Name: high-throughput protein crystallization via microdialysis
Uploaded: 2023-03-03T14:05:00
Duration: 6 min 18 s
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Reconocemos la financiación del Departamento de Negocios, Energía y Estrategia Industrial (BEIS) del Reino Unido. Agradecemos a Alex R. Jones y Mike Shaw del Laboratorio Nacional de Física por sus comentarios sobre el manuscrito.

1. Preparación de muestras de proteínas
<ol><li>Preparar (a través de métodos recombinantes o de otro modo) y purificar la(s) proteína(s) de interés en un tampón adecuado (es decir, uno que sea susceptible de estabilidad y cristalización de proteínas) que haya sido filtrado con un filtro de 0,22 μm (ver Tabla de materiales). Evaluar la calidad de la proteína (en términos de pureza, polidispersidad y estabilidad) antes de la cristalización31. NOTA: Consulte la sección de resultados representativos para obtener detalles sobre las proteínas y los tampones utilizados en el presente estudio.</li>
	<li>Concentre la muestra hasta 10-50 mg.mL-1 o más (dependiendo del objetivo de proteína) utilizando el concentrador MWCO correcto (consulte la Tabla de materiales). NOTA: La muestra concentrada puede utilizarse inmediatamente para cristalizar o almacenarse congelada a -80 °C.</li>
	<li>Si la proteína se ha congelado, centrifugar la muestra durante 10 minutos en una centrífuga de sobremesa (≥16.000 × g, a temperatura ambiente o 4 °C) para granular y eliminar cualquier material no deseado (por ejemplo, precipitados).</li>
	<li>Alícuota de la proteína en tubos de PCR limpios de 200 μL. Manténgalo en hielo o a 4 °C si la proteína es inestable a temperatura ambiente.</li>
</ol>2. Configuración de la placa de microdiálisis
NOTA: La placa de microdiálisis disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) consta de dos lados ('lado proteico' y 'lado tampón') con una membrana de celulosa regenerada (disponible en diferentes MWCO), como se muestra en la Figura 2.
<ol><li>Con la proteína orientada a la placa hacia arriba, retire y retire la cinta adhesiva (Figura 2A) del espaciador adhesivo adhesivo de 200 μm. Tome nota de la posición del pozo A1.</li>
	<li>Utilizando una pipeta multicanal, cargar un máximo de 3,2 μL de proteína (paso 1.4) en cada pocillo (figura 2B). NOTA: La proteína también se puede cargar utilizando una pipeta dispensadora repetida. Es posible usar una pipeta de un solo canal, pero aumentará la probabilidad de deshidratación parcial de las gotas debido al tiempo de carga prolongado.</li>
	<li>Coloque la película de cubierta UV de 200 μm (consulte la Tabla de materiales) sobre la placa de 96 pocillos y verifique su integridad (Figura 2C). Asegúrese de que la película protectora esté hacia arriba.</li>
	<li>Use una paleta de sellado (consulte la Tabla de materiales), presione hacia abajo la película de cubierta UV para activar y sellar el adhesivo de presión.</li>
	<li>Invierta la placa y tome nota de la posición del pozo A1. Asegúrese de que la placa esté orientada hacia arriba y que las posiciones del pozo estén reflejadas (Figura 2D).</li>
	<li>Con una pipeta multicanal, cargar un máximo de 350 μL de solución de diálisis en cada uno de los pocillos (figura 2D). NOTA: En este paso, se pueden utilizar pantallas de cristalización disponibles comercialmente (pantallas de matriz dispersa) o pantallas personalizadas hechas en laboratorio (pantallas de cuadrícula) (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Selle cuidadosamente los pozos con la "película de cubierta del depósito" (consulte la Tabla de materiales) (Figura 2E).</li>
	<li>Coloque la placa (con el lado del amortiguador hacia arriba) en una incubadora adecuada con temperatura controlada (20 °C) para el crecimiento de cristales. NOTA: Para las proteínas seleccionadas para el presente estudio, los cristales comenzaron a aparecer entre 1-8 h a 20 °C.</li>
	<li>Para inspeccionar si hay cristales bajo el microscopio, invierta la placa para levantar el lado de la proteína y retire la película protectora de la película de cubierta UV de 200 μm (paso 2.3), como se muestra en la Figura 2F, G.</li>
</ol>3. Cristalización a gran escala mediante tubos dializadores
NOTA: Una vez que se han explorado las condiciones de cristalización utilizando la placa de microdiálisis, se puede realizar la cristalización a gran escala de la proteína (para cristalografía en serie u otros fines) utilizando el tubo dializador, como se muestra en la Figura 3. Al igual que la placa de microdiálisis, estos dispositivos están disponibles con membranas de diálisis MWCO de 3, 5, 10 y 30 kDa.
