Name: measuring caspase activity using a fluorometric assay or flow cytometry
Uploaded: 2023-03-24T13:55:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry at JoVE.com

W.W.W. поддерживается грантом Clöetta Medical Research Fellow, S.R. поддерживается CanDoc UZH Forschungskredit, а J.T. поддерживается Китайским советом по стипендиям.

<ol>
	<li>Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+caspase+mechanisms.">A primer on caspase mechanisms.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).</li><li>Nicholson, D. W., Thornberry, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases:+Killer+proteases.">Caspases: Killer proteases.</a> Trends in Biochemical Sciences. 22 (8), 299-306 (1997).</li><li>Shalini, S., Dorstyn, L., Dawar, S., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old,+new+and+emerging+functions+of+caspases.">Old, new and emerging functions of caspases.</a> Cell Death and Differentiation. 22 (4), 526-539 (2014).</li><li>Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+in+cell+death,+inflammation,+and+disease.">Caspases in cell death, inflammation, and disease.</a> Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).</li><li>Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+in+cell+death,+inflammation,+and+pyroptosis.">Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis.</a> Annual Review of Immunology. 38, 567-595 (2020).</li><li>Fu, T. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+caspase-8+tandem+DED+filament+reveals+assembly+and+regulation+mechanisms+of+the+death-inducing+signaling+complex.">Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex.</a> Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).</li><li>Jiang, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c+promotes+caspase-9+activation+by+inducing+nucleotide+binding+to+Apaf-1.">Cytochrome c promotes caspase-9 activation by inducing nucleotide binding to Apaf-1.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (40), 31199-31203 (2000).</li><li>Christgen, S., Place, D. E., Kanneganti, T. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+targeting+inflammasomes:+Insights+into+their+regulation+and+activation.">Toward targeting inflammasomes: Insights into their regulation and activation.</a> Cell Research. 30 (4), 315-327 (2020).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death.">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li><li>Sborgi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSDMD+membrane+pore+formation+constitutes+the+mechanism+of+pyroptotic+cell+death.">GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death.</a> EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).</li><li>R&#252;hl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESCRT-dependent+membrane+repair+negatively+regulates+pyroptosis+downstream+of+GSDMD+activation.">ESCRT-dependent membrane repair negatively regulates pyroptosis downstream of GSDMD activation.</a> Science. 362 (6417), 956-960 (2018).</li><li>Declercq, W., Takahashi, N., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+face+apoptotic+machinery:+From+initiator+of+apoptosis+to+guardian+of+necroptosis.">Dual face apoptotic machinery: From initiator of apoptosis to guardian of necroptosis.</a> Immunity. 35 (4), 493-495 (2011).</li><li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+RIPK1+by+caspase-8+is+crucial+for+limiting+apoptosis+and+necroptosis.">Cleavage of RIPK1 by caspase-8 is crucial for limiting apoptosis and necroptosis.</a> Nature. 574, 428-431 (2019).</li><li>Fritsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-8+is+the+molecular+switch+for+apoptosis,+necroptosis+and+pyroptosis.">Caspase-8 is the molecular switch for apoptosis, necroptosis and pyroptosis.</a> Nature. 575, 683-687 (2019).</li><li>White, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+caspases+suppress+mtDNA-induced+STING-mediated+type+I+IFN+production.">Apoptotic caspases suppress mtDNA-induced STING-mediated type I IFN production.