Name: multiplexed barcoding image analysis for immunoprofiling and spatial mapping characterization in the single-cell analysis of paraffin tissue samples
Uploaded: 2023-04-07T13:50:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples at JoVE.c

يشكر المؤلفون دونالد آر نوروود من خدمات التحرير ، المكتبة الطبية البحثية في MD Anderson لتحرير هذه المقالة ومختبر تحليل الصور و IF المتعدد في قسم علم الأمراض الجزيئي الانتقالي في MD Anderson. تم دعم هذا المشروع جزئيا من قبل منصة Moonshots لمختبر علم الأمراض الجزيئي الانتقالي - التنميط المناعي (TMP-IL) في قسم علم الأمراض الجزيئي الانتقالي ، ومركز إم دي أندرسون للسرطان بجامعة تكساس ، واتفاقية التعاون NCI U24CA224285 (إلى مركز إم دي أندرسون للسرطان CIMAC).

<ol>
	<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+Functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li><li>Labani-Motlagh, A., Ashja-Mahdavi, M., Loskog, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment:+A+milieu+hindering+and+obstructing+antitumor+immune+responses.">The tumor microenvironment: A milieu hindering and obstructing antitumor immune responses.</a> Frontiers in Immunology. 11, 940 (2020).</li><li>Jin, M. Z., Jin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+updated+landscape+of+tumor+microenvironment+and+drug+repurposing.">The updated landscape of tumor microenvironment and drug repurposing.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 166 (2020).</li><li>Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+cancer+immunotherapy:+From+T+cell+basic+science+to+clinical+practice.">A guide to cancer immunotherapy: From T cell basic science to clinical practice.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).</li><li>Black, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CODEX+multiplexed+tissue+imaging+with+DNA-conjugated+antibodies.">CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies.</a> Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).</li><li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+multiplex+immunohistochemistry/immunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy.">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Communications. 40 (4), 135-153 (2020).</li><li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IBEX:+A+versatile+multiplex+optical+imaging+approach+for+deep+phenotyping+and+spatial+analysis+of+cells+in+complex+tissues.">IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455-33465 (2020).</li><li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).</li><li>Eng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+multiplex+imaging+optimization+and+reproducible+analysis.">A framework for multiplex imaging optimization and reproducible analysis.</a> Communications Biology. 5 (1), 438 (2022).</li><li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-institutional+TSA-amplified+multiplexed+immunofluorescence+reproducibility+evaluation+(MITRE)+study.">Multi-institutional TSA-amplified multiplexed immunofluorescence reproducibility evaluation (MITRE) study.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e002197 (2021).</li><li>Binnewies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+tumor+immune+microenvironment+(TIME)+for+effective+therapy.">Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy.</a> Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).</li><li>Heindl, A., Nawaz, S., Yuan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+spatial+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment:+A+new+era+for+digital+pathology.">Mapping spatial heterogeneity in the tumor microenvironment: A new era for digital pathology.</a> Laboratory Investigation. 95 (4), 377-384 (2015).</li><li>Kuswanto, W., Nolan, G., Lu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+spatial+profiling+with+CODEX:+bioinformatic+analysis+and+application+in+human+disease.">Highly multiplexed spatial profiling with CODEX: bioinformatic analysis and application in human disease.</a> Seminars in Immunopathology. 45 (1), 145-157 (2022).</li><li>Phillips, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+topography+predicts+response+to+PD-1+blockade+in+cutaneous+T+cell+lymphoma.">Immune cell topography predicts response to PD-1 blockade in cutaneous T cell lymphoma.</a> Nature Communications. 12 (1), 6726 (2021).</li><li>Jhaveri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+ultrahigh-plex+spatial+phenotyping+of+human+cancer+tissues.">Deep ultrahigh-plex spatial phenotyping of human cancer tissues.</a> Cancer Research. 82, 3877 (2022).</li><li>Goltsev, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+profiling+of+mouse+splenic+architecture+with+CODEX+multiplexed+imaging.">Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging.</a> Cell. 174 (4), 968-981 (2018).</li><li>Yuan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Spatial heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6 (8), a026583 (2016).</li><li>Bruck, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+immunoprofiling+of+the+intratumoral+and+peritumoral+tissue+of+renal+cell+carcinoma+patients.">Spatial immunoprofiling of the intratumoral and peritumoral tissue of renal cell carcinoma patients.