<ol><li>Preparar la condición de cristalización optimizada para el crecimiento de microcristales en recipientes grandes (adoptando las condiciones optimizadas utilizando la placa de microdiálisis). Asegúrese de que el búfer se haya filtrado previamente con un filtro de 0,2 μm.</li>
	<li>Pipete la proteína en el tubo del dializador (volumen máximo de 0,5 ml) y selle el extremo con la tapa de plástico roja incluida (figura 3A).</li>
	<li>Coloque el tubo dializador de 500 μL en un recipiente de tamaño adecuado (dependiendo del volumen total de solución de diálisis) que contenga el bastidor flotante (consulte la Tabla de materiales), como se muestra en la figura 3B. NOTA: La rejilla flotante provista con el kit de dializador contiene hasta 18 tubos de dializador simultáneamente.</li>
	<li>Coloque el recipiente estacionario en una incubadora adecuada con temperatura controlada (20 °C) para el crecimiento de cristales.</li>
	<li>Para inspeccionar si hay cristales, pipetear 1-2 μL de la solución en un portaobjetos de cubierta de vidrio. Cubra con un segundo portaobjetos de cubierta de vidrio en la parte superior (para evitar el exceso de deshidratación) y vea bajo un microscopio (consulte la Tabla de materiales). NOTA: Los cristales pueden dañarse cuando se intercalan entre dos portaobjetos de cubierta de vidrio durante la inspección. Los cristales también se pueden ver directamente colocando el tubo dializador bajo un microscopio estéreo de gran aumento.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brooks-Bartlett, J. C., Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nobel+science:+One+hundred+years+of+crystallography.">The nobel science: One hundred years of crystallography.</a> Interdisciplinary Science Reviews. 40 (3), 244-264 (2015).</li><li>Maveyraud, L., Mourey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+X-ray+crystallography+and+drug+discovery.">Protein X-ray crystallography and drug discovery.</a> Molecules. 25 (5), (2020).</li><li>Kwan, T. O. 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Los coautores Pascelle Draper y Paul Reardon son empleados de SWISSCI.

Actualmente, la cristalización por diálisis es el método de cristalización más infrautilizado, debido a la naturaleza tediosa y de bajo rendimiento de los enfoques existentes, como la microdiálisis con botones. Aquí, un protocolo simple pero robusto sigue un flujo de trabajo de HTP para el crecimiento de cristales de proteínas por diálisis a través de una placa de microdiálisis disponible comercialmente y un tubo dializador. Dependiendo de la proteína objetivo, la placa de microdiálisis y el tubo dializador utilizados en el procedimiento vienen con la opción de una membrana de diálisis con un MWCO de 3, 5, 10 o 30 kDa. El protocolo se puede configurar fácilmente en cualquier instalación de cristalización estándar y tiene la gran ventaja de ser aplicable tanto a proteínas solubles como de membrana. Sin embargo, los complejos proteína-proteína y proteína-ácido nucleico no se probaron durante este protocolo.