</a> Cell. 159 (7), 1549-1562 (2014).</li><li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+caspases+prevent+the+induction+of+type+I+interferons+by+mitochondrial+DNA.">Apoptotic caspases prevent the induction of type I interferons by mitochondrial DNA.</a> Cell. 159 (7), 1563-1577 (2014).</li><li>Nakajima, Y. -. I., Kuranaga, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-dependent+non-apoptotic+processes+in+development.">Caspase-dependent non-apoptotic processes in development.</a> Cell Death and Differentiation. 24, 1422-1430 (2017).</li><li>Kumar, S., Dorstyn, L., Lim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+caspases+as+executioners+of+apoptosis.">The role of caspases as executioners of apoptosis.</a> Biochemical Society Transactions. 50 (1), 33-45 (2022).</li><li>Agniswamy, J., Fang, B., Weber, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+S2-S4+specificity+pockets+of+executioner+caspase-7+revealed+by+structural+and+kinetic+analysis.">Plasticity of S2-S4 specificity pockets of executioner caspase-7 revealed by structural and kinetic analysis.</a> FEBS Journal. 274 (18), 4752-4765 (2007).</li><li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases:+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways.">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (2), 322-331 (2008).</li><li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+approach+defines+specificities+of+members+of+the+caspase+family+and+granzyme+B.+Functional+relationships+established+for+key+mediators+of+apoptosis.">A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (29), 17907-17911 (1997).</li><li>Vince, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IAP+antagonists+target+cIAP1+to+induce+TNFalpha-dependent+apoptosis.">IAP antagonists target cIAP1 to induce TNFalpha-dependent apoptosis.</a> Cell. 131 (4), 682-693 (2007).</li><li>McComb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cIAP1+and+cIAP2+limit+macrophage+necroptosis+by+inhibiting+Rip1+and+Rip3+activation.">cIAP1 and cIAP2 limit macrophage necroptosis by inhibiting Rip1 and Rip3 activation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (11), 1791-1801 (2012).</li><li>Wong, W. W. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cIAPs+and+XIAP+regulate+myelopoiesis+through+cytokine+production+in+an+RIPK1-+and+RIPK3-dependent+manner.">cIAPs and XIAP regulate myelopoiesis through cytokine production in an RIPK1- and RIPK3-dependent manner.</a> Blood. 123 (16), 2562-2572 (2014).</li><li>Liu, X., Quan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+isolation+from+mouse+femur+bone+marrow.">Immune cell isolation from mouse femur bone marrow.</a> Bio-Protocol. 5 (20), e1631 (2015).</li><li>Lin, H., Chen, C., Chen, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+of+bone+marrow-derived+macrophages+to+apoptosis+is+associated+with+the+expression+of+X-linked+inhibitor+of+apoptosis+protein+in+primary+cultures+of+bone+marrow+cells.">Resistance of bone marrow-derived macrophages to apoptosis is associated with the expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein in primary cultures of bone marrow cells.</a> Biochemical Journal. 353 (Pt 2), 299-306 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activity+assay+buffer.">Caspase activity assay buffer.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2015).</li><li>Mackridge, A., Rowe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-way+analysis+of+variance+(ANOVA)+-+Including+Dunnett's+and+Tukey's+follow+up+tests.">One-way analysis of variance (ANOVA) - Including Dunnett's and Tukey's follow up tests.</a> Practical Approach to Using Statistics in Health Research: From Planning to Reporting. , 93-103 (2018).</li><li>Chen, H., Ning, X., Jiang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+control+antiviral+innate+immunity.">Caspases control antiviral innate immunity.</a> Cellular and Molecular Immunology. 14 (9), 736-747 (2017).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