</a> Modern Pathology. 34 (12), 2229-2241 (2021).</li><li>Tsujikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+spatial+immune+profiles+in+human+solid+cancers.">Prognostic significance of spatial immune profiles in human solid cancers.</a> Cancer Science. 111 (10), 3426-3434 (2020).</li><li>Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunofluorescence+and+multispectral+imaging:+forming+the+basis+of+a+clinical+test+platform+for+immuno-oncology.">Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 674747 (2021).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+immune+landscapes+using+an+automated+nine-color+multiplex+immunofluorescence+staining+panel+and+image+analysis+in+paraffin+tumor+tissues.">Identification of distinct immune landscapes using an automated nine-color multiplex immunofluorescence staining panel and image analysis in paraffin tumor tissues.</a> Scientific Reports. 11 (1), 4530 (2021).</li><li>Elaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+dimensional+imaging+mass+cytometry+panel+to+visualize+the+tumor+immune+microenvironment+contexture.">High dimensional imaging mass cytometry panel to visualize the tumor immune microenvironment contexture.</a> Frontiers in Immunology. 12, 666233 (2021).</li><li>Campos Clemente, L., Shi, O., Rojas, F., Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+comprehension+of+the+tumor+microenvironment+using+mass+spectrometry+imaging+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+samples.">Expanding the comprehension of the tumor microenvironment using mass spectrometry imaging of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64015 (2022).</li><li>Schurch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+cellular+neighborhoods+orchestrate+antitumoral+immunity+at+the+colorectal+cancer+invasive+front.">Coordinated cellular neighborhoods orchestrate antitumoral immunity at the colorectal cancer invasive front.</a> Cell. 182 (5), 1341-1359 (2020).</li><li>Phillips, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+phenotyping+of+immunoregulatory+proteins+in+the+tumor+microenvironment+by+CODEX+tissue+imaging.">Highly multiplexed phenotyping of immunoregulatory proteins in the tumor microenvironment by CODEX tissue imaging.</a> Frontiers in Immunology. 12, 687673 (2021).</li><li>Hickey, J. W., Tan, Y., Nolan, G. P., Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+accurate+cell+type+identification+in+CODEX+multiplexed+imaging+data.">Strategies for accurate cell type identification in CODEX multiplexed imaging data.</a> Frontiers in Immunology. 12, 727626 (2021).</li><li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+and+analyze+the+cellular+spatial+distribution+extracted+from+multiplex+immunofluorescence+data+to+understand+the+tumor+microenvironment.">Methods to determine and analyze the cellular spatial distribution extracted from multiplex immunofluorescence data to understand the tumor microenvironment.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 668340 (2021).</li><li>Tzoras, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+tumor-immune+microenvironment+in+breast+cancer+at+a+spatial+and+multiplex+resolution.">Dissecting tumor-immune microenvironment in breast cancer at a spatial and multiplex resolution.</a> Cancers. 14 (8), 1999 (2022).</li><li>Francisco-Cruz, A., Parra, E. R., Tetzlaff, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wistuba,+II.+Multiplex+immunofluorescence+assays.">Wistuba, II. Multiplex immunofluorescence assays.</a> Methods in Molecular Biology. 2055, 467-495 (2020).</li><li>Shakya, R., Nguyen, T. H., Waterhouse, N., Khanna, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+contexture+analysis+in+immuno-oncology:+applications+and+challenges+of+multiplex+fluorescent+immunohistochemistry.">Immune contexture analysis in immuno-oncology: applications and challenges of multiplex fluorescent immunohistochemistry.</a> Clinical and Translational Immunology. 9 (10), e1183 (2020).</li><li>Wilson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+the+statistical+analysis+of+multiplex+immunofluorescence+data.">Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data.</a> Cancers. 13 (12), 3031 (2021).</li><li>DeRosa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+a+new+standard+for+spatial+omics:+An+integrated+multiomics+approach:+every+single+cell,+two+different+analytes,+one+unbiased+picture.">Setting a new standard for spatial omics: An integrated multiomics approach: every single cell, two different analytes, one unbiased picture.</a> Genetic Engineering &amp; Biotechnology News. 42, 26-28 (2022).</li><li>Simonson, P. D., Valencia, I., Patel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide-conjugated+DNA+barcodes+enable+signal+amplification+for+multiparametric+CODEX+imaging.">Tyramide-conjugated DNA barcodes enable signal amplification for multiparametric CODEX imaging.</a> Communications Biology. 5 (1), 627 (2022).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تعارضات للكشف عنها.