Como en cualquier enfoque de cristalización por diálisis, la relación de volumen entre la muestra de proteína y la solución de diálisis es crítica. En este protocolo, se recomienda una relación de 1:100 entre la muestra y la solución de diálisis, pero dado que la placa de microdiálisis permite una capacidad máxima de 350 μL de solución de diálisis, estas proporciones se pueden explorar para obtener golpes de cristal. Un volumen de 1-2 μL de proteína se utiliza en el protocolo presentado al configurar placas de cristalización. Esto es para garantizar que las gotas se fijen con precisión con una pipeta manual multicanal. Mediante el uso de pipetas electrónicas (pipetas de dispensación multicanal o de repetición) o robots dispensadores de líquidos HTP, se pueden lograr gotas de volúmenes más bajos con precisión, reduciendo así la cantidad de proteína requerida. Además, debido a los volúmenes relativamente bajos de tampón de diálisis requeridos por la placa de microdiálisis (a diferencia de otros métodos de diálisis convencionales), es posible (sin el uso extensivo de recursos) explorar grandes espacios químicos, no solo utilizando pantallas de cristalización disponibles comercialmente sino también con pantallas de optimización (diseñadas en torno a la condición de impacto de cristalización inicial).
Un paso crítico en el procedimiento de HTP presentado es la aplicación oportuna de pequeños volúmenes de proteína (0.50-3.2 μL por condición) a la placa de diálisis para limitar la deshidratación y la pérdida de muestra. Esto se puede mitigar fácilmente mediante el uso de una pipeta multicanal, una pipeta de dispensación repetida o un sistema de cristalización robótica. El largo tiempo de incubación, como más de 2 semanas, de las placas a 20 °C puede provocar la deshidratación de las gotas de proteína o daños en los cristales recién formados. Mantener las placas de diálisis dentro de una cámara de humidificación o una bolsa sellable puede aliviar este efecto. Además, se recomienda el uso de materiales y técnicas estériles para evitar el crecimiento bacteriano.
Como se mencionó en la introducción, recientemente, con la creciente necesidad de comprender la dinámica estructural de las proteínas para los mecanismos de la enfermedad, las interacciones de unión proteína-ligando y las interacciones proteína-proteína, el campo de la cristalografía de rayos X de proteínas se ha revolucionado mediante el desarrollo de técnicas de cristalización nuevas y existentes, enfoques modernos para la entrega de muestras de cristal, nuevas generaciones de fuentes de rayos X y nuevos métodos sofisticados para la adquisición y procesamiento de datos36 ,37,38. Por lo tanto, el advenimiento de la microcristalografía seriada a temperatura ambiente, ya sea realizada utilizando XFELs o fuentes de luz sincrotrón, se ha convertido en una herramienta notable en biología estructural, específicamente en el campo de las proteínas de membrana39. Sin embargo, se requieren miles de microcristales para generar suficientes datos para una solución de estructura robusta, lo cual no es una tarea fácil (al menos por los métodos de cristalización convencionales). El método de cristalización de diálisis descrito aquí permite la producción de un gran número de microcristales. Una vez que se ha determinado la condición de cristalización para la producción de microcristales (1-10 μm) mediante el uso de una placa de microdiálisis, se pueden producir grandes cantidades de microcristales de alta densidad utilizando el dispositivo dializador de 0,5 ml (Figura 5). Estos cristales son ideales para la recolección de datos utilizando objetivos fijos o sistemas de suministro de muestras de chorro de líquido27,40. Los cristales obtenidos a través de este método también pueden ser apropiados para aplicaciones MicroED. Sin embargo, es posible que sea necesario fresar a un tamaño y grosor adecuados para esta aplicación específica, ya que los electrones interactúan mucho más fuertemente con los cristales que los fotones de rayos X41.
En conclusión, el enfoque de cristalización por diálisis descrito aquí se suma a las estrategias evolutivas en la cristalización de proteínas para la determinación de la estructura y amplía el rango de esfuerzos que se pueden emplear para determinar nuevos objetivos de proteínas que anteriormente no han tenido éxito con otros métodos convencionales.

Durante el último siglo, la cristalografía de rayos X ha sido fundamental para dilucidar y comprender el paradigma estructura-función de las macromoléculas biológicas. Hasta la fecha, sigue siendo uno de los métodos más exitosos para dilucidar las estructuras de resolución atómica de muchas proteínas singularmente diferentes que son cruciales para la comprensión fundamental de la bioquímica celular, la medicina y el descubrimiento temprano de fármacos 1,2. Sin embargo, la cristalización de proteínas sigue siendo un cuello de botella en el estudio de muchas dianas proteicas, particularmente proteínas de membrana y grandes complejos proteicos3. En consecuencia, la cristalización de proteínas casi siempre se considera un arte debido a los enfoques de ensayo y error intensivos en mano de obra empleados 4,5,6.