В этом методе фторогенный субстрат используется в популяционном анализе или одноклеточном анализе для измерения активности каспазы-3/каспазы-7. Оба метода количественно измеряют активность каспазы на основе расщепления субстрата. Одним из преимуществ является возможность использования этих методов для многочисленных образцов. С помощью этих методов активность каспазы-3/каспазы-7 обнаруживается в первичных макрофагах, обработанных миметиками Smac.
Критическим аспектом популяционного флуорометрического анализа является время от лизиса до считывания флуоресценции. Образцы должны храниться на льду на протяжении всей процедуры, особенно перед «чтением» анализа. Это предотвращает преждевременное расщепление и флуоресценцию субстрата. При использовании популяционного анализа может потребоваться меньшая оптимизация. Количество белка, используемого в анализе, нормализуется, что позволяет напрямую сравнивать образцы. Одно из предостережений заключается в том, что на поздней стадии апоптотической гибели клеток общее количество белка уменьшается; следовательно, обнаружение активности каспазы может быть невозможным. Для обхода этой проблемы рекомендуется разная кинетика или разные дозы лечения. Кроме того, для точной оценки скорости активности каспазы может использоваться другое программное обеспечение, помимо программного обеспечения, описанного в этом методе. 
Для цитометрического анализа потока требуется достаточно событий или клеток, чтобы уверенно охватить популяции. Кроме того, для достижения оптимального соотношения количества субстрата и количества ячеек может потребоваться дополнительная оптимизация в анализе на основе потока. Однако при проточной цитометрии этот метод позволяет измерять дополнительные параметры, такие как маркеры поверхности клеток для идентификации типа клеток. 
Как популяционный, так и одноклеточный методы могут быть использованы для других каспаз. Однако важно помнить, что последовательность распознавания менее дискриминируется для других каспаз. Таким образом, должны использоваться другие методы активности каспазы. Это включает в себя ингибирование активности каспазы, CRISPR или сбивание конкретных каспаз и западное блоттинг для обнаружения расщепления известных субстратов. 
Одним из альтернативных методов обнаружения активности каспазы является покадровая визуализация. Тот же проницаемый подложек каспазы может быть использован вместе с другими маркерами жизнеспособности, такими как аннексин V, для предоставления информации о кинетике гибели клеток. Визуализация также будет разделять активность каспазы и выживаемость клеток, что позволяет обнаруживать сублетальные количества активности каспазы в клеточной популяции. Нелетальные функции каспазы-3/каспазы-7 связаны с противовирусной регуляцией во врожденных иммунных клетках29, в частности с активацией ИФН типа I через высвобождение митохондриальной ДНК15,16. Таким образом, эти анализы для измерения активности каспазы имеют решающее значение для выявления различных режимов гибели клеток и могут быть полезны при оценке функций неклеточной гибели.

