Name: high-throughput protein crystallization via microdialysis
Uploaded: 2023-03-03T14:05:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis at JoVE.com

Vi erkänner finansiering från Storbritanniens Department of Business, Energy and Industrial Strategy (BEIS). Vi tackar Alex R. Jones och Mike Shaw från National Physical Laboratory för deras feedback på manuskriptet.

1. Beredning av proteinprov
<ol><li>Bered (genom rekombinanta metoder eller på annat sätt) och rena proteinet eller proteinerna av intresse i en lämplig buffert (dvs. en som är mottaglig för proteinstabilitet och kristallisation) som har filtrerats med ett 0,22 μm filter (se Materialförteckning). Utvärdera proteinkvaliteten (med avseende på renhet, polydispersitet och stabilitet) före kristallisation31. OBS: Se avsnittet representativa resultat för detaljer om proteiner och buffertar som används i den aktuella studien.</li>
	<li>Koncentrera provet upp till 10-50 mg.mL-1 eller högre (beroende på proteinmålet) med rätt MWCO-koncentrator (se materialtabell). OBS: Det koncentrerade provet kan användas omedelbart för kristallisation eller förvaras fryst vid -80 °C.</li>
	<li>Om proteinet har frysts, centrifugera provet i 10 minuter i en bänkcentrifug (≥16 000 × g, vid rumstemperatur eller 4 °C) till pelletering och avlägsna oönskat material (t.ex. fällningar).</li>
	<li>Alikvot proteinet i rena 200 μL PCR-rör. Förvara den på is eller vid 4 °C om proteinet är instabilt vid rumstemperatur.</li>
</ol>2. Ställa in mikrodialysplattan
OBS: Den kommersiellt tillgängliga mikrodialysplattan (se materialtabellen) består av två sidor ("proteinsidan" och "buffertsidan") med ett regenererat cellulosamembran (tillgängligt i olika MWCO), som visas i figur 2.
<ol><li>Med den plattorienterade proteinsidan uppåt, dra tillbaka och ta bort den självhäftande täcktejpen (figur 2A) från den självhäftande tryckdistansen på 200 μm. Notera positionen för brunn A1.</li>
	<li>Fyll på maximalt 3,2 μl protein (steg 1.4) i varje brunn med en flerkanalig pipett (figur 2B). OBS: Proteinet kan också laddas med en upprepad doseringspipett. Det är möjligt att använda en enkanals pipett, men det ökar sannolikheten för partiell uttorkning av dropparna på grund av den förlängda laddningstiden.</li>
	<li>Placera 200 μm UV-täckfilmen (se materialförteckning) över 96-brunnsplattan och kontrollera dess integritet (figur 2C). Se till att skyddsfilmen är vänd uppåt.</li>
	<li>Använd en tätningspaddel (se Materialförteckning), tryck ner UV-täckfilmen för att aktivera och täta trycklimet.</li>
	<li>Vänd plattan och notera positionen för brunn A1. Se till att plattan är orienterad med buffertsidan uppåt och att brunnspositionerna speglas (figur 2D).</li>
	<li>Fyll på maximalt 350 μl dialyslösning i var och en av brunnarna med hjälp av en flerkanalig pipett (figur 2D). OBS: I detta steg kan antingen kommersiellt tillgängliga kristallisationsskärmar (glesa matrisskärmar) eller laboratorietillverkade anpassade skärmar (rutnätskärmar) användas (se materialförteckning).</li>
	<li>Försegla brunnarna försiktigt med "täckfilmen för behållaren" (se Materialförteckning) (figur 2E).</li>
	<li>Placera plattan (buffertsidan uppåt) i en lämplig temperaturkontrollerad inkubator (20 °C) för kristalltillväxt. OBS: För de proteiner som valts ut för den aktuella studien började kristallerna dyka upp mellan 1-8 timmar vid 20 °C.</li>
	<li>För att inspektera kristaller under mikroskopet, vänd plattan upp och ner för att få proteinsidan uppåt och ta bort skyddsfilmen från 200 μm UV-täckfilmen (steg 2.3), som visas i figur 2F, G.</li>
</ol>3. Storskalig kristallisation med dialysatorrör
OBS: När kristallisationsförhållandena har undersökts med hjälp av mikrodialysplattan kan storskalig kristallisation av proteinet (för seriell kristallografi eller andra ändamål) utföras med hjälp av dialysatorröret, som visas i figur 3. I likhet med mikrodialysplattan finns dessa enheter med 3, 5, 10 och 30 kDa MWCO-dialysmembran.
<ol><li>Förbered det optimerade kristallisationstillståndet för tillväxt av mikrokristaller i stora behållare (anta de förhållanden som optimerats med mikrodialysplattan). Se till att bufferten tidigare har filtrerats med ett 0,2 μm filter.</li>
	<li>Pipettera in proteinet i dialysatorröret (maximal volym på 0,5 ml) och försegla änden med det medföljande röda plastlocket (figur 3A).</li>
	<li>Placera dialysatorröret på 500 μl i en behållare av lämplig storlek (beroende på den totala volymen dialyslösning) som innehåller det flytande stället (se materialtabellen) enligt figur 3B. OBS: Det flytande stället som medföljer dialysatorsatsen rymmer upp till 18 dialysatorrör samtidigt.</li>
	<li>Placera behållaren stationärt i en lämplig temperaturkontrollerad inkubator (20 °C) för kristalltillväxt.</li>
	<li>För att inspektera kristaller, pipettera 1-2 μL av lösningen på ett glaslock. Täck med ett andra glasskydd, glid ovanpå (för att förhindra överdriven uttorkning) och se under ett mikroskop (se materialförteckning). OBS: Kristaller kan skadas när de kläms in mellan två glastäcken under inspektionen. Kristaller kan också ses direkt genom att placera dialysatorröret under ett stereomikroskop med hög förstoring.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brooks-Bartlett, J. C., Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nobel+science:+One+hundred+years+of+crystallography.">The nobel science: One hundred years of crystallography.</a> Interdisciplinary Science Reviews. 40 (3), 244-264 (2015).</li><li>Maveyraud, L., Mourey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+X-ray+crystallography+and+drug+discovery.">Protein X-ray crystallography and drug discovery.</a> Molecules. 25 (5), (2020).</li><li>Kwan, T. O. C., Axford, D., Moraes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+crystallography+in+the+era+of+modern+structural+biology.">Membrane protein crystallography in the era of modern structural biology.</a> Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2505-2524 (2020).</li><li>Birch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+art+of+integral+membrane+protein+crystallisation.">The fine art of integral membrane protein crystallisation.</a> Methods. 147, 150-162 (2018).</li><li>Gorrec, F., L&#246;we, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protocols+for+macromolecular+crystallization+at+the+MRC+laboratory+of+molecular+biology.">Automated protocols for macromolecular crystallization at the MRC laboratory of molecular biology.</a> Journal of Visualized Experiments. 131 (131), (2018).</li><li>Govada, L., Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+method+of+crystallization+to+obtain+optimal+results.">Choosing the method of crystallization to obtain optimal results.</a> Crystals. 9 (2), 106 (2019).</li><li>Chayen, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+protein+crystallisation+from+an+art+into+science.">Turning protein crystallisation from an art into science.</a> Current Opinion in Structural Biology. 14 (5), 577-583 (2004).</li><li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).</li><li>Gulbis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallography:+methods+and+protocols.">Protein crystallography: methods and protocols.</a> Crystallography Reviews. 24 (2), 136-143 (2018).</li><li>D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+for+optimization+in+protein+crystallization:+What+have+we+learned.">Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned.</a> Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 70 (9), 1117-1126 (2014).</li><li>Shaw Stewart, ., D, P., Kolek, S. A., Briggs, R. A., Chayen, N. E., Baldock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+microseeding:+a+theoretical+and+practical+exploration+of+seed+stability+and+seeding+techniques+for+successful+protein+crystallization.">Random microseeding: a theoretical and practical exploration of seed stability and seeding techniques for successful protein crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Junius, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+both+on-chip+dialysis+protein+crystallization+and+in+situ+X-ray+diffraction.">A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction.</a> Lab on a Chip. 20 (2), 296-310 (2020).</li><li>Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystallization+of+biological+macromolecules+using+dialysis+combined+with+temperature+control.">Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (3), 686-698 (2020).</li><li>Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystal+growth+for+neutron+macromolecular+crystallography.">Optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. 169, (2021).</li><li>Jaho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+proteins+on+chip+by+microdialysis+for+in+situ+X-ray+diffraction+studies.">Crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ X-ray diffraction studies.</a> Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, 2501 (2011).</li><li>Ujwal, R., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+using+the+lipidic+bicelle+method.">High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method.</a> Journal of Visualized Experiments. 59, (2012).</li><li>Parker, J. L., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+crystallisation:+Current+trends+and+future+perspectives.">Membrane protein crystallisation: Current trends and future perspectives.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 922. , 61-72 (2016).</li><li>Apostolopoulou, V., Junius, N., Sear, R. P., Budayova-Spano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing+salts+and+polyethylene+glycol+into+protein+solutions:+The+effects+of+diffusion+across+semi-permeable+membranes+and+of+convection.">Mixing salts and polyethylene glycol into protein solutions: The effects of diffusion across semi-permeable membranes and of convection.</a> Crystal Growth &amp; Design. 20 (6), 3927-3936 (2020).</li><li>Neutze, R., Wouts, R., Vander Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+biomolecular+imaging+with+femtosecond+X-ray+pulses.">Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses.</a> Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).</li><li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography.">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-78 (2011).</li><li>Mizohata, E., Nakane, T., Fukuda, Y., Nango, E., Iwata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography+at+the+SACLA:+breakthrough+to+dynamic+structural+biology.">Serial femtosecond crystallography at the SACLA: breakthrough to dynamic structural biology.</a> Biophysical Reviews. 10 (2), 209-218 (2018).</li><li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation.">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).</li><li>Johansson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XFEL+structures+of+the+human+MT2+melatonin+receptor+reveal+the+basis+of+subtype+selectivity.">XFEL structures of the human MT2 melatonin receptor reveal the basis of subtype selectivity.</a> Nature. 569 (7755), 289-292 (2019).</li><li>Owen, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+fixed-target+serial+synchrotron+crystallography.">Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (4), 373-378 (2017).</li><li>Weinert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+millisecond+crystallography+for+routine+room-temperature+structure+determination+at+synchrotrons.">Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons.</a> Nature communications. 8 (1), 542 (2017).</li><li>Axford, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+states+of+a+light-sensitive+membrane+protein+captured+at+room+temperature+using+thin-film+sample+mounts.">Two states of a light-sensitive membrane protein captured at room temperature using thin-film sample mounts.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 52-58 (2022).</li><li>Nannenga, B. L., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cryo-EM+method+microcrystal+electron+diffraction+(MicroED).">The cryo-EM method microcrystal electron diffraction (MicroED).</a> Nature Methods. 16 (5), 369-379 (2019).</li><li>Nguyen, C., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+protein+structure+determination+with+MicroED.">Beyond protein structure determination with MicroED.</a> Current Opinion in Structural Biology. 64, 51-58 (2020).</li><li>Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+microcrystal+electron+diffraction+(MicroED).">An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED).</a> Annual Review of Biochemistry. 90, 431-450 (2021).</li><li>Kwan, T. O. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+biophysical+methods+for+characterisation+of+membrane+proteins.">Selection of biophysical methods for characterisation of membrane proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 2605 (2019).</li><li>Pos, K. M., Purification Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=crystallization+and+preliminary+diffraction+studies+of+AcrB,+an+inner-membrane+multi-drug+efflux+protein.">crystallization and preliminary diffraction studies of AcrB, an inner-membrane multi-drug efflux protein.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (10), 1865-1867 (2002).</li><li>Guan, L., Mirza, O., Verner, G., Iwata, S., Kaback, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determination+of+wild-type+lactose+permease.">Structural determination of wild-type lactose permease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (39), 15294-15298 (2007).</li><li>Kwan, T. O. C., Reis, R., Moraes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+measurements+of+polypeptide+samples+by+dynamic+light+scattering:+membrane+proteins,+a+case+study.">In situ measurements of polypeptide samples by dynamic light scattering: membrane proteins, a case study.</a> Methods in Molecular Biology. , 189-202 (2021).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Wickstrand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tool+for+visualizing+protein+motions+in+time-resolved+crystallography.">A tool for visualizing protein motions in time-resolved crystallography.</a> Structural Dynamics. 7 (2), 024701 (2020).</li><li>Orville, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+results+in+time+resolved+serial+femtosecond+crystallography+at+XFELs.">Recent results in time resolved serial femtosecond crystallography at XFELs.</a> Current Opinion in Structural Biology. 65, 193-208 (2020).</li><li>Schulz, E. C., Yorke, B. A., Pearson, A. R., Mehrabi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+time-resolved+serial+synchrotron+crystallography.">Best practices for time-resolved serial synchrotron crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 14-29 (2022).</li><li>Neutze, R., Br&#228;nd&#233;n, G., Schertler, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+structural+biology+using+X-ray+free+eletron+lasers.">Membrane protein structural biology using X-ray free eletron lasers.</a> Current Opinion in Structural Biology. 33, 115-125 (2015).</li><li>Wierstall, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+sample+delivery+techniques+for+serial+femtosecond+crystallography.">Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).</li><li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals.">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345 (2013).</li></ol>

Medförfattarna Pascelle Draper och Paul Reardon är anställda av SWISSCI.

För närvarande är kristallisation genom dialys den mest underutnyttjade kristallisationsmetoden, nämligen på grund av den låga genomströmningen och tråkiga karaktären hos de befintliga metoderna, såsom mikrodialys med knappar. Här följer ett enkelt men robust protokoll ett HTP-arbetsflöde för proteinkristalltillväxt genom dialys genom en kommersiellt tillgänglig mikrodialysplatta och dialysatorrör. Beroende på målproteinet kommer mikrodialysplattan och dialysatorröret som används i proceduren med ett val av ett dialysmembran med en 3, 5, 10 eller 30 kDa MWCO. Protokollet kan enkelt ställas in i vilken standardkristallisationsanläggning som helst och har den stora fördelen att det är tillämpligt på både lösliga proteiner och membranproteiner. Protein-protein och protein-nukleinsyrakomplex testades emellertid inte under detta protokoll.
Som i alla kristallisationsmetoder med dialys är volymförhållandet mellan proteinprovet och dialyslösningen kritiskt. I detta protokoll rekommenderas ett förhållande på 1:100 mellan provet och dialyslösningen, men eftersom mikrodialysplattan tillåter en maximal kapacitet på 350 μL dialyslösning kan dessa förhållanden undersökas för att erhålla kristallträffar. En volym av 1-2 μL protein används i det presenterade protokollet vid inställning av kristallisationsplattor. Detta för att säkerställa att dropparna ställs in exakt med en manuell flerkanalig pipett. Genom att använda elektroniska pipetter (flerkanaliga eller upprepade doseringspipetter) eller HTP-vätskedispenseringsrobotar kan droppar med lägre volymer uppnås exakt, vilket minskar mängden protein som krävs. På grund av de relativt låga volymer dialysbuffert som krävs av mikrodialysplattan (i motsats till andra konventionella dialysmetoder) är det dessutom möjligt (utan omfattande resursanvändning) att utforska stora kemiska utrymmen, inte bara med kommersiellt tillgängliga kristallisationsskärmar utan också med optimeringsskärmar (utformade kring det initiala kristallisationsträfftillståndet).
Ett kritiskt steg i det presenterade HTP-förfarandet är snabb applicering av små proteinvolymer (0,50-3,2 μL per tillstånd) till dialysplattan för att begränsa uttorkning och provförlust. Detta kan enkelt mildras genom att använda en flerkanalig pipett, en upprepad dispenseringspipett eller ett robotkristallisationssystem. Den långa inkubationstiden, till exempel mer än 2 veckor, av plattorna vid 20 °C kan leda till uttorkning av proteindropparna eller skador på de nyligen bildade kristallerna. Att hålla dialysplattorna inuti en befuktningskammare eller en förslutningsbar påse kan lindra denna effekt. Dessutom rekommenderas användning av sterila material och tekniker för att undvika bakterietillväxt.
Som nämnts i inledningen, nyligen, med det ökade behovet av att förstå proteinstrukturdynamik för sjukdomsmekanismer, protein-ligandbindningsinteraktioner och protein-proteininteraktioner, har området proteinröntgenkristallografi revolutionerats genom utveckling av nya och befintliga kristallisationstekniker, moderna metoder för kristallprovleverans, nya generationer av röntgenkällor och nya sofistikerade metoder för datainsamling och bearbetning36 ,37,38. Därför har tillkomsten av seriell mikrokristallografi vid rumstemperatur, antingen utförd med XFEL eller synkrotronljuskällor, framstått som ett anmärkningsvärt verktyg inom strukturbiologi, särskilt inom membranproteiner39. Tusentals mikrokristaller krävs dock för att generera tillräckligt med data för en robust strukturlösning, vilket inte är en lätt uppgift (åtminstone med konventionella kristallisationsmetoder). Dialyskristallisationsmetoden som beskrivs här möjliggör produktion av ett stort antal mikrokristaller. När kristallisationstillståndet för produktion av mikrokristaller (1-10 μm) har bestämts genom användning av en mikrodialysplatta kan stora mängder mikrokristaller med hög densitet produceras med användning av dialysatoranordningen på 0,5 ml (figur 5). Dessa kristaller är idealiska för datainsamling med fasta mål eller leveranssystem för vätskestrålprov27,40. Kristaller erhållna genom denna metod kan också vara lämpliga för MicroED-applikationer. Dessa kan dock behöva fräsas ner till en lämplig storlek och tjocklek för denna specifika applikation, eftersom elektroner interagerar mycket starkare med kristaller än röntgenfotoner41.
Sammanfattningsvis bidrar kristallisationen genom dialysmetoden som beskrivs här till de utvecklande strategierna inom proteinkristallisation för strukturbestämning och utökar utbudet av ansträngningar än vad som kan användas för att bestämma nya proteinmål som tidigare har misslyckats med andra konventionella metoder.

Under det senaste århundradet har röntgenkristallografi varit avgörande för att belysa och förstå struktur-funktionsparadigmet för biologiska makromolekyler. Hittills fortsätter det att vara en av de mest framgångsrika metoderna för att belysa atomupplösningsstrukturer för många unikt olika proteiner som är avgörande för den grundläggande förståelsen av cellbiokemi, medicin och tidig läkemedelsupptäckt 1,2. Proteinkristallisation är dock fortfarande en flaskhals när man studerar många proteinmål, särskilt membranproteiner och stora proteinkomplex3. Följaktligen anses proteinkristallisation nästan alltid vara en konst på grund av de arbetsintensiva trial-and-error-metoderna som används 4,5,6.
Ett utfällningsmedel tillsätts vanligtvis till en proteinlösning vid hög koncentration för att bilda ett välordnat, regelbundet och upprepande gitterarrangemang av proteinmolekyler, kända som kristaller. Under gynnsamma förhållanden, såsom temperatur, pH, koncentration och fällningsmedel, bildas så småningom en övermättad lösning, följt av kristallkärnbildning och tillväxt 7,8. Även om det har skett många framsteg inom kristallisationsförsök, främst med utvecklingen av robotsystem med hög genomströmning och tillgången till färdiga "glesa matris" -skärmar, har de allmänna metoderna för proteinkristallisering i stort sett varit oförändrade genom åren. Vanliga experimentella proteinkristallisationstekniker inkluderar ångdiffusion (hängande droppe och sittande droppe)9, mikrobatch (under olja)10,11, fritt gränssnittsdiffusion (mikrofluidiska enheter)12 och dialys (med knappar och andra tekniker)13,14,15. Men andra mer specialiserade inställningar finns också, såsom mesofasmetoder för kristallisering av membranproteiner16,17. Medan majoriteten av röntgenproteinstrukturer som deponerats i proteindatabanken hittills har lösts genom kristallisation med ångdiffusionsmetoder 6,18, verkar andra metoder, såsom kristallisation genom dialys, vara underutnyttjade, troligen på grund av de praktiska aspekterna relaterade till deras experimentella uppställning.
Kristallisation genom dialys bygger helt enkelt på långsam diffusion av lösta ämnen (fällningsmedel, joner, tillsatser och buffertar) genom ett halvpermeabelt membran som samtidigt förhindrar proteinmolekyler från att cirkulera. På detta sätt bringas proteinlösningen långsamt i jämvikt, med fällningen som når den nödvändiga koncentrationen för att kristallisera. Systemets kinetik beror på temperatur, utfällningskoncentration och cellulosamembranets molekylviktsgräns (MWCO)19. Hittills har den mest populära kristallisationsinställningen genom dialys använt mikrodialysknappar gjorda av transparenta akrylark. Dessa är vanligtvis nedsänkta i reservoarer (mestadels med hjälp av ångdiffusionshängande droppplattor) innehållande kristallisationsutfällningslösningarna. Denna metod med lägre genomströmning kräver emellertid också specifik montering för att täta proteinlösningen i dialysmembranet placerat över knappkammaren, vilket illustreras i figur 1. Dessutom är luftbubblor som fångas mellan dialysmembranet och proteinlösningen ett vanligt problem som försämrar kristalltillväxten. En annan begränsning med metoden är provkraven, där mycket högre koncentrationer och volymer är nödvändiga jämfört med ångdiffusionsmetoder, för att rymma dialysknapparna. Därför har kristallisering med mikrodialysknappar uppfattats som en oattraktiv metod, särskilt för svåra mål som membranproteiner, vars reningsutbyte är frustrerande lågt. Nyligen har mikrofluidiska enheter utvecklats för att underlätta proteinkristallisation genom dialys15. Dessa chips har också utformats för att ha hög röntgentransparens med låg bakgrund, vilket gör att chipsen kan användas för datainsamling in situ vid rumstemperatur, vilket eliminerar besväret med skörd och kryokylning av kristaller. Trots dessa framsteg är tillvägagångssättet fortfarande mycket lågt genomströmning och dyrt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig01.jpg"> Figur 1: Schematisk representation av kristallisation genom dialys med dialysknappar. (A) Schematisk representation av en kristallisationsdialysknapp. (B) Proteinlösningen tillsätts till mikrodialysknappkammaren. (C) Dialysmembranet hålls fast vid mikrodialysknappen med hjälp av en gummiring (O-ring) som appliceras via en applikator. (D) Dialysknappen är klar att sänkas ned i behållaren som innehåller kristallisationslösningen (dialyslösningen), såsom visas i (E). Injektionsflaskan med den nedsänkta dialysknappen måste förseglas för att undvika avdunstning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Här presenteras ett enkelt protokoll för screening av proteinkristallisationsförhållanden och kristalltillväxt med hjälp av dialysplattan med 96 brunnar med hög genomströmning. Dessa engångsplattor är utformade för att användas på samma sätt som ångdiffusionskristallisationsplattorna (pipett sedan tätning), som visas i figur 2. Plattorna rymmer upp till 3,2 μL protein och 350 μL dialyslösning. Varje brunn har ett separat regenererat cellulosamembran för att förhindra korskontaminering mellan brunnarna. Installationen tar cirka 10 minuter att slutföra och kräver ingen specialutrustning förutom vad som finns i alla standardkristallisationslaboratorier. Fyra olika proteiner, inklusive två membranproteiner, används för att demonstrera och validera detta tillvägagångssätt som en effektiv metod för proteinkristallografi med hög genomströmning (HTP).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig02.jpg"> Figur 2: Arbetsflöde för kristallisation med mikrodialysplattan. (A) Avlägsnande av den röda självhäftande "täckfilmen". (B) Dispensering av proteindropparna i var och en av droppbrunnarna. (C) Brunnarna är täckta med UV-"täckfilmen". (D) Plattan är inverterad för att tillsätta dialyslösningarna (eller kristallisationsskärmen). E) Plattan förseglas och inkuberas. (F,G) Mikroskopinspektion av dropparna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Användningen av denna kristallisation genom dialysprotokoll demonstrerades med hjälp av dialysatorröret på 0,5 ml (figur 3) för storskalig (hundratals till tusentals) produktion av mikrokristaller, lämplig för toppmoderna datainsamlingsmetoder såsom seriell kristallografi vid båda XFEL-anläggningarna 20,21,22,23,24 och synkrotroner25,26,27 , liksom för MicroED28,29,30-metoder.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig03.jpg"> Figur 3: Storskalig mikrodialyskristallisation med dialysatorröret . (A) Schematisk representation av dialysatorröret på 0,5 ml. b) Sidovy av en bägare som innehåller kristallisationslösningen och det flytande rörstället som håller ett dialysatorrör. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0620</td>
			<td>For aliquoting protein solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>17823----------K</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate filters. For filtering dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSTF04700</td>
			<td>Membrane filters for filtering large volumes of buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 0.5 &#8211; 10 &#181;L Research plus pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000028</td>
			<td>For dispensing protein drops onto the Diaplate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel, variable 30 &#8211; 300 &#181;L Eppendorf Research plus pipette&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000060</td>
			<td>For dispensing dialysis solutions on the Diaplate reservoirs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15889152</td>
			<td>For use with syringe filters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2.2 mL deep-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0788</td>
			<td>Polypropylene deep-well storage plates; for preparing screens using the Hamilton Microlab STARlet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000565</td>
			<td>With rotor FA-24x2 with a maximum g-force of 21,300 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diacon dialyser</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W72010</td>
			<td>Dialyzer tubes with a regenerated cellulose membrane with a molecular weight cut-off of 10 kDa. Ideal for protein solutions of up to 0.5 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaplate 96-well plate</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>W82010</td>
			<td>Microdialysis plate. The Diaplate consists of two sides with a regenerated cellulose membrane in-between with a molecular weight cut-off of 10 kDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For holding dialysis solutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating rack</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diacon kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor-standing vibration-free incubator</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD5-01</td>
			<td>400 L temperature-controlled incubator set to 20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 C stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Planapo 1.0x objective, 7.8x &#8211; 160x zoom range with DMC 4500 camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memgold2</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD1-64</td>
			<td>Sparse-matrix screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlab STARlet</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoir cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable bottle top filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>DS0320-5045</td>
			<td>For fitering large volumes of buffers, for use with 0.22 &#181;m membrane filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing paddle</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Lyophilized protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV cover film</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Included in the Diaplate kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput protein crystallization via microdialysis

Att förstå struktur-funktionsförhållandena hos makromolekyler, såsom proteiner, på molekylär nivå är avgörande för biomedicin och modern läkemedelsupptäckt. Hittills är röntgenkristallografi fortfarande den mest framgångsrika metoden för att lösa tredimensionella proteinstrukturer vid atomupplösning. Med de senaste framstegen inom seriell kristallografi, antingen med hjälp av röntgenfrielektronlasrar (XFEL) eller synkrotronljuskällor, har proteinkristallografi utvecklats till nästa gräns, där förmågan att förvärva tidsupplösta data ger viktiga mekanistiska insikter i beteendet hos biologiska molekyler vid rumstemperatur. Detta protokoll beskriver ett enkelt arbetsflöde med hög genomströmning (HTP) för screeningkristallisationsförhållanden genom användning av en dialysplatta med 96 brunnar. Dessa plattor följer Society for Biomolecular Screening (SBS) standard och kan enkelt ställas in med hjälp av något standardkristallisationslaboratorium. När optimala förhållanden har identifierats kan stora mängder kristaller (hundratals mikrokristaller) produceras med hjälp av dialysatorn. För att validera robustheten och mångsidigheten hos detta tillvägagångssätt kristalliserades fyra olika proteiner, inklusive två membranproteiner.

Fyra proteiner kristalliserades med hjälp av mikrodialysplattan (med 10 kDa MWCO-membran), inklusive två membranproteiner. Det kycklingäggvita lysozymet från det frystorkade pulvret (se materialförteckning) framställdes vid 50 mg.mL-1 i 20 mM NaOAc (pH 4,5) och det frystorkade thaumatinet (se materialtabell) löstes i vatten till en slutlig koncentration av 25 mg.mL-1. De två membranproteinerna som användes i denna studie var E. coli multidrug efflux pump AcrB och E. coli laktostransportör LacY. AcrB uttrycktes med C43 (DE3) celler och renades med Ni-NTA-affinitetskromatografi och storleksuteslutningskromatografi i 10 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl, 0,03% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) och 5% (v/v) glycerol32. Därefter koncentrerades proteinet med användning av en 100 kDa MWCO centrifugalkoncentrator till en slutlig koncentration av 6 mg.mL-1. LacY uttrycktes också i C43 (DE3) celler, renades med Ni-sefafarosaffinitetskromatografi följt av storleksuteslutningskromatografi i 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,03% (w/v) DDM och koncentrerades med en 100 kDa MWCO-koncentrator till 10 mg.mL-1 4,33.
För lysozym- och thaumatinproteinerna fylldes mikrodialysplattan med 96 brunnar med en kristallisationsgaller som förbereddes internt som dialyslösning, medan för membranproteinet AcrB framställdes en gallerskärm internt från ett tidigare publicerat kristallisationstillstånd34. För LacY hittades initiala träffförhållanden från en kommersiell skärm (se materialförteckning) och optimerades ytterligare med en nätskärm tillverkad internt. Kristallisationsdroppförhållandet för lysozym, thaumatin och AcrB var 1:100, med 2 μL protein till 200 μL fällningsmedel (dialyslösning). LacY-kristallisationsdroppar var också i förhållandet 1:100, med 1 μL protein till 100 μL dialyslösning, på grund av en lägre mängd tillgängligt protein.
Kristaller från alla fyra proteinerna, inklusive membranproteinerna, började dyka upp mellan 1-8 timmar vid 20 °C efter installation med mikrodialysplattan. I detta fall var det inte nödvändigt att komplettera dialyslösningen med tvättmedel för membranproteinkristallisationen, vilket vanligtvis görs under standarddialysprocessen för att förhindra membranproteinaggregering, eftersom tvättmedelsmiceller förväntades vara större än MWCO för dialysmembranen35.
Efter den framgångsrika kristalliseringen av proteinerna på mikrodialysplattan (figur 4) noterades kristallisationsförhållanden och storskalig kristallisation genom dialys utfördes med användning av dialysatorröret med samma 10 kDa MWCO-dialysmembran. Tusentals mikrokristaller för vart och ett av de enskilda proteinerna växte inuti dialysatorn, som visas i figur 5. För taumatinkristallisation laddades 250 μL protein på dialysatorn och dialyserades mot 50 ml (1:200-förhållande). För AcrB dialyserades 250 μl protein mot 25 ml dialyslösning (1:100). LacY-kristallisation sattes också upp i samma förhållande med 100 μL protein till 10 ml dialyslösning.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig04.jpg"> Figur 4: Kristaller odlas genom dialys med hjälp av mikrodialysplattan. Protokollet visar tillämpligheten av installationen med lösliga proteiner: (A) Lysozym dialyserades mot 0,1 M NaOAc (pH 4,0), 0,5 M NaCl och 25% (v / v) glycerol. (B) Thaumatin dialyserades mot 0,1 M Bis-tris-propan (pH 6,6), 1 M K/Na-tartrat och 18 % (v/v) etylenglykol. Kristaller erhölls också för membranproteiner: (C) AcrB dialyserades mot 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl och 20% (v/v) PEG-400. (D) LacY dialyserades mot 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl och 32 % (v/v) PEG-300. Bilderna togs med hjälp av ett stereomikroskop med hög förstoring och en korspolarisator. Skalstänger: (A,B,D) = 1 mm; (C) = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig05.jpg"> Figur 5: Representativa bilder av membranproteinkristaller odlade genom dialys med dialysatorröret. (A) Bild som visar röret fullt av mikrokristaller (indikeras med den svarta pilen). (B) Mikroskopisk bild av 2 μL från en uppslamning av thaumatinkristaller odlade genom dialys med användning av dialysatorröret 0,5 ml, dialyserat mot 0,1 M Bis-Tris-propan (pH 6,6), 1,4 M K/Na-tartrat och 18 % (v/v) etylenglykol. (C) Mörkfältsbilder (vänster) och ljusfält (höger) av AcrB-mikrokristaller odlade genom dialys mot 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl och 20% (v/v) PEG-400. (D) Mörkfältsbilder (vänster) och ljusfält (höger) av LacY-mikrokristaller odlade genom dialys mot 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl och 32% (v/v) PEG-300. Vissa fällningar observeras. Skalstapeler: (B,D) = 200 μm; (C) = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis at JoVE.com

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Det presenterade protokollet beskriver ett enkelt tillvägagångssätt för screening av proteinkristallisationsförhållanden och kristalltillväxt med hjälp av en dialysplatta med 96 brunnar med hög genomströmning. Användningen av dialysatorrör för storskalig tillväxt av mikrokristaller demonstreras också för seriell kristallografi och MicroED-applikationer.

Proteinkristallisation med hög kapacitet via mikrodialys

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

Kristallisation genom dialys är en underutnyttjad metod. Detta protokoll presenterar ett Novo-tillvägagångssätt för detta, vilket kommer att öka utbudet av kristalliseringsstrategier som för närvarande är tillgängliga för strukturerad bestämning. De främsta fördelarna med denna teknik är att den är hög genomströmning, enkel att installera utan specialutrustning krävs och möjliggör enkel övervakning av kristalltillväxt.Individen som utför denna teknik måste vara bekväm med pipettering med låg volym och använda flerkanaliga pipetter. Dropparna måste pipetteras så tillräckligt som möjligt för att förhindra partiell uttorkning. För att ställa in mikrodialysexperimentet, placera en kommersiellt tillgänglig 96-brunns mikrodialysplatta i proteinsidan uppåt orientering och ta bort tejpen genom att skala bort 200 mikron tryckhäftande distans.Efter avskalning av tejpen, notera positionen för brunn A1. Använd sedan en flerkanalig pipett och ladda maximalt 3,2 mikroliter korrekt förberedt proteinprov i varje brunn. Placera UV-täckfilmen på 200 mikron korrekt över 96-brunnsplattan med filmen uppåt. För att aktivera och täta trycklimet, tryck sedan ner UV-skyddsfilmen med en tätningspaddel och kontrollera dess integritet.Vänd nu plattan för att få den till buffertsidan uppåt och notera den speglade positionen för den markerade brunnen A1. Använd en flerkanalig pipett och fyll på maximalt 350 mikroliter av dialyslösningen i varje brunn på plattan och försegla försiktigt brunnarna med behållarens lockfilm. Placera sedan plattan i buffertsidans uppåtorientering inuti en lämplig temperaturkontrollerad inkubator vid 20 grader Celsius för att möjliggöra kristalltillväxt. För att undersöka kristallbildning under mikroskopet, ta bort skyddsfilmen från 200 mikron UV-täckfilmen och placera plattan under okularet med proteinsidan uppåt.För att skapa ett storskaligt kristallisationsexperiment, anta de förhållanden under vilka mikrokristalltillväxt inträffade i mikrodialysplattan och replikera samma förhållanden i stora behållare. Välj behållarens storlek beroende på dialyslösningens volym. Pipettera en maximal volym på 500 mikroliter proteinprov i dialysatorröret innan röret förseglas med det röda plastlocket.Placera det förseglade dialysatorröret på 500 mikroliter i det flytande stället inuti behållaren fylld med dialyslösning. Placera sedan behållaren ostörd inuti en lämplig temperaturkontrollerad inkubator vid 20 grader Celsius för att uppnå kristalltillväxt. För att kontrollera bildandet av kristaller, pipettera en till två mikroliter av lösningen från dialysatorn till ett glaslockglas.Täck lösningen på bilden med en annan glasskiva och se den under ett mikroskop. Bilder tagna med hjälp av ett stereomikroskop med hög förstoring visade framgångsrik mikrokristallbildning av fyra proteiner med användning av mikrodialysplattorna med 10 kilodalton molekylviktsmembran. Lysozym befanns bilda kristaller när det dialyserades mot 0,1 molar natriumacetat vid pH 4 innehållande lämpliga tillsatser.Domatin bildade kristaller när de dialyserades mot 0,1 molar bis-tris-propan vid pH 6,6 innehållande lämpliga tillsatser. Optimerade dialysförhållanden ledde till mikrokristallbildning av membranproteinerna, nämligen E. coli multidrug efflux pump protein AcrB och E. coli laktostransportör LacY. Storskalig kristallisation i dialysatorrören som använde de optimerade dialysförhållandena som erhölls från mikrodialysexperimenten ledde till bildandet av tusentals mikrokristaller för vart och ett av proteinerna.För kristallisation av fomitin dialyserades 250 mikroliter protein mot 50 ml av dialyslösningen. För AcrB dialyserades 250 mikroliter av proteinet mot 25 mikroliter dialyslösning. LacY-kristallisationen sattes också upp i samma förhållande, med 100 mikroliter protein till 10 ml dialyslösning.Vid invertering av plattan till buffertsidan uppåt är det viktigt att notera positionen för A1, så att lösningar från kristallisationsskärmen kan dispenseras i enlighet därmed. Kristallerna erhållna från denna metod kan användas för nedströms applikationer, såsom seriell kristallografi och mikro ED.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produktion, Kristallisering och strukturbestämning av<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-en via Microseeding och zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Hög genomströmning, absolut bestämning av halten av ett Protein som är valda på vävnad nivåer med hjälp av kvantitativa Dot Blot analys (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellulära Protein Mikroarrayteknik för hög genomströmning upptäckt av låg affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisk screening och karakterisering av Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex för framgångsrik kristallisering

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Ett ekonomiskt och mångsidigt proteinreningssystem med hög genomströmning med en plattadapter med flera kolumner

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

En "dual-addition" kalciumfluorescensanalys för screening med hög genomströmning av rekombinanta G-proteinkopplade receptorer

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

High-throughput screening för att erhålla kristallträffar för proteinkristallografi

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Bildbaserad kvantifiering av mitokondriell DNA-syntes och distribution med hög kapacitet

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...