Por lo general, se agrega un agente precipitante a una solución de proteína a alta concentración para formar una disposición reticular bien ordenada, regular y repetitiva de moléculas de proteína, conocidas como cristales. En condiciones favorables, como temperatura, pH, concentración y agente precipitante, finalmente se forma una solución sobresaturada, seguida de nucleación cristalina y crecimiento 7,8. Aunque ha habido muchos avances en las configuraciones de prueba de cristalización, predominantemente con el desarrollo de sistemas robóticos de alto rendimiento y la disponibilidad de pantallas de "matriz dispersa" listas para usar, los enfoques generales para la cristalización de proteínas se han mantenido sin cambios a lo largo de los años. Las técnicas experimentales comunes de cristalización de proteínas incluyen la difusión de vapor (gota colgante y gota sentada)9, microlotes (bajo aceite)10,11, difusión de interfaz libre (dispositivos microfluídicos)12 y diálisis (uso de botones y otras técnicas)13,14,15. Sin embargo, también existen otras configuraciones más especializadas, como los enfoques de mesofase para cristalizar proteínas de membrana16,17. Si bien la mayoría de las estructuras de proteínas de rayos X depositadas en el Banco de Datos de Proteínas se han resuelto hasta ahora mediante métodos de cristalización por difusión de vapor 6,18, otros enfoques, como la cristalización por diálisis, parecen estar infrautilizados, probablemente debido a los aspectos prácticos relacionados con su configuración experimental.
La cristalización por diálisis simplemente se basa en la lenta difusión de solutos (precipitantes, iones, aditivos y tampones) a través de una membrana semipermeable que simultáneamente impide que circulen las moléculas de proteínas. De esta manera, la solución proteica se equilibra lentamente, y el precipitante alcanza la concentración necesaria para cristalizar. La cinética del sistema depende de la temperatura, la concentración de precipitante y el corte de peso molecular de la membrana de celulosa (MWCO)19. Hasta la fecha, la configuración de cristalización más popular por diálisis ha sido el uso de botones de microdiálisis hechos de láminas de acrílico transparente. Estos generalmente se sumergen en depósitos (principalmente utilizando placas de gota colgantes de difusión de vapor) que contienen las soluciones precipitantes de cristalización. Sin embargo, este método de menor rendimiento también requiere un ensamblaje específico para sellar la solución de proteína dentro de la membrana de diálisis colocada sobre la cámara del botón, como se ilustra en la Figura 1. Además, las burbujas de aire atrapadas entre la membrana de diálisis y la solución proteica son un problema frecuente que afecta el crecimiento de cristales. Otra limitación del método son los requisitos de la muestra, por lo que se necesitan concentraciones y volúmenes mucho más altos en comparación con los métodos de difusión de vapor, para acomodar los botones de diálisis. Por lo tanto, la cristalización mediante botones de microdiálisis se ha percibido como un método poco atractivo, especialmente para objetivos difíciles como las proteínas de membrana, cuyos rendimientos de purificación son frustrantemente bajos. Recientemente, se han desarrollado dispositivos microfluídicos para facilitar la cristalización de proteínas por diálisis15. Estos chips también han sido diseñados para tener una alta transparencia de rayos X con bajo fondo, lo que permite que los chips se utilicen para la recopilación de datos in situ a temperatura ambiente, eliminando así el inconveniente de cosechar y crioenfriar cristales. A pesar de estos avances, el enfoque sigue siendo de muy bajo rendimiento y costoso.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig01.jpg"> Figura 1: Representación esquemática de la cristalización por diálisis mediante botones de diálisis. (A) Representación esquemática de un botón de diálisis de cristalización. (B) La solución de proteína se agrega a la cámara de botón de microdiálisis. (C) La membrana de diálisis se sujeta al botón de microdiálisis con la ayuda de un anillo de goma (junta tórica) aplicado a través de un aplicador. (D) El botón de diálisis está listo para sumergirse en el depósito que contiene la solución de cristalización (solución de diálisis), como se muestra en (E). El vial que contiene el botón de diálisis sumergido debe sellarse para evitar la evaporación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Aquí, se presenta un protocolo sencillo para detectar las condiciones de cristalización de proteínas y el crecimiento de cristales utilizando