Каспазы участвуют в нескольких формах запрограммированной гибели клеток. Апоптоз является наиболее изученной формой запрограммированной гибели клеток и связан с активностью каспазы1. Все каспазы обладают большой и малой каталитической субъединицей. Каспаза-1, каспаза-4, каспаза-5, каспаза-9 и каспаза-11 обладают доменом активации и рекрутирования каспазы (CARD), а каспаза-8 и каспаза-10 содержат эффекторные домены смерти (DED)2,3,4,5 (таблица 1). Апоптоз может быть инициирован двумя основными путями: внешним путем и внутренним путем. Внешний апоптотический путь запускается рецепторами смерти, которые являются частью суперсемейства фактора некроза опухоли (TNFSF). Рецепторы смерти обладают доменами DED, облегчающими активность каспазы-86. Внутренний апоптотический путь включает активацию каспазы-9 после образования апоптосомы, требующей высвобождения цитохрома c и Apaf-17. Активация либо инициатора каспазы, каспазы-8, либо каспазы-9, приводит к расщеплению и последующей активации каспаз палача, которыми являются каспаза-3, каспаза-6 и каспаза-7. Выявление того, что каспазы палача активны, указывает на то, что клетки подвергаются апоптозу, и эта активация считается важным фактором в определении режима гибели клеток.
Активация каспазы также является критическим моментом для регулирования воспаления и индукции альтернативных форм запрограммированной гибели клеток. Например, активация каспазы-1 приводит к созреванию провоспалительных цитокинов семейства интерлейкинов-18. Высвобождение и активация цитокинов из этого семейства, в частности IL-1β и IL-18, являются результатом расщепления гасдермина D и образования пор на плазматической мембране 9,10. Неадекватная мембранная репарация пор гасдермина D может привести к типу гибели клеток, известному как пироптоз11. Кроме того, активность каспазы-8 приводит к ингибированию казпазо-независимой гибели клеток, известной как некроптоз12. Рецептор-взаимодействующая серин/треонин протеинкиназа 1 (RIPK1) является одним из критических факторов в некроптозе и в управлении воспалением, регулируемым NF-kB. Модели показали, что RIPK1 расщепляется каспазой-8, что приводит к ограничению передачи сигналов NF-kB, апоптоза и некроптоза13,14. Таким образом, идентификация активности различных каспаз может помочь в понимании результирующей формы воспаления и гибели клеток.
Независимо от функции каспаз в регулировании модальностей гибели клеток, активность каспазы может также регулировать другие семейства цитокинов, такие как интерферон (IFN), в ответ на инфекцию15,16. Кроме того, каспазы участвуют в функциях неклеточной гибели, включая решения о судьбе клеток, восстановление и регенерацию тканей, опухолевый генез через репарацию ДНК и функцию нейронального синапса. Считается, что активность каспаз в этих нелетальных ролях ограничена клеточной локализацией и количеством каспаз. Таким образом, количественная оценка уровня активности каспазы вполне может определить, подвергается ли клетка гибели клеток или же каспаза играет роль в функции неклеточной гибели 4,17,18.
Активность каспазы может быть оценена несколькими методами. Вестерн-блоттинг для расщепленных каспаз и их субстратов использовался в качестве индикатора активности, но эти анализы в лучшем случае качественные. Чтобы определить, связана ли активность каспазы с гибелью клеток, идеально подходит количественное измерение. Поскольку каспазы расщепляют субстраты в месте распознавания, состоящем из четырех аминокислот, были разработаны колориметрические, люминесцентные или флуорометрические методы. Тем не менее, каспазы, по-видимому, имеют пластичность в распознавании подложки19,20. Последовательность распознавания не связана с белковыми доменами (табл. 1). Тетрапептидная последовательность DEVD, однако, может быть использована для обнаружения активности каспазы-3 и каспазы-7 20,21.
Миметики Smac представляют собой соединения, нацеленные на ингибиторы белков апоптоза (IAP). Использование миметиков Smac в подмножестве раковых клеток приводит к тому, что клетки становятся чувствительными к гибели клеток, индуцированной TNF22. В первичных макрофагах миметики Smac вызывают гибель клеток без экзогенного добавления TNF23,24. Потеря cIAP1 в результате деградации, вызванной миметикой Smac, приводит к образованию TNF. Если обнаружена активность каспазы, это означает, что клетки погибли не некроптозом, а апоптотическим способом. В этом методе обнаружение расщепленного СУБСТРАТА DEVD используется для идентификации активности каспазы-3/каспазы-7. Дальнейшие эксперименты по подтверждению апоптотической гибели клеток были опубликованы ранее24.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm Petri plates</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 degree incubator shaker</td>
			<td>IKA shaker KS 4000i</td>
			<td>97014-816</td>
			<td>distributed by VWR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ac-DEVD-AFC</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-260-032-M005</td>
			<td>Caspase-3 substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Fortessa</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-glycerolphosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9422-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caspase-3 recombinant&#160;</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-201-059-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.11662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>31885023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>03685-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etoposide</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-13629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>26140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo</td>
			<td>Flowjo</td>
			<td></td>
			<td>A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging</td>
			<td>Immunochemistry Technologies</td>
			<td>935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>14-8983-80</td>
			<td>now a subsidiary of Thermoscientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-Plex</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitors</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>P9070.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smac mimetic, Compound A</td>
			<td>Tetralogics</td>
			<td></td>
			<td>also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7920-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8010-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staurosporine</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-15141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.07687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>A1285901</td>
			<td>In the protocol, it is listed as Trypsin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring caspase activity using a fluorometric assay or flow cytometry