يلعب TME دورا أساسيا في تطور السرطان وتطوره واستجابات العلاج. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تكون كثافة مجموعات فرعية محددة من الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم في TME بمثابة علامة حيوية تنبؤية لأنواع معينة من السرطان. بشكل ملحوظ ، بالإضافة إلى التركيب الخلوي ل TME ، يمكن أن توفر الخصائص المكانية للورم مخططا تفصيليا لفهم بيولوجيا الورم وتحديد المؤشرات الحيوية المحتملةللتنبؤ 12,17.
نظرا لأن العديد من مجموعات الخلايا المناعية تشارك في استجابات السرطان أو المضادة للسرطان ، فإن الفهم الأفضل لهذه الخلايا وعلاقاتها المكانية مع بعضها البعض ومع الخلايا السرطانية سيساعد في توجيه تحديد استراتيجيات العلاج المناعي الجديدة. قامت الدراسات السابقة بتقسيم الموقع والتوزيع المكاني لخلايا TME بناء على بنية الأنسجة في المناطق داخل الورم وحول الورم والهوامش الغازية للخلايا السرطانية18,19. على مدى السنوات ال 15 الماضية ، جعلت التطورات التكنولوجية تحليل النمط الظاهري للخلايا الفردية بناء على تشتتها المكاني أداة جديدة ومؤثرة لدراسة TME وتصنيف المؤشرات الحيوية المحتملة للعلاج المناعي للورم. يمكن للكيمياء النسيجية Multiplex IF تقدير علامات بيولوجية متعددة في نفس الوقت20.
على غرار استراتيجية الأجسام المضادة المترافقة قليل النوكليوتيد ، يتم استخدام أربعة أنواع من منصات تعدد الإرسال القائمة على البروتين لدراسة TME: أنظمة الكشف عن الأجسام المضادة ذات العلامات الكروموجينية ، والتألق ، والباركود DNA ، والنظائر المعدنية. تتيح منصات IHC الكروموجينية الفعالة من حيث التكلفة تصور الشريحة الكاملة والتقييم المرضي باستخدام الفحص المجهري التقليدي للمجال الساطع. في IF و IHC المتعددين ، يتم استخدام الأجسام المضادة المترافقة مع الفلوروفور. تكتشف منصة IF / IHC متعددة الإرسال الأجسام المضادة ذات الخصوصية العالية ويمكنها تحديد الأجسام المضادة المستهدفة حتى على المستوى تحت الخلوي 6,21. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لطبيعة الكروموجينات والفلوروفورات ، فإن استخدام لوحة واحدة من الأجسام المضادة يمكن أن يلتقط تعبير ما يصل إلى 10 مؤشرات حيوية على شريحة واحدة. على المنصات القائمة على النظائر المعدنية ، تستخدم الأجسام المضادة الموسومة بالمعادن لإجراء تصوير متعدد الإرسال بدقة خلية واحدة ومكانية ، وحساسية عالية لأقسام الأنسجة الفردية22. من الناحية النظرية ، تتيح مناهج الأجسام المضادة المقترنة بالمعادن الكشف المتزامن عن أكثر من 100 مؤشر حيوي في قسم نسيج واحد. ويتمثل أحد التحديات التي تواجه تقنية وضع العلامات على النظائر في التداخل متساوي الضغط، الذي يمنع الوصول إلى درجة نقاء التخصيب بنسبة100 في المائة 23. علاوة على ذلك ، يزداد التداخل مع زيادة عدد العلامات. تتعرف منصات الكشف عن الأجسام المضادة المقترنة بالحمض النووي على الأجسام المضادة الموسومة برموز شريطية فريدة من نوعها للحمض النووي. يمكن التقاط أكثر من 40 مؤشرا حيويا في وقت واحد بدقة عالية على هذه المنصات6.
التصوير المتعدد هو منصة للكشف عن الأجسام المضادة ذات الرمز الشريطي للحمض النووي المتاحة تجاريا لتطبيق الأجسام المضادة المقترنة بالحمض النووي على شريحة نسيج واحدة في خطوة واحدة (الشكل 8). بالنسبة لمرحلة تحضير الأنسجة ، على عكس منصة التصوير بالحزمة الأيونية المتعددة ، والتي تتطلب استخدام شرائح مطلية بالذهب تم الحصول عليها من الشركات المصنعة ، تتطلب منصة التصوير متعددة الإرسال فقط أغطية عادية أو شرائح مغلفة بنسبة 0.1٪ بولي-L-lysine لمساعدة الأنسجة على الالتصاق بها والحفاظ على الأنسجة سليمة أثناء عملية التلوين والتصوير. يوصى باستخدام أقسام الأنسجة على أغطية الغطاء في غضون 4 أسابيع بعد التقسيم ، حيث يؤدي التخزين المطول للشرائح غير الملوثة إلى تقليل المستضد. يمكن الاحتفاظ بعينة غطاء ملطخة في مخزن مؤقت عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع دون أن تفقد إشارة تلطيخها. لا توجد معدات خاصة مطلوبة لتخزين عينات الغطاء. تمت ترقية نظام التصوير متعدد الإرسال لاستخدام الشرائح العادية بدلا من أغطية الغطاء ، مما يتيح تلطيخ الأنسجة الكبيرة وسهولة التعامل معها. عند استخدام محلول اختزال لاقتران الأجسام المضادة (الخطوة 3.2.3) ، يجب أن يقتصر التفاعل على ما لا يزيد عن 30 دقيقة لمنع تلف الأجسام المضادة. يجب إعداد مخازن الحظر المؤقتة في الخطوة 5.6.6 حديثا ، ويجب عدم إعادة استخدام المخازن المؤقتة للحظر.
بالمقارنة مع منصات الكشف عن الأجسام المضادة متعددة الإرسال التي تحمل علامات الكروموجين والتألق والنظائر المعدنية ، فإن تقنية التصوير المتعدد لها مزايا معينة. على سبيل المثال ، يتوفر تجاريا أكثر من 60 لوحة من الأجسام المضادة المصممة مسبقا للتصوير متعدد الإرسال ، مما يساعد على توفير الوقت والتكاليف في اقتران الأجسام المضادة والتحقق من صحتها ، ويتزايد عدد لوحات الأجسام المضادة المصممة مسبقا. هذه الأجسام المضادة ، والتي تشمل علامة السرطان عموم السيتوكيراتين ، وعلامة سرطان الجلد SOX10 ، وعلامة الأوعية الدموية CD31 ، وعلامة اللحمية SMA ، والعديد من علامات الخلايا المناعية ، تم التحقق من صحتها وجاهزة للتجربة. بالنسبة للأجسام المضادة غير المصممة مسبقا ، فإن مجموعة الاقتران المتاحة تجاريا والمصممة للاستخدام مع التصوير متعدد الإرسال واضحة وسهلة الاستخدام. الأجسام المضادة المترافقة مع العملاء جيدة لمدة 1 سنة عند تخزينها في 4 °C. بالإضافة إلى ذلك ، لا يلزم إحماء الجهاز لالتقاط الصور. في تقنية التصوير متعددة الإرسال هذه ، نادرا ما تؤدي خطوات الغسيل والتهجين والتجريد التكرارية في الحصول على الصورة إلى انخفاض كثافة العلامة أو تدهور مورفولوجيا الأنسجة5،24،25. علاوة على ذلك ، يتم التقاط الصور المركبة بتنسيق QPTIFF باستخدام مجهر مضان بسيط ثلاثي الألوان ويمكن تحميلها وتحليلها باستخدام برنامج تحليل رقمي تابع لجهة خارجية. يمكن تصور علامات التلوين بدقة خلية واحدة ، ويمكن تمييز الأنماط الظاهرية للخلية من خلال التوطين المشترك للعلامات (الشكل 6 والشكل 7). يكشف التحليل الشامل للصورة متعددة الإرسال عن مقصورات الأنسجة ، والقياس الكمي لعلامة الخلية الواحدة ، وأقرب بيانات الجار والقرب (الشكل 8).
التحدي في تحليل الصور متعددة الإرسال هو تحديد نوع الخلية. عادة ، عندما يتم تطبيق المزيد من مصنفات الكائن الواحد على صورة ما ، سيتم تعليق المزيد من الأنماط الظاهرية غير الشائعة. لذلك ، يوصى باستخدام علامات معروفة لم يتم التعبير عنها بشكل مشترك في نفس المصنف وتطبيق المصنف المرتبط بالنمط الظاهري فقط على التعليق التوضيحي للخلايا المفردة. ستؤدي الاختلافات في التعليقات التوضيحية لنوع الخلية إلى نتائج مكانية مختلفة اختلافا جوهريا ، مثل الاختلافات في التوزيع المكاني للخلية وتحليل الجوار الخلوي26,27.
أثبت تحليل الصور المتعددة نجاحه في تلطيخ وتصوير العديد من أنواع العينات ، بما في ذلك أنسجة FFPE والأنسجة المجمدة الطازجة والشرائح الكاملة المؤرشفة والمصفوفات الدقيقة للأنسجة. يمكن الحصول على صور متعددة الإرسال لأقسام الثدي والدماغ والرئة والطحال والكلى والعقدة الليمفاوية وأنسجة الجلد باستخدام بيانات التنميط الظاهري المكاني العميق أحادي الخلية5،16،25،28.
في المستقبل ، من المتوقع المزيد من الأجسام المضادة المصممة مسبقا للتصوير متعدد الإرسال. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة ماسة إلى تطوير برامج محددة لتحليل الصور المتعددة. حاليا ، توجد العديد من البرامج المتاحة تجاريا ومفتوحة المصدر لتحليل الصورHi-Plex 29 ، لكن العلماء ما زالوا بحاجة إلى المساعدة في إنشاء سير عمل قياسي لهذه التحليلات30,31. على الرغم من أن الصور المركبة الملتقطة باستخدام هذا البروتوكول متوافقة مع برامج الجهات الخارجية ، فقد يؤدي ذلك إلى تكاليف إضافية للمستخدم. عيب آخر لتقنية التصوير المتعدد هو انخفاض الإشارة في الكشف عن البروتين النووي بعد الغسيل التكراري والتهجين والتجريد بألواح كبيرة من الأجسام المضادة. لحسن الحظ ، يمكن تقليل ذلك عن طريق استرداد الفلوروفورات المشفرة في الدورات المبكرة عند تصميم لوحات المراسل. في الآونة الأخيرة ، تمت ترقية هذه المنصة بنظام مسح ضوئي جديد عالي السرعة ، مما قلل بشكل كبير من الوقت اللازم للحصول على الصور المركبة32. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن استراتيجية جديدة تستخدم الرموز الشريطية المقترنة بالتيراميد لتعزيز التصوير القائم على ترميز الأجسام المضادة المترافقة قليل النوكليوتيد. تهدف هذه التقنية إلى تضخيم إشارات التلوين التي يصعب الحصول على الأجسام المضادة المقترنة بالباركود33.

البيئة المكروية للورم (TME) غير متجانسة للغاية ، وتتكون من الخلايا السرطانية ، والخلايا اللحمية السرطانية ، والخلايا المناعية ، والمكونات غير الخلوية للمصفوفة خارج الخلية ، والعديد من الجزيئات الوفيرة التي تنتجها وتطلقها الخلايا السرطانية واللحميةوالمناعية 1,2. توضح الأدلة المتراكمة أن TME له دور محوري في إعادة برمجة تمايز الورم والنمو والغزو والورم الخبيث والاستجابة للعلاجات3.
يعد فهم كيفية تفاعل أنواع الخلايا المختلفة في TME والتواصل مع بعضها البعض من خلال شبكات الإشارات أمرا ضروريا لتحسين تشخيص السرطان وتحسين العلاج المناعي وتطوير علاجات جديدة4. تم استخدام تقنيات الفحص المجهري التقليدي للأنسجة ، بما في ذلك الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) والتألق المناعي (IF) ، لعقود لدراسة أنواع الخلايا ووفرتها واتصالاتها في عينات الورم. لسوء الحظ ، يمكن لهذه التقنيات عادة تقييم علامة بروتين واحدة أو اثنتين فقط في قسم الأنسجة ولا يمكنها الكشف عن العلاقات المكانية والهيكلية المعقدة بين هذه الخلايا5،8،7.
على مدى العقدين الماضيين ، تم إنشاء العديد من تقنيات التصوير متعددةالإرسال 8. توفر هذه التقنيات وجهات نظر محسنة كثيرا لتكوين الخلايا المناعية ووظيفتها وموقعها داخل TME ، مما يؤدي إلى تقدم سريع في القدرة على تحديد TMEs المعقدة وتوصيفها مكانيا على مستوىالخلية الواحدة 9,10. العلاقات المكانية والهيكلية لمختلف الخلايا السرطانية والمناعية في TME هي الآن في طليعة الدراسات البيولوجية والسريرية باستخدام تقنيات التصوير المتعددة هذه11,12.
تعد تقنية التصوير متعددة الإرسال التي تم تطويرها مؤخرا باستخدام الترميز الشريطي للأجسام المضادة المترافقة قليل النوكليوتيد عبارة عن منصة أبحاث بيولوجية أحادية الخلية مؤثرة تعتمد على اكتشاف الأجسام المضادة المقترنة قليل النوكليوتيد في عينات ثابتة بالفورمالين ومدمجة بالبارافين (FFPE)13,14. حاليا ، تسمح تقنية التصوير المتعدد هذه بالتصوير المتزامن لأكثر من 100 علامة في قسم نسيج واحد15 ، مما زاد من عدد أنواع الخلايا التي يمكن تمييزها في الموقع. يتيح ذلك مستوى من التحليل المكاني للورم والخلايا المناعية غير ممكن باستخدام مناهج التنميط المناعي التقليدية16.
هنا ، نصف بروتوكولا محسنا لاقتران الأجسام المضادة النقية بقليل النوكليوتيدات والتحقق من صحة هذا الاقتران باستخدام منصة التصوير متعددة الإرسال وإجراء تصوير متعدد الدورات مع أنسجة FFPE. بالإضافة إلى ذلك ، نصف إجراءات معالجة الصور وتحليل البيانات الأساسية المستخدمة مع هذه التقنية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x AR9 Buffer</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>AR900250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Buffer</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>7000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Antibody Diluent/Block</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>ARD1001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Conjugation Kit</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>7000009</td>
			<td>Contains Filter Blocking Solution, Antibody Reduction Solution 1, Antibody Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution, Antibody Storage Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Reagent</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>7000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40718-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Avantor/VWR</td>
			<td>BDH1115-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G Blocker V2</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>240199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoclear</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-329-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Integral 10&#160;</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>ZRXQ010WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niknon Fluorescence microscope</td>
			<td>Keyence Corp. of America</td>
			<td>BZ-X810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>7000003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoCycler Barcodes/Reporters Combination</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>5450004 (BX025/RX025)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5450003 (BX022/RX022)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5450023 (BX002/RX002)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;5250002 (BX020/RX020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2520003 (BX023/RX023)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5250005 (BX029/RX029)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5250007 (BX035/RX035)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5250012 (BX052/RX052)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5550012 (BX030/RX030)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5550015 (BX042/RX042)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5550014 (BX036/RX036)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuPath</td>
			<td>Open-Source</td>
			<td>https://qupath.github.io/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC6065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Kit</td>
			<td>(Akoya Biosciences</td>
			<td>7000008</td>
			<td>Contains Hydration Buffer, N Blocker, J Blocker, S Blocker, Fixative Reagent, Storage Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed barcoding image analysis for immunoprofiling and spatial mapping characterization in the single-cell analysis of paraffin tissue samples

تعد تقنية التصوير متعددة الإرسال باستخدام الترميز الشريطي للأجسام المضادة مع قليل النوكليوتيدات ، والتي تكتشف بالتتابع حوائط متعددة في نفس قسم الأنسجة ، منهجية فعالة لتقييم الورم تعمل على تحسين فهم البيئة المكروية للورم. يتم تحقيق تصور تعبير البروتين في الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمضمنة في البارافين عندما يتم تلدين فلوروفور معين إلى رمز شريطي مرتبط بالأجسام المضادة عبر oligonucleotides التكميلية ثم يتم إجراء تصوير العينة. في الواقع ، تسمح هذه الطريقة باستخدام لوحات قابلة للتخصيص لأكثر من 40 جسما مضادا في تفاعل تلطيخ واحد للأنسجة. تتوافق هذه الطريقة مع الأنسجة المجمدة الطازجة ، والأنسجة المثبتة بالفورمالين ، والأنسجة المضمنة بالبارافين ، والخلايا المستزرعة ، وخلايا الدم أحادية النواة المحيطية ، مما يعني أنه يمكن للباحثين استخدام هذه التقنية لعرض مجموعة متنوعة من أنواع العينات بدقة خلية واحدة. تبدأ هذه الطريقة ببروتوكول تلطيخ وتثبيت يدوي ، ويتم تطبيق جميع الرموز الشريطية للأجسام المضادة باستخدام كوكتيل الأجسام المضادة. أداة سوائل التلوين مؤتمتة بالكامل وتؤدي دورات تكرارية لوضع العلامات والتصوير وإزالة الفلوروفورات المتميزة طيفيا حتى يتم تصوير جميع المؤشرات الحيوية باستخدام مجهر مضان قياسي. ثم يتم جمع الصور وتجميعها عبر جميع دورات التصوير لتحقيق دقة خلية واحدة لجميع العلامات. لا يسمح التلوين أحادي الخطوة وإزالة الفلوروفور اللطيفة بتحليل العلامات الحيوية المتعددة للغاية فحسب ، بل يحافظ أيضا على العينة لإجراء تحليل إضافي في اتجاه مجرى النهر إذا رغبت في ذلك (على سبيل المثال ، تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين). علاوة على ذلك ، يتيح برنامج تحليل الصور معالجة الصور - تعويض الانجراف ، وطرح الخلفية ، وتجزئة الخلايا ، والتجميع - بالإضافة إلى تصور وتحليل الصور والأنماط الظاهرية للخلايا لإنشاء خرائط الشبكة المكانية. باختصار ، تستخدم هذه التقنية نظام الموائع الدقيقة المحوسب والمجهر الفلوري للتهجين المتكرر ، وتصوير ، وتجريد مجسات الحمض النووي ذات العلامات الفلورية المكملة للأجسام المضادة المرتبطة بالأنسجة قليلة النوكليوتيدات.

استخدمنا عينات اللوزتين FFPE لتطوير لوحة الأورام المناعية المكونة من 26 علامة لتوضيح الحالة المناعية لأنسجة FFPE باستخدام نظام تحليل صور الترميز الشريطي. بشكل عام ، يتم استخدام 19 جسما مضادا حاليا في دراسات التصوير المتعددة الأخرى في مختبرنا. تم اختبار جميع العلامات باستخدام أنسجة FFPE مع IHC كروموجيني. تم اقتران جميع الأجسام المضادة مع oligonucleotides الحمض النووي الفريدة. عند إعداد قسائم الغلاف باستخدام مدير الأدوات المستند إلى الويب (الشكل 4) لتقنية تحليل صور التشفير الشريطي هذه ، تجدر الإشارة إلى أن الدورتين الأولى والأخيرة دائما ما تكون "فارغة" (الشكل 2 والشكل 4) ، والتي توفر إشارات مضان الخلفية ليتم طرحها من الإشارات المحددة من