la placa de diálisis de alto rendimiento de 96 pocillos. Estas placas desechables están diseñadas para ser utilizadas de manera similar a las placas de cristalización por difusión de vapor (pipeta y luego sello), como se muestra en la Figura 2. Las placas pueden acomodar hasta 3,2 μL de proteína y 350 μL de solución de diálisis. Cada pozo cuenta con una membrana de celulosa regenerada separada para evitar la contaminación cruzada entre los pozos. La configuración tarda alrededor de 10 minutos en completarse y no requiere ningún equipo especializado además de lo que se puede encontrar en todos los laboratorios de cristalización estándar. Se utilizan cuatro proteínas diferentes, incluidas dos proteínas de membrana, para demostrar y validar este enfoque como un método eficaz para la cristalografía de proteínas de alto rendimiento (HTP).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig02.jpg"> Figura 2: Flujo de trabajo de cristalización utilizando la placa de microdiálisis. (A) Eliminación de la "película de cubierta" adhesiva roja. (B) Dispensar las gotas de proteína en cada uno de los pocillos de gota. (C) Los pozos están cubiertos con la "película de cubierta" UV. (D) La placa se invierte para agregar las soluciones de diálisis (o pantalla de cristalización). (E) La placa se sella e incuba. (F,G) Inspección microscópica de las gotas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El uso de este protocolo de cristalización por diálisis se demostró utilizando el tubo dializador de 0,5 ml (Figura 3) para la producción a gran escala (cientos a miles) de microcristales, adecuados para métodos de recolección de datos de última generación, como la cristalografía en serie en ambas instalaciones XFEL 20,21,22,23,24 y sincrotrones25,26,27 , así como para los enfoques MicroED28,29,30.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig03.jpg"> Figura 3: Cristalización de microdiálisis a gran escala utilizando el tubo dializador . (A) Representación esquemática del tubo dializador de 0,5 ml. (B) Vista lateral de un vaso de precipitados que contiene la solución de cristalización y la rejilla de tubos flotantes que sostiene un tubo de dializador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0620</td>
			<td>For aliquoting protein solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>17823----------K</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate filters. For filtering dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSTF04700</td>
			<td>Membrane filters for filtering large volumes of buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 0.5 &#8211; 10 &#181;L Research plus pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000028</td>
			<td>For dispensing protein drops onto the Diaplate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 30 &#8211; 300 &#181;L Eppendorf Research plus pipette&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000060</td>
			<td>For dispensing dialysis solutions on the Diaplate reservoirs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15889152</td>
			<td>For use with syringe filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2.2 mL deep-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0788</td>
			<td>Polypropylene deep-well storage plates; for preparing screens using the Hamilton Microlab STARlet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000565</td>
			<td>With rotor FA-24x2 with a maximum g-force of 21,300 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diacon dialyser</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W72010</td>
			<td>Dialyzer tubes with a regenerated cellulose membrane with a molecular weight cut-off of 10 kDa. Ideal for protein solutions of up to 0.5 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaplate 96-well plate</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W82010</td>
			<td>Microdialysis plate. The Diaplate consists of two sides with a regenerated cellulose membrane in-between with a molecular weight cut-off of 10 kDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For holding dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating rack</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diacon kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor-standing vibration-free incubator</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD5-01</td>
			<td>400 L temperature-controlled incubator set to 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 C stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Planapo 1.0x objective, 7.8x &#8211; 160x zoom range with DMC 4500 camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memgold2</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-64</td>