Активация цистеиновых протеаз, известных как каспазы, остается важным процессом при множественных формах гибели клеток. Каспазы являются критическими инициаторами и палачами апоптоза, наиболее изученной формы запрограммированной гибели клеток. Апоптоз возникает во время процессов развития и является необходимым событием в тканевом гомеостазе. Пироптоз является еще одной формой гибели клеток, которая использует каспазы и является критическим процессом в активации иммунной системы путем активации инфламмасомы, что приводит к высвобождению членов семейства интерлейкина-1 (IL-1). Для оценки активности каспазы могут быть оценены целевые субстраты. Тем не менее, чувствительность может быть проблемой при исследовании отдельных клеток или низкоуровневой активности. Мы демонстрируем, как фторгенный субстрат может быть использован с популяционным анализом или одноклеточным анализом с помощью проточной цитометрии. При правильном контроле различные аминокислотные последовательности могут быть использованы для определения того, какие каспазы активны. С помощью этих анализов была выявлена одновременная потеря ингибиторов белков апоптоза при стимуляции фактора некроза опухоли (TNF), которая в первую очередь индуцирует апоптоз в макрофагах, а не другие формы гибели клеток.

Первичные мышиные макрофаги дифференцировали в течение 6 дней. Через 6 дней клетки собирали, подсчитывали и сеяли. Использовались следующие методы лечения: без лечения и миметика Smac (соединение A)22 при 250 нМ и 500 нМ в течение 16 ч (рисунок 1). Эксперимент проводили в двух экземплярах, чтобы можно было оценить активацию каспазы-3/каспазы-7 либо с помощью популяционного анализа, либо с помощью одноклеточного анализа с использованием проточной цитометрии.
Концентрация белка в клеточных лизатах была количественно определена с использованием анализа BCA (дополнительная таблица 1). Это необходимо для обеспечения того, чтобы количество белка, используемого в анализе активности каспазы-3/каспазы-7, было одинаковым между образцами. В этом популяционном анализе данные могут быть представлены двумя способами. Первый заключается в том, чтобы показать кинетику путем построения скорректированной флуоресценции (ось Y) по отношению ко времени (ось x) (рисунок 2A). В качестве альтернативы, наклон может быть рассчитан для непосредственного сравнения образцов (рисунок 2B). Увеличение уклона при 500 нМ миметической обработки Smac не было значительным на основе обычной односторонней ANOVA с несколькими сравнениями (множественный сравнительный тест Даннетта28).
Для анализа активности каспазы-3/каспазы-7 с помощью проточной цитометрии собирали клетки и надводный веществ. В качестве отрицательного контроля использовали неокрашенные клетки или флуоресценцию минус один, а также необработанные клетки. Гистограмма клеток, собранных с помощью проточной цитометрии, показала сдвиг флуоресценции для клеток, обработанных миметиками Smac, по сравнению с необработанными клетками (рисунок 2C). Данные могут быть показаны либо как средняя интенсивность флуоресценции (рисунок 2D), либо как изменение складки над необработанными клетками (рисунок 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64745/64745fig01.jpg"> Рисунок 1: Блок-схема исследования. (A) Бедренные и большеберцовые кости были вырезаны у мышей C57Bl/6. Кости были промыты и дифференцированы в 20 нг/мл M-CSF в течение 6 дней. (B) На 6-й день макрофаги были собраны и пересеяны для лечения. Один набор клеток собирали для лизатов и оценивали по фторогенной активности, в то время как другой набор собирали, инкубировали с фторогенным субстратом и оценивали с помощью проточной цитометрии. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64745/64745fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64745/64745fig02.jpg"> Рисунок 2: Кинетический анализ активности каспазы-3/каспазы-7 и расщепления субстрата методом проточной цитометрии. (A,B) Репрезентативные данные кинетического анализа активности каспазы-3/каспазы-7 (C-E) и расщепления субстрата методом проточной цитометрии. Макрофаги обрабатывали двумя концентрациями миметика Smac (соединение A; 250 нМ и 500 нМ) в течение 16 ч. (A) Обнаружение расщепленного СУБСТРАТа DEVD AFC с течением времени. Данные были нормализованы до концентрации белка в образце. (B) Скорость расщепления (наклона) DEVD AFC для каждого образца была нормализована до необработанного наклона и представлена как изменение складки над необработанными клетками. (C) Проточные цитометрические гистограммы клеток, инкубированных с субстратом каспазы-3. (Д,Д) Сравнение МФО и изменение складок в МФО по сравнению с необработанным образцом. Каждая точка данных представляет собой независимую выборку; показаны средние ± стандартной погрешности среднего значения; *p < 0,05 с использованием одностороннего ANOVA и нескольких сравнительных тестов (множественный сравнительный тест Даннетта). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64745/64745fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Каспаза</td>
			<td>Вид</td>
			<td>Последовательность подложки</td>
			<td colspan="3">Белковые домены</td>
		</tr><tr><td>Каспаза-1</td>
			<td>Hs, Мм</td>
			<td>(Ш/Л) ЭХД</td>
			<td colspan="3">CARD, большой домен, малый каталитический домен</td>
		</tr><tr><td>Каспаза-2</td>
			<td>Hs, Мм</td>
			<td>ДЕКСД</td>
			<td colspan="3">CARD, большой домен, малый каталитический домен</td>
		</tr><tr><td>Каспаза-4</td>
			<td>Хс</td>
			<td>(Ш/Л) ЭХД</td>
			<td colspan="3">CARD, большой домен, малый каталитический домен</td>
		</tr><tr><td>Каспаза-5</td>
			<td>Хс</td>
			<td>(Ш/Л) ЭХД</td>
			<td colspan="3">CARD, большой домен, малый каталитический домен</td>
		</tr><tr><td>Каспаза-9</td>
			<td>Hs, Мм</td>
			<td>(I/V/L) E(H/T)D</td>
			<td colspan="3">CARD, большой домен, малый каталитический домен</td>
		</tr><tr><td>Каспаза-11</td>
			<td>Миллиметр</td>
			<td>(Ш/Л) ЭХД</td>
			<td colspan="3">CARD, большой домен, малый каталитический домен</td>
		</tr><tr><td>Каспаза-12</td>
			<td>Миллиметр</td>
			<td>АВАД</td>
			<td colspan="3">CARD, большой домен, малый каталитический домен</td>
		</tr><tr><td>Каспаза-8</td>
			<td>Hs, Мм</td>
			<td>(I/V/L) E(H/T)D</td>
			<td colspan="3">DED, большой домен, малый каталитический домен</td>
		</tr><tr><td>Каспаза-10</td>
			<td>Хс</td>
			<td>(I/V/L) E(H/T)D</td>
			<td colspan="3">DED, большой домен, малый каталитический домен</td>
		</tr><tr><td>Каспаза-3</td>
			<td>Hs, Мм</td>
			<td>ДЕКСД</td>
			<td colspan="3">большой домен, малый каталитический домен</td>
		</tr><tr><td>Каспаза-6</td>
			<td>Hs, Мм</td>
			<td>(I/V/L) E(H/T)D</td>
			<td colspan="3">большой домен, малый каталитический домен</td>
		</tr><tr><td>Каспаза-7</td>
			<td>Hs, Мм</td>
			<td>ДЕКСД</td>
			<td colspan="3">большой домен, малый каталитический домен</td>
		</tr><tr><td>каспаза-14</td>
			<td>чс, мм</td>
			<td>(Ш/Л) ЭХД</td>
			<td colspan="3">большой домен, малый каталитический домен</td>
		</tr><tr><td>КАРТОЧКА</td>
			<td colspan="5">Домен активации и вербовки каспазы</td>
		</tr><tr><td>ДЭД</td>
			<td colspan="5">домен эффектора смерти</td>
		</tr><tr><td>Хс</td>
			<td colspan="5">homo sapien</td>
		</tr><tr><td>Миллиметр</td>
			<td colspan="5">мускулатурный</td>
		</tr></tbody></table>Таблица 1: Субстратная специфичность и белковые домены каспаз. Таблица адаптирована из McStay et al.20; Шалини и др.3; и ван Опденбош и Ламканфи4.
Дополнительная таблица 1: Кинетический анализ DEVD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64745/Supplementary%20Table%201.%20DEVD%20kinetic%20assay.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

Настоящий протокол описывает два метода измерения активности каспазы через фторогенный субстрат с использованием проточной цитометрии или спектрофлуорометра.

Измерение активности каспазы с помощью флуорометрического анализа или проточной цитометрии

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Этот протокол позволяет исследователям определить, происходит ли активность каспазы в сочетании с гибелью клеток, тем самым идентифицируя различные способы гибели клеток. Преимуществом этого метода является гибкость для оценки активности каспазы в популяционном анализе или одной клетке. Продемонстрировать процедуру будут Стефани Руфли, аспирант, и Цзин Тонг, приглашенный аспирант из лаборатории Венди Вей-Линн Вонг.После дифференцировки и сбора макрофагов или BMDM, полученных из костного мозга, как описано в рукописи, посейте их в шестилуночную пластину с плотностью от одного раза 10 до шестого количества клеток на миллилитр. Обрабатывайте клетки миметиком SMAC в течение 16 часов. Чтобы приготовить лизат клеток, перенесите пластину, содержащую обработанные клетки, на лед и соберите питательную среду клеток в 1,5-миллилитровую трубку.Центрифуга при 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Аспирируйте среду и положите трубку на лед. Затем добавьте один миллилитр холодного PBS в пластину для культивирования клеток, чтобы промыть клетки.После аспирации всех PBS добавьте в клетки 100 микролитров трипсина. Как только клетки отсоединятся от пластины, соберите их в 1,5-миллилитровую трубку. После центрифугирования клеточной суспензии удаляют надосадочный агент и повторно суспендируют гранулу в буфере лизиса DISC объемом 100 микролитров.Инкубируйте образец на льду в течение 20 минут, а затем центрифугируйте лизат, чтобы гранулировать нерастворимую фракцию. Перенесите 25 микролитров лизата на белую плоскодонную 96-луночную пластину для анализа активности каспазы-3/7 и 10 микролитров на прозрачную плоскодонную 96-луночную пластину для анализа бицинхониновой кислоты или BCA. Для количественной оценки белка подготовьте ряд концентраций бычьего сывороточного альбумина или BSA в качестве стандартного белка.После добавления стандартного BSA к плоскодонной 96-луночной пластине, содержащей образцы, смешайте реагенты BCA один и два в соотношении 50 к одному и добавьте 200 микролитров к каждому образцу в стандарте. После инкубации при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут измерьте поглощение на 562 нанометрах на флуорометрическом приборе и количественно оцените концентрацию белка с помощью стандартной кривой. Чтобы выполнить популяционный анализ, запустите флуорометрический инструмент и нагрейте машину до 30 градусов по Цельсию.Установите длину волны возбуждения и излучения на 360 и 465 нанометров соответственно. Затем приготовьте мастер-реакционную смесь на льду, как описано в рукописи, чтобы определить активность каспазы. Добавьте 75 микролитров смеси к каждому образцу и стандарту, чтобы получить общий реакционный объем 100 микролитров.Немедленно измерьте флуоресценцию с помощью флуорометрического прибора и записывайте отдельные показания каждую минуту в течение 40 минут, чтобы определить кинетику реакции. После посева соберите адгезивные ячейки, как было продемонстрировано ранее, в пятимиллилитровую полистирольную трубку. Затем центрифугируйте образец при 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и удалите супернатант.Для приготовления окрашивающей смеси берут один микролитр фторогенного субстрата и разбавляют его 150 микролитрами PBS. Добавьте 50 микролитров окрашивающей смеси на образец, высиживайте ее в темноте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут и перемешивайте каждые 15 минут. В этом популяционном анализе репрезентативные данные кинетического анализа активности каспазы-3/7 показали увеличение расщепления субстрата с увеличением миметической концентрации SMAC.Однако увеличение на 500 наномолярной концентрации было незначительным на основе обычной односторонней ANOVA с множественными сравнениями. Анализ активности каспазы-3/7 с использованием проточной цитометрии показал сдвиг флуоресценции для клеток, обработанных миметиками SMAC, по сравнению с необработанными клетками, что также было очевидно в построенной средней интенсивности флуоресценции и увеличение при 500 наномолярной концентрации было значительным. Процедура должна проводиться на льду.Однако в популяционном анализе образцы нельзя оставлять на льду бесконечно. После стадии лизиса образцы должны быть дополнительно обработаны или немедленно заморожены. Визуализация активности каспазы с использованием микроскопии живых клеток будет дополнительным методом получения кинетической информации на уровне одной клетки.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Флуоресцентным на основе анализа фосфолипида Scramblase деятельности

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Количественное Бактериальный гистидинкиназа Автофосфорилирование Использование Nitrocellulose Анализ на связывание

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

ДНК-полимераза деятельности пробирного с использованием флуоресцентных помечены ДНК ближней ИК-области визуализирована электрофорезом геля акриламида

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Обнаружение Rab10 фосфорилирования LRRK2 деятельностью с помощью SDS-страницы с тегом фосфат привязки

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Освещение пути к Caspase активации с помощью Bimolecular флуоресценции дополнения

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

In Vitro Assay для обнаружения деятельности трансферазы tRNA изопентенил

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Fluorogenic пептид расщепления Assay экран для протеолитической активности: приложения для коронавирус Спайк активации белка

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Колориметрический анализ цитратсинстого действия в Drosophila Меланогастер

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Кинетический скрининг nuclease деятельности с использованием нуклеиновой кислоты зондов

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Флюорометрический анализ на основе Click-Химии для аполипопротеин N-ацилтрансферазы от характеристики ферментов до высокопроизводительного скрининга

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...