также была установлена в том же соотношении: 100 микролитров белка на 10 миллилитров диализного раствора.При переворачивании пластины буферной стороной вверх важно отметить положение A1, чтобы можно было соответствующим образом распределить растворы из кристаллизационного экрана. Кристаллы, полученные с помощью этого метода, могут быть использованы для последующих применений, таких как серийная кристаллография и микроэректильная дисперсия.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Производство, Кристаллизация и структура Определение<em&gt; C. несговорчивый</em&gt; PPEP-1 с помощью Microseeding и цинк-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Высокая пропускная способность, абсолютное определение содержания выбранной белка на уровнях тканей, с использованием количественных Dot блот анализ (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Внеклеточный протеин технология Microarray для высокой пропускной способности обнаружения низкого сродства рецептор лиганд взаимодействий

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Стратегический скрининг и характеристика визуального GPCR-мини-G Белковый сигнальный комплекс для успешной кристаллизации

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Экономичная и универсальная высокопроизводительная система очистки белка с использованием многоколоночного пластинчатого адаптера

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Анализ флуоресценции кальция с двойным добавлением для высокопроизводительного скрининга рекомбинантных рецепторов, связанных с G-белком

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Высокопроизводительный скрининг для получения кристаллических попаданий для кристаллографии белка

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Высокопроизводительная количественная оценка синтеза и распределения митохондриальной ДНК на основе изображений

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...