			<td>Sparse-matrix screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlab STARlet</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable bottle top filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>DS0320-5045</td>
			<td>For fitering large volumes of buffers, for use with 0.22 &#181;m membrane filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing paddle</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput protein crystallization via microdialysis

Comprender las relaciones estructura-función de las macromoléculas, como las proteínas, a nivel molecular es vital para la biomedicina y el descubrimiento de fármacos modernos. Hasta la fecha, la cristalografía de rayos X sigue siendo el método más exitoso para resolver estructuras de proteínas tridimensionales a resolución atómica. Con los recientes avances en cristalografía en serie, ya sea utilizando láseres de electrones libres de rayos X (XFEL) o fuentes de luz sincrotrón, la cristalografía de proteínas ha progresado a la siguiente frontera, donde la capacidad de adquirir datos resueltos en el tiempo proporciona importantes conocimientos mecanicistas sobre el comportamiento de las moléculas biológicas a temperatura ambiente. Este protocolo describe un flujo de trabajo sencillo de alto rendimiento (HTP) para detectar condiciones de cristalización mediante el uso de una placa de diálisis de 96 pocillos. Estas placas siguen el estándar de la Sociedad para el Cribado Biomolecular (SBS) y se pueden configurar fácilmente utilizando cualquier laboratorio de cristalización estándar. Una vez que se identifican las condiciones óptimas, se pueden producir grandes cantidades de cristales (cientos de microcristales) utilizando el dializador. Para validar la robustez y versatilidad de este enfoque, se cristalizaron cuatro proteínas diferentes, incluidas dos proteínas de membrana.

Cuatro proteínas se cristalizaron utilizando la placa de microdiálisis (con membranas MWCO de 10 kDa), incluyendo dos proteínas de membrana. La lisozima de clara de huevo de gallina del polvo liofilizado (ver Tabla de materiales) se preparó a 50 mg.mL-1 en 20 mM NaOAc (pH 4.5), y la taumatina liofilizada (ver Tabla de materiales) se disolvió en agua a una concentración final de 25 mg.mL-1. Las dos proteínas de membrana utilizadas en este estudio fueron la bomba de eflujo multifármaco AcrB de E. coli y el transportador de lactosa de E. coli LacY. AcrB se expresó utilizando células C43 (DE3) y se purificó mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA y cromatografía de exclusión de tamaño en 10 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl, 0,03% (p/v) n-dodecil-β-D-maltósido (DDM) y 5% (v/v) glicerol32. Posteriormente, la proteína se concentró utilizando un concentrador centrífugo MWCO de 100 kDa hasta una concentración final de 6 mg.mL-1. LacY también se expresó en células C43 (DE3), purificadas por cromatografía de afinidad de Ni-sefarosa, seguida de cromatografía de exclusión de tamaño en 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,03% (p/v) DDM, y concentrado utilizando un concentrador MWCO de 100 kDa a 10 mg.mL-1 4,33.
Para las proteínas lisozima y taumatina, la placa de microdiálisis de 96 pocillos se llenó con una pantalla de rejilla de cristalización preparada internamente como solución de diálisis, mientras que para la proteína de membrana AcrB, se preparó internamente una pantalla de cuadrícula a partir de una condición de cristalización previamente publicada34. Para LacY, las condiciones de impacto iniciales se encontraron en una pantalla comercial (ver Tabla de materiales) y se optimizaron aún más con una pantalla de cuadrícula hecha internamente. La relación de caída de cristalización para lisozima, taumatina y AcrB fue de 1:100, con 2 μL de proteína a 200 μL de precipitante (solución de diálisis). Las gotas de cristalización de LacY también estaban en una proporción de 1:100, con 1 μL de proteína a 100 μL de solución de diálisis, debido a una menor cantidad de proteína disponible.
Los cristales de las cuatro proteínas, incluidas las proteínas de membrana, comenzaron a aparecer entre 1-8 h a 20 °C después de la configuración con la placa de microdiálisis. En este caso, no fue necesario complementar la solución de diálisis con detergente para la cristalización de la proteína de membrana, típicamente realizada durante el proceso de diálisis estándar para evitar la agregación de proteínas de membrana, ya que se esperaba que las micelas detergentes fueran más grandes que el MWCO de las membranas de diálisis35.
Después de la cristalización exitosa de las proteínas en la placa de microdiálisis (Figura 4), se observaron condiciones de cristalización y se realizó cristalización a gran escala por diálisis utilizando el tubo dializador con las mismas membranas de diálisis MWCO de 10 kDa. Miles de microcristales para cada una de las proteínas individuales crecieron dentro del dializador, como se muestra en la Figura 5. Para la cristalización de taumatina, se cargaron 250 μL de proteína en el dializador y se dializaron contra 50 ml (proporción 1:200). Para AcrB, se dializaron 250 μL de proteína contra 25 ml de solución de diálisis (1:100). La cristalización de LacY también se estableció en la misma proporción con 100 μL de proteína a 10 ml de solución de diálisis.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig04.jpg"> Figura 4: Los cristales se cultivan por diálisis utilizando la placa de microdiálisis. El protocolo demuestra la aplicabilidad de la configuración con proteínas solubles: (A) La lisozima se dializó contra 0,1 M NaOAc (pH 4,0), 0,5 M NaCl y 25% (v/v) glicerol. (B) La taumatina se dializó contra 0,1 M de propano Bis-tris (pH 6,6), 1 M de k/na de tartrato y 18% (v/v) de etilenglicol. También se obtuvieron cristales para proteínas de membrana: (C) AcrB se dializó contra 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl y 20% (v/v) PEG-400. (D) LacY se dializó contra 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl y 32% (v/v) PEG-300. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio estéreo de gran aumento con un polarizador cruzado. Barras de escala: (A,B,D) = 1 mm; (C) = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig05.jpg"> Figura 5: Imágenes representativas de cristales de proteína de membrana cultivados por diálisis utilizando el tubo dializador. (A) Imagen que muestra el tubo lleno de microcristales (indicado por la flecha negra). (B) Imagen microscópica de 2 μL de una suspensión de cristales de taumatina cultivados por diálisis utilizando el tubo dializador de 0,5 ml, dializado contra 0,1 M de propano Bis-Tris (pH 6,6), tartrato de 1,4 M K/Na y 18% (v/v) de etilenglicol. (C) Imágenes de campo oscuro (izquierda) y campo claro (derecha) de microcristales de AcrB cultivados por diálisis contra 0.1 M MES (pH 5.5), 0.3 M NaCl y 20% (v / v) PEG-400. (D) Imágenes de campo oscuro (izquierda) y campo claro (derecha) de microcristales LacY cultivados por diálisis contra 0.1 M MES (pH 6.5), 0.1 M NaCl y 32% (v/v) PEG-300. Se observan algunos precipitados. Barras de escala: (B,D) = 200 μm; (C) = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

El protocolo presentado describe un enfoque sencillo para la detección de las condiciones de cristalización de proteínas y el crecimiento de cristales utilizando una placa de diálisis de alto rendimiento de 96 pocillos. El uso de tubos dializadores para el crecimiento a gran escala de microcristales también se demuestra para aplicaciones de cristalografía en serie y MicroED.

Cristalización de proteínas de alto rendimiento mediante microdiálisis

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

La cristalización por diálisis es un método infrautilizado. Este protocolo presenta un enfoque Novo para esto, lo que aumentará la gama de estrategias de cristalización actualmente disponibles para la determinación estructurada. Las principales ventajas de esta técnica son que es de alto rendimiento, fácil de configurar sin necesidad de equipos especializados, y permite un fácil monitoreo del crecimiento de cristales.La persona que realiza esta técnica debe sentirse cómoda con el pipeteo de bajo volumen y el uso de pipetas multicanal. Las gotas deben pipetearse lo más suficiente posible para evitar la deshidratación parcial. Para configurar el experimento de microdiálisis, coloque una placa de microdiálisis de 96 pocillos disponible comercialmente en la orientación del lado de la proteína hacia arriba y retire la cinta adhesiva de la cubierta despegando el espaciador adhesivo de presión de 200 micras.Después de despegar la cinta adhesiva de la cubierta, observe la posición del pozo A1. A continuación, utilizando una pipeta multicanal, cargue un máximo de 3,2 microlitros de muestra de proteína preparada adecuadamente en cada pocillo. Coloque correctamente la película de cubierta UV de 200 micras sobre la placa de 96 pocillos con la película hacia arriba. Luego, para activar y sellar el adhesivo de presión, presione la película de cubierta UV con una paleta de sellado y verifique su integridad.Ahora, invierta la placa para llevarla a la orientación del lado del búfer hacia arriba y tome nota de la posición espejada del pozo marcado A1. Usando una pipeta multicanal, cargue un máximo de 350 microlitros de la solución de diálisis en cada pocillo de la placa y selle cuidadosamente los pocillos con la película de cubierta del depósito. Luego, coloque la placa en la orientación del lado del amortiguador hacia arriba dentro de una incubadora adecuada con temperatura controlada a 20 grados centígrados para permitir el crecimiento de cristales. Para examinar la formación de cristales bajo el microscopio, retire la película protectora de la película de cubierta UV de 200 micras y coloque la placa debajo del ocular con el lado de la proteína hacia arriba.Para establecer un experimento de cristalización a gran escala, adopte las condiciones en las que se produjo el crecimiento de microcristales en la placa de microdiálisis y replique las mismas condiciones en recipientes grandes. Seleccione el tamaño del envase en función del volumen de la solución de diálisis. Pipetear un volumen máximo de 500 microlitros de muestra de proteína en el tubo del dializador antes de sellar el tubo con la tapa de plástico roja.Coloque el tubo sellado del dializador de 500 microlitros en la rejilla flotante dentro del recipiente lleno de solución de diálisis. A continuación, coloque el recipiente sin perturbaciones dentro de una incubadora adecuada con temperatura controlada a 20 grados centígrados para lograr el crecimiento de cristales. Para comprobar la formación de cristales, pipetear uno o dos microlitros de la solución del dializador a un portaobjetos de cubierta de vidrio.Cubra la solución en el portaobjetos con otro portaobjetos de vidrio y véalo bajo un microscopio. Las imágenes capturadas con un microscopio estereoscópico de gran aumento mostraron la formación exitosa de microcristales de cuatro proteínas utilizando las placas de microdiálisis con membranas de corte de peso molecular de 10 kilodalton. Se encontró que la lisozima forma cristales cuando se dializa contra 0,1 molar acetato de sodio a pH 4 que contiene aditivos apropiados.Domatin formó cristales cuando se dializó contra 0,1 molares de propano bis-tris a pH 6,6 que contenía aditivos apropiados. Las condiciones de diálisis optimizadas condujeron a la formación de microcristales por las proteínas de membrana, a saber, la proteína AcrB de la bomba de eflujo multifármaco E. coli y el transportador de lactosa E. coli LacY. La cristalización a gran escala en los tubos dializadores empleando las condiciones de diálisis optimizadas obtenidas de los experimentos de microdiálisis condujo a la formación de miles de microcristales para cada una de las proteínas.Para la cristalización de la fomitina, se dializaron 250 microlitros de proteína contra 50 mililitros de la solución de diálisis. Para AcrB, 250 microlitros de la proteína se dializaron contra 25 microlitros de solución de diálisis. La cristalización de LacY también se estableció en la misma proporción, con 100 microlitros de proteína por 10 mililitros de solución de diálisis.Al invertir la placa hacia el lado del amortiguador hacia arriba, es importante tener en cuenta la posición de A1, de modo que las soluciones de la pantalla de cristalización se puedan dispensar en consecuencia. Los cristales obtenidos de este método se pueden utilizar para aplicaciones posteriores, como cristalografía en serie y micro ED.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Método para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción proteína-proteína entre HCN1 y TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Investigación

Bioquímica

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Producción, Cristalización y determinación de la estructura de<em&gt; C. difícil</em&gt; PPEP-1 a través de microsiembra y Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Alto rendimiento, la absoluta determinación del contenido de una proteína seleccionada a nivel de tejido con punto cuantitativo Blot análisis (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

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High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Cuantificación basada en imágenes de alto rendimiento de la síntesis y distribución del ADN mitocondrial

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...