Name: measuring caspase activity using a fluorometric assay or flow cytometry
Uploaded: 2023-03-24T13:55:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry at JoVE.com

W.W.W. को क्लोएटा मेडिकल रिसर्च फेलो अनुदान द्वारा समर्थित किया जाता है, एसआर को CanDoc UZH Forschungskredit द्वारा समर्थित किया जाता है, और J.T. को चीनी छात्रवृत्ति परिषद द्वारा समर्थित किया जाता है।

<ol>
	<li>Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+caspase+mechanisms.">A primer on caspase mechanisms.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).</li><li>Nicholson, D. W., Thornberry, N. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+of+bone+marrow-derived+macrophages+to+apoptosis+is+associated+with+the+expression+of+X-linked+inhibitor+of+apoptosis+protein+in+primary+cultures+of+bone+marrow+cells.">Resistance of bone marrow-derived macrophages to apoptosis is associated with the expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein in primary cultures of bone marrow cells.</a> Biochemical Journal. 353 (Pt 2), 299-306 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activity+assay+buffer.">Caspase activity assay buffer.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2015).</li><li>Mackridge, A., Rowe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-way+analysis+of+variance+(ANOVA)+-+Including+Dunnett's+and+Tukey's+follow+up+tests.">One-way analysis of variance (ANOVA) - Including Dunnett's and Tukey's follow up tests.</a> Practical Approach to Using Statistics in Health Research: From Planning to Reporting. , 93-103 (2018).</li><li>Chen, H., Ning, X., Jiang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+control+antiviral+innate+immunity.">Caspases control antiviral innate immunity.</a> Cellular and Molecular Immunology. 14 (9), 736-747 (2017).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

इस विधि में, कैसपेज़ -3 / कैसपेज़ -7 गतिविधि को मापने के लिए जनसंख्या-आधारित परख या एकल-सेल विश्लेषण में एक फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट का उपयोग किया जाता है। दोनों विधियां एक सब्सट्रेट के दरार के आधार पर मात्रात्मक तरीके से कैसपेज़ गतिविधि को मापती हैं। एक लाभ कई नमूनों के लिए इन तरीकों का उपयोग करने की क्षमता है। इन विधियों के साथ, कैस्पेज़ -3 / कैसपेज़ -7 गतिविधि का पता प्राथमिक मैक्रोफेज में लगाया जाता है जो स्मैक मिमेटिक्स के साथ इलाज किया जाता है।
जनसंख्या-आधारित फ्लोरोमेट्रिक परख का एक महत्वपूर्ण पहलू लाइसिस से प्रतिदीप्ति को पढ़ने का समय है। नमूने को पूरी प्रक्रिया में बर्फ पर रखा जाना चाहिए, खासकर परख को "पढ़ने" से पहले। यह सब्सट्रेट के समय से पहले दरार और प्रतिदीप्ति को रोकता है। जनसंख्या-आधारित परख का उपयोग करके, कम अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। परख में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन की मात्रा सामान्यीकृत है, जिससे नमूनों की सीधे तुलना की जा सकती है। एक चेतावनी यह है कि एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु के अंतिम चरण में, कुल प्रोटीन की मात्रा कम हो जाती है; इसलिए, कैसपेज़ गतिविधि का पता लगाना संभव नहीं हो सकता है। इस समस्या को दरकिनार करने के लिए विभिन्न कैनेटीक्स या विभिन्न उपचार खुराक की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, इस विधि में वर्णित सॉफ़्टवेयर के अलावा कैस्पेस गतिविधि की दर का सही आकलन करने के लिए अन्य सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है। 
प्रवाह साइटोमेट्रिक परख के लिए, आबादी को आत्मविश्वास से गेट करने के लिए पर्याप्त घटनाओं या कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, सब्सट्रेट से सेल नंबर के इष्टतम अनुपात को प्राप्त करने के लिए प्रवाह-आधारित परख में अधिक अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। हालांकि, फ्लो साइटोमेट्री के साथ, यह विधि अतिरिक्त मापदंडों को मापने के लिए खुद को उधार देती है, जैसे कि सेल प्रकार की पहचान के लिए सेल सतह मार्कर। 
जनसंख्या और एकल-कोशिका विधियों दोनों का उपयोग अन्य कैसपेस के लिए किया जा सकता है। हालांकि, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि मान्यता अनुक्रम अन्य कैसपेस के लिए कम भेदभाव किया जाता है। जैसे, कैस्पेस गतिविधि के लिए अन्य तरीकों का उपयोग किया जाना चाहिए। इसमें कैस्पेस गतिविधि का निषेध, सीआरआईएसपीआर या विशिष्ट कैसपेस का नॉक-डाउन, और ज्ञात सब्सट्रेट्स की दरार का पता लगाने के लिए पश्चिमी सोख्ता शामिल हैं। 
कैसपेज़ गतिविधि का पता लगाने के लिए एक वैकल्पिक विधि टाइम-लैप्स इमेजिंग है। सेल मृत्यु के कैनेटीक्स पर जानकारी प्रदान करने के लिए एनेक्सिन वी जैसे व्यवहार्यता के अन्य मार्करों के साथ एक ही पारगम्य कैसपेस सब्सट्रेट का उपयोग किया जा सकता है। इमेजिंग कैस्पेस गतिविधि और सेल अस्तित्व को भी अलग करेगी, जिससे सेल आबादी में कैसपेस गतिविधि की उप-घातक मात्रा का पता लगाने की अनुमति मिलेगी। कैसपेज़ -3 / कैसपेज़ -7 के गैर-घातक कार्य जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं29 में एंटीवायरल विनियमन से जुड़े हुए हैं, विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए रिलीज15,16 के माध्यम से टाइप आई आईएफएन की सक्रियता। इस प्रकार, कैस्पेज़ गतिविधि को मापने के लिए ये परख कोशिका मृत्यु के विभिन्न तरीकों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं और गैर-कोशिका मृत्यु कार्यों का आकलन करने में उपयोगी हो सकते हैं।

कैसपेस प्रोग्राम्ड सेल डेथ के कई रूपों में शामिल हैं। एपोप्टोसिस प्रोग्राम्ड सेल डेथ का सबसे अधिक अध्ययन किया गया रूप है और कैसपेज़ गतिविधि1 से जुड़ा हुआ है। सभी कैसपेस में एक बड़ा और छोटा उत्प्रेरक सबयूनिट होता है। कैसपेज़ -1, कैसपेज़ -4, कैसपेज़ -5, कैसपेज़ -9, और कैसपेज़ -11 में एक कैसपेज़ सक्रियण और भर्ती डोमेन (CARD) होता है, और कैसपेज़ -8 और कैस्पेज़ -10 में डेथ एफेक्टर डोमेन (DED)2,3,4,5 (तालिका 1) होते हैं। एपोप्टोसिस को दो प्रमुख मार्गों द्वारा शुरू किया जा सकता है: बाह्य मार्ग और आंतरिक मार्ग। बाह्य एपोप्टोटिक मार्ग मृत्यु रिसेप्टर्स द्वारा ट्रिगर किया जाता है, जो ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर सुपरफैमिली (टीएनएफएसएफ) का हिस्सा हैं। डेथ रिसेप्टर्स में डीईडी डोमेन होते हैं, जो कैसपेज़ -8 गतिविधि 6 की सुविधा प्रदान करतेहैं। आंतरिक एपोप्टोटिक मार्ग में एपोप्टोसोम के गठन के बाद कैसपेज़ -9 की सक्रियता शामिल है, जिसमें साइटोक्रोम सी और एपफ -1 7 की रिहाई की आवश्यकता होतीहै। या तो आरंभकर्ता कैस्पेज़, कैस्पेज़ -8 या कैसपेज़ -9 की सक्रियता, निष्पादनकर्ता कैसपेज़ के दरार और बाद में सक्रियण की ओर ले जाती है, जो कैसपेज़ -3, कैसपेज़ -6 और कैसपेज़ -7 हैं। यह पहचानना कि निष्पादक कैसपेस सक्रिय हैं, इंगित करता है कि कोशिकाएं एपोप्टोसिस से गुजर रही हैं, और इस सक्रियण को कोशिका मृत्यु के मोड को परिभाषित करने में एक महत्वपूर्ण कारक माना जाता है।
कैस्पेज़ सक्रियण सूजन को विनियमित करने और क्रमादेशित कोशिका मृत्यु के वैकल्पिक रूपों के प्रेरण के लिए एक महत्वपूर्ण मोड़ भी है। उदाहरण के लिए, कैसपेज़ -1 सक्रियण इंटरल्यूकिन -1 परिवार 8 के प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स की परिपक्वता की ओर जाताहै। इस परिवार से साइटोकिन्स की रिहाई और सक्रियण, विशेष रूप से आईएल -1 और आईएल -18, प्लाज्मा झिल्ली 9,10 पर गैसडर्मिन डी दरार और छिद्र गठन के परिणामस्वरूप होता है। गैसडर्मिन डी छिद्रों की अपर्याप्त झिल्ली की मरम्मत के परिणामस्वरूप एक प्रकार की कोशिका मृत्यु हो सकती है जिसेपाइरोप्टोसिस 11 के रूप में जाना जाता है। इसके अलावा, कैसपेज़ -8 गतिविधि के परिणामस्वरूप एक कैसपेज़-स्वतंत्र कोशिका मृत्यु का निषेध होता है जिसे नेक्रोप्टोसिस12 के रूप में जाना जाता है। रिसेप्टर-इंटरैक्टिंग सेरीन /थ्रेओनिन प्रोटीन काइनेज 1 (RIPK1) नेक्रोप्टोसिस में महत्वपूर्ण कारकों में से एक है और NF-kB द्वारा विनियमित सूजन को चलाने में है। मॉडल से पता चला है कि RIPK1 को कैसपेज़ -8 द्वारा छोड़ दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप NF-kB सिग्नलिंग, एपोप्टोसिस और नेक्रोप्टोसिस13,14 सीमित होते हैं। इसलिए, विभिन्न कैसपेस की गतिविधि की पहचान करने से परिणामस्वरूप सूजन और कोशिका मृत्यु पद्धति को समझने में सहायता मिल सकती है।
कोशिका मृत्यु के तौर-तरीकों को विनियमित करने में कैसपेस के कार्य से स्वतंत्र, कैसपेज़ गतिविधि संक्रमण15,16 के जवाब में इंटरफेरॉन (आईएफएन) जैसे अन्य साइटोकिन परिवारों को भी विनियमित कर सकती है। इसके अतिरिक्त, कैसपेस गैर-कोशिका मृत्यु कार्यों में शामिल हैं, जिसमें सेल भाग्य निर्णय, ऊतक की मरम्मत और पुनर्जनन, डीएनए मरम्मत के माध्यम से ट्यूमरजेनिसिस और न्यूरोनल सिनैप्स फ़ंक्शन शामिल हैं। इन गैर-घातक भूमिकाओं में कैसपेस की गतिविधि को सेलुलर स्थानीयकरण और कैसपेस की मात्रा से सीमित माना जाता है। इसलिए, कैसपेज़ गतिविधि के स्तर को निर्धारित करना अच्छी तरह से परिभाषित कर सकता है कि क्या एक कोशिका कोशिका मृत्यु से गुजरती है या क्या कैसपेज़ गैर-कोशिका मृत्यु समारोह 4,17,18 में भूमिका निभाता है।
कैसपेस गतिविधि का मूल्यांकन कई तरीकों से किया जा सकता है। क्लीवर कैसपेस और उनके सब्सट्रेट्स के लिए पश्चिमी सोख्ता का उपयोग गतिविधि के संकेतक के रूप में किया गया है, लेकिन ये परख सबसे अच्छा गुणात्मक हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या कैसपेस गतिविधि कोशिका मृत्यु से जुड़ी है, एक मात्रात्मक माप आदर्श है। चूंकि कैस्पेस चार अमीनो एसिड, कलरमेट्रिक, ल्यूमिनेसेंस या फ्लोरोमेट्रिक विधियों से युक्त एक मान्यता स्थल पर सब्सट्रेट्स को छोड़ देते हैं। हालांकि, कैसपेस में उनके सब्सट्रेट मान्यता19,20 में प्लास्टिसिटी दिखाई देती है। मान्यता अनुक्रम प्रोटीन डोमेन (तालिका 1) से जुड़ा नहीं है। टेट्रापेप्टाइड अनुक्रम डीईवीडी, हालांकि, कैसपेज़ -3 और कैसपेज़ -7 गतिविधि20,21 का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
स्मैक मिमेटिक्स एपोप्टोसिस प्रोटीन (आईएपी) के अवरोधकों को लक्षित करने वाले यौगिक हैं। कैंसर कोशिकाओं के उप-समूह में स्मैक मिमेटिक्स का उपयोग कोशिकाओं को टीएनएफ-प्रेरित कोशिका मृत्यु के प्रति संवेदनशील होने का कारण बनताहै। प्राथमिक मैक्रोफेज में, स्मैक मिमेटिक्स टीएनएफ23,24 के बहिर्जात जोड़ के बिना कोशिका मृत्यु का कारण बनता है। स्मैक मिमेटिक-प्रेरित गिरावट द्वारा सीआईएपी 1 के नुकसान के परिणामस्वरूप टीएनएफ का उत्पादन होता है। यदि कैसपेस गतिविधि का पता लगाया जाता है, तो इसका मतलब है कि कोशिकाएं नेक्रोप्टोसिस से नहीं बल्कि एपोप्टोटिक तरीके से मर गईं। इस विधि में, कैसपेज़ -3 / कैसपेज़ -7 गतिविधि की पहचान करने के लिए क्लीवर डीईवीडी सब्सट्रेट का पता लगाने का उपयोग किया जाता है। एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु की पुष्टि करने के लिए आगे के प्रयोगपहले 24 प्रकाशित किए गए हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm Petri plates</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 degree incubator shaker</td>
			<td>IKA shaker KS 4000i</td>
			<td>97014-816</td>
			<td>distributed by VWR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ac-DEVD-AFC</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-260-032-M005</td>
			<td>Caspase-3 substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Fortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-glycerolphosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9422-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caspase-3 recombinant&#160;</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-201-059-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.11662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>31885023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>03685-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etoposide</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-13629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>26140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo</td>
			<td>Flowjo</td>
			<td></td>
			<td>A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging</td>
			<td>Immunochemistry Technologies</td>
			<td>935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>14-8983-80</td>
			<td>now a subsidiary of Thermoscientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Plex</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitors</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>P9070.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smac mimetic, Compound A</td>
			<td>Tetralogics</td>
			<td></td>
			<td>also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7920-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8010-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-15141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.07687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>A1285901</td>
			<td>In the protocol, it is listed as Trypsin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring caspase activity using a fluorometric assay or flow cytometry

सिस्टीन प्रोटीज की सक्रियता, जिसे कैसपेस के रूप में जाना जाता है, कोशिका मृत्यु के कई रूपों में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया बनी हुई है। कैसपेस एपोप्टोसिस के महत्वपूर्ण सर्जक और निष्पादनकर्ता हैं, जो क्रमादेशित कोशिका मृत्यु का सबसे अधिक अध्ययन किया गया रूप है। एपोप्टोसिस विकास प्रक्रियाओं के दौरान होता है और ऊतक होमियोस्टैसिस में एक आवश्यक घटना है। पाइरोप्टोसिस कोशिका मृत्यु का एक और रूप है जो कैसपेस का उपयोग करता है और सूजन के सक्रियण के माध्यम से प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय करने में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है, जिसके परिणामस्वरूप इंटरल्यूकिन -1 (आईएल -1) परिवार के सदस्यों की रिहाई होती है। कैसपेस गतिविधि का आकलन करने के लिए, लक्ष्य सब्सट्रेट्स का आकलन किया जा सकता है। हालांकि, एकल कोशिकाओं या निम्न-स्तरीय गतिविधि की जांच करते समय संवेदनशीलता एक मुद्दा हो सकता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि फ्लो साइटोमेट्री द्वारा जनसंख्या-आधारित परख या एकल-सेल परख के साथ एक फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट का उपयोग कैसे किया जा सकता है। उचित नियंत्रण के साथ, विभिन्न अमीनो एसिड अनुक्रमों का उपयोग यह पहचानने के लिए किया जा सकता है कि कौन से कैसपेस सक्रिय हैं। इन परखों का उपयोग करके, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (टीएनएफ) उत्तेजना पर एपोप्टोसिस प्रोटीन के अवरोधकों के एक साथ नुकसान की पहचान की गई है, जो मुख्य रूप से कोशिका मृत्यु के अन्य रूपों के बजाय मैक्रोफेज में एपोप्टोसिस को प्रेरित करता है।

प्राथमिक माउस मैक्रोफेज को 6 दिनों के लिए विभेदित किया गया था। 6 दिनों के बाद, कोशिकाओं को काटा गया, गिना गया और बीज दिया गया। निम्नलिखित उपचारों का उपयोग किया गया था: कोई उपचार नहीं और 250 एनएम पर स्मैक मिमेटिक (कंपाउंड ए) 22 और 16 घंटे के लिए 500 एनएम (चित्रा 1)। कैस्पेज़ -3 / कैसपेज़ -7 सक्रियण को जनसंख्या-आधारित परख या प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके एकल-कोशिका विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन करने की अनुमति देने के लिए डुप्लिकेट में प्रयोग किया गया था।
सेल लाइसेट की प्रोटीन एकाग्रता को बीसीए परख (पूरक तालिका 1) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। कैसपेज़ -3 / कैसपेज़ -7 गतिविधि परख में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन की मात्रा नमूनों के बीच समान है, यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। इस जनसंख्या-आधारित परख में, डेटा को दो तरीकों से प्रस्तुत किया जा सकता है। पहला समायोजित प्रतिदीप्ति (वाई-अक्ष) बनाम समय (एक्स-अक्ष) (चित्रा 2 ए) को प्लॉट करके कैनेटीक्स दिखाना है। वैकल्पिक रूप से, ढलान की गणना सीधे नमूनों की तुलना करने के लिए की जा सकती है (चित्रा 2 बी)। 500 एनएम एसएमएसी मिमेटिक उपचार पर ढलान में वृद्धि कई तुलनाओं के साथ एक साधारण एक-तरफ़ा एनोवा के आधार पर महत्वपूर्ण नहीं थी (डनेट का कई तुलना परीक्षण28)।
फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके कैसपेज़ -3 / कैसपेज़ -7 गतिविधि के विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं और सुपरनैटेंट की कटाई की गई थी। बिना दाग वाली कोशिकाओं या प्रतिदीप्ति माइनस एक को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, साथ ही अनुपचारित कोशिकाएं भी। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एकत्रित कोशिकाओं के एक हिस्टोग्राम ने अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में स्मैक मिमेटिक्स के साथ इलाज की गई कोशिकाओं के लिए प्रतिदीप्ति में बदलाव दिखाया (चित्रा 2 सी)। डेटा को या तो औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (चित्रा 2 डी) या अनुपचारित कोशिकाओं (चित्रा 2 ई) पर गुना परिवर्तन के रूप में दिखाया जा सकता है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64745/64745fig01.jpg"> चित्र 1: अध्ययन का प्रवाह चार्ट। (A) फीमर और टिबिया को C57Bl/6 चूहों से निकाला गया था। हड्डियों को 6 दिनों के लिए 20 एनजी / एमएल एम-सीएसएफ में फ्लश और विभेदित किया गया था। (बी) दिन 6 पर, मैक्रोफेज को काटा गया और उपचार के लिए फिर से सीड किया गया। कोशिकाओं के एक सेट को लाइसेट के लिए काटा गया था और फ्लोरोजेनिक गतिविधि द्वारा मूल्यांकन किया गया था, जबकि दूसरे सेट को काटा गया था, फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट के साथ इनक्यूबेट किया गया था, और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मूल्यांकन किया गया था। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64745/64745fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64745/64745fig02.jpg"> चित्रा 2: कैस्पेस -3/कैसपेज़ -7 गतिविधि के लिए काइनेटिक परख और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सब्सट्रेट क्लीवेज। (ए, बी) कैस्पेज़ -3/ कैसपेज़ -7 गतिविधि (सी-ई) और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सब्सट्रेट क्लीवेज के लिए गतिज परख का प्रतिनिधि डेटा। मैक्रोफेज को 16 घंटे के लिए स्मैक मिमेटिक (यौगिक ए; 250 एनएम और 500 एनएम) की दो सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। डेटा को नमूने में प्रोटीन एकाग्रता के लिए सामान्यीकृत किया गया था। (ख) प्रत्येक नमूने के लिए डीईवीडी एएफसी की दरार (ढलान) की दर को अनुपचारित ढलान पर सामान्यीकृत किया गया था और अनुपचारित कोशिकाओं पर गुना परिवर्तन के रूप में प्रस्तुत किया गया था। (सी) कैस्पेज़ -3 सब्सट्रेट के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं के फ्लो साइटोमेट्रिक हिस्टोग्राम। (D, E) अनुपचारित नमूने की तुलना में एमएफआई की तुलना और गुना परिवर्तन। प्रत्येक डेटा बिंदु एक स्वतंत्र नमूने का प्रतिनिधित्व करता है; माध्य ± माध्य की मानक त्रुटि दिखाई गई है; * पी < 0.05 एक तरफ़ा एनोवा और कई तुलना परीक्षणों (डंनेट के कई तुलना परीक्षण) का उपयोग करके। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64745/64745fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Caspase</td>
			<td>प्रजातियां</td>
			<td>सब्सट्रेट अनुक्रम</td>
			<td colspan="3">प्रोटीन डोमेन</td>
		</tr><tr><td>Caspase-1</td>
			<td>एचएस, एमएम</td>
			<td>(W/L) ईएचडी</td>
			<td colspan="3">CARD, बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन</td>
		</tr><tr><td>Caspase-2</td>
			<td>एचएस, एमएम</td>
			<td>DEXD</td>
			<td colspan="3">CARD, बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन</td>
		</tr><tr><td>कैसपेस -4</td>
			<td>एच एस</td>
			<td>(W/L) ईएचडी</td>
			<td colspan="3">CARD, बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन</td>
		</tr><tr><td>कैसपेस -5</td>
			<td>एच एस</td>
			<td>(W/L) ईएचडी</td>
			<td colspan="3">CARD, बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन</td>
		</tr><tr><td>कैसपेज़ -9</td>
			<td>एचएस, एमएम</td>
			<td>(I/V/L) E(H/T)D</td>
			<td colspan="3">CARD, बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन</td>
		</tr><tr><td>कैसपेज़ -11</td>
			<td>मिलीमीटर</td>
			<td>(W/L) ईएचडी</td>
			<td colspan="3">CARD, बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन</td>
		</tr><tr><td>कैसपेस -12</td>
			<td>मिलीमीटर</td>
			<td>ATAD</td>
			<td colspan="3">CARD, बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन</td>
		</tr><tr><td>Caspase-8</td>
			<td>एचएस, एमएम</td>
			<td>(I/V/L) E(H/T)D</td>
			<td colspan="3">DED, बड़ा डोमेन, छोटे उत्प्रेरक डोमेन</td>
		</tr><tr><td>Caspase-10</td>
			<td>एच एस</td>
			<td>(I/V/L) E(H/T)D</td>
			<td colspan="3">DED, बड़ा डोमेन, छोटे उत्प्रेरक डोमेन</td>
		</tr><tr><td>Caspase-3</td>
			<td>एचएस, एमएम</td>
			<td>DEXD</td>
			<td colspan="3">बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन</td>
		</tr><tr><td>कैसपेज़ -6</td>
			<td>एचएस, एमएम</td>
			<td>(I/V/L) E(H/T)D</td>
			<td colspan="3">बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन</td>
		</tr><tr><td>कैसपेज़ -7</td>
			<td>एचएस, एमएम</td>
			<td>DEXD</td>
			<td colspan="3">बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन</td>
		</tr><tr><td>कैसपेज़ -14</td>
			<td>hs, mm</td>
			<td>(W/L) ईएचडी</td>
			<td colspan="3">बड़ा डोमेन, छोटा उत्प्रेरक डोमेन</td>
		</tr><tr><td>कार्ड</td>
			<td colspan="5">कैसपेस सक्रियण और भर्ती डोमेन</td>
		</tr><tr><td>DED</td>
			<td colspan="5">मृत्यु प्रभावक डोमेन</td>
		</tr><tr><td>एच एस</td>
			<td colspan="5">homo sapien</td>
		</tr><tr><td>मिलीमीटर</td>
			<td colspan="5">मस्कुलस</td>
		</tr></tbody></table>तालिका 1: सब्सट्रेट विशिष्टता और कैसपेस के प्रोटीन डोमेन। तालिका मैकस्टे एट अल.20 से अनुकूलित है; शालिनी और अन्य 3; और वैन ऑपडेनबोश और लैमकान्फी4.
पूरक तालिका 1: डीईवीडी गतिज विश्लेषण। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64745/Supplementary%20Table%201.%20DEVD%20kinetic%20assay.xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

वर्तमान प्रोटोकॉल प्रवाह साइटोमेट्री या स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर का उपयोग करके फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट के माध्यम से कैसपेज़ गतिविधि को मापने के लिए दो तरीकों का वर्णन करता है।

फ्लोरोमेट्रिक परख या फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके कैस्पेज़ गतिविधि को मापना

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को यह पहचानने की अनुमति देता है कि क्या कैस्पेज़ गतिविधि कोशिका मृत्यु के साथ होती है, इस प्रकार कोशिका मृत्यु के विभिन्न तरीकों की पहचान करती है। इस तकनीक का लाभ जनसंख्या-आधारित परख या एकल कोशिका में कैसपेस गतिविधि का आकलन करने का लचीलापन है। प्रक्रिया का प्रदर्शन एक पीएचडी स्नातक स्टेफनी रुफली और वेंडी वेई-लिन वोंग की प्रयोगशाला से एक विजिटिंग पीएचडी छात्र जिंग टोंग करेंगे।पांडुलिपि में वर्णित अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज या बीएमडीएम को अलग करने और कटाई करने के बाद, उन्हें प्रति मिलीलीटर छठी कोशिकाओं के एक गुना 10 के घनत्व पर छह-वेल प्लेट में बीज दें। 16 घंटे के लिए एसएमएसी मिमेटिक के साथ कोशिकाओं का इलाज करें। सेल लाइसेट तैयार करने के लिए, बर्फ पर उपचारित कोशिकाओं वाली प्लेट को स्थानांतरित करें और सेल कल्चर माध्यम को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा करें।चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 300 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। माध्यम को एस्पिरेट करें और ट्यूब को बर्फ पर रखें। फिर कोशिकाओं को धोने के लिए सेल कल्चर प्लेट में एक मिलीलीटर ठंडा पीबीएस जोड़ें।सभी पीबीएस को एस्पिरेट करने के बाद, कोशिकाओं में ट्रिप्सिन के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। एक बार जब कोशिकाएं प्लेट से अलग हो जाती हैं, तो उन्हें 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा करें। सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करने के बाद, सुपरनैटेंट को हटा दें और 100 माइक्रोलीटर डिस्क लाइसिस बफर में गोली को फिर से निलंबित करें।नमूने को 20 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें और फिर अघुलनशील अंश को पेलेट करने के लिए लाइसेट को सेंट्रीफ्यूज करें। कैसपेज़ -3/7 गतिविधि परख के लिए एक सफेद फ्लैट-बॉटम 96-वेल प्लेट में लाइसेट के 25 माइक्रोलीटर और बिसिंकोनिक एसिड या बीसीए परख के लिए पारदर्शी फ्लैट-बॉटम 96-वेल प्लेट में 10 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें। प्रोटीन परिमाणीकरण के लिए, एक मानक प्रोटीन के रूप में गोजातीय सीरम एल्बुमिन या बीएसए सांद्रता की एक श्रृंखला तैयार करें।एक बार मानक बीएसए को नमूने वाले फ्लैट-बॉटम 96-वेल प्लेट में जोड़ा जाता है, तो बीसीए अभिकर्मकों को 50 से एक के अनुपात में एक और दो मिलाएं और मानक में प्रत्येक नमूने में इसके 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के बाद, फ्लोरोमेट्रिक उपकरण पर 562 नैनोमीटर पर अवशोषण को मापें और मानक वक्र के साथ प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें। जनसंख्या आधारित परख करने के लिए, फ्लोरोमेट्रिक उपकरण शुरू करें और मशीन को 30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य को क्रमशः 360 और 465 नैनोमीटर पर सेट करें। फिर कैसपेस गतिविधि को निर्धारित करने के लिए पांडुलिपि में वर्णित बर्फ पर एक मास्टर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें। 100 माइक्रोलीटर की कुल प्रतिक्रिया मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रत्येक नमूने और मानक में मिश्रण के 75 माइक्रोलीटर जोड़ें।फ्लोरोमेट्रिक उपकरण सेटअप का उपयोग करके फ्लोरेसेंस को तुरंत मापें और प्रतिक्रिया कैनेटीक्स निर्धारित करने के लिए 40 मिनट के लिए हर मिनट व्यक्तिगत रीडिंग रिकॉर्ड करें। बीज बोने के बाद, अनुयायी कोशिकाओं को काटें जैसा कि पहले पांच मिलीलीटर पॉलीस्टाइनिन ट्यूब में दिखाया गया था। फिर नमूने को 300 ग्राम पर चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को हटा दें।धुंधला मिश्रण तैयार करने के लिए, फ्लोरोजेनिक सब्सट्रेट का एक माइक्रोलीटर लें और इसे पीबीएस के 150 माइक्रोलीटर के साथ पतला करें। प्रति नमूने 50 माइक्रोलीटर धुंधला मिश्रण जोड़ें, इसे 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें और हर 15 मिनट में मिलाएं। इस जनसंख्या-आधारित परख में, कैस्पेज़ -3/7 गतिविधि के लिए गतिज परख के प्रतिनिधि डेटा ने एसएमएसी मिमेटिक एकाग्रता में वृद्धि के साथ सब्सट्रेट दरार में वृद्धि दिखाई।हालांकि, 500 नैनोमोलर एकाग्रता में वृद्धि कई तुलनाओं के साथ एक साधारण एक-तरफ़ा एनोवा के आधार पर महत्वहीन थी। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके कैसपेज़ -3/7 गतिविधि के विश्लेषण ने अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में एसएमएसी मिमेटिक्स के साथ इलाज की गई कोशिकाओं के लिए प्रतिदीप्ति में बदलाव का संकेत दिया, जो प्लॉटेड औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता में भी स्पष्ट था और 500 नैनोमोलर एकाग्रता में वृद्धि महत्वपूर्ण थी। प्रक्रिया बर्फ पर की जानी चाहिए।हालांकि, जनसंख्या-आधारित परख में, नमूने अनिश्चित काल तक बर्फ पर नहीं छोड़ा जा सकता है। लाइसिस चरण के बाद, नमूनों को तुरंत संसाधित या जमे हुए किया जाना चाहिए। लाइव सेल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कैसपेज़ गतिविधि की इमेजिंग एकल सेल स्तर पर गतिज जानकारी प्राप्त करने के लिए एक अतिरिक्त तरीका होगा।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Phospholipid Scramblase गतिविधि का एक प्रतिदीप्ति आधारित परख

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Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

बैक्टीरियल Histidine Kinase Autophosphorylation की मात्रा एक nitrocellulose बाध्यकारी परख का उपयोग

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि परख का उपयोग कर के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट लेबल डीएनए visualized द्वारा Acrylamide जेल ट्रो

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Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

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Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

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An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

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एक इन विट्रो परख tRNA-Isopentenyl ट्रांस्फ़्रेज़ गतिविधि का पता लगाने के लिए

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Proteolytic गतिविधि के लिए स्क्रीन करने के लिए एक Fluorogenic पेप्टाइड दरार परख: कोरोनावायरस कील प्रोटीन सक्रियण के लिए आवेदन

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

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ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में सिट्रेट सिंथासे गतिविधि का एक कोलोरीमेट्रिक परख

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

न्यूक्लिक एसिड जांच का उपयोग कर न्यूक्लीज गतिविधि का काइनेटिक स्क्रीनिंग

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

एंजाइम लक्षण वर्णन से उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग तक एपोलिपोप्रोटीन एन-एसाइलट्रांसफेरेज़ के लिए क्लिक-रसायन विज्ञान आधारित फ्लोरोमेट्रिक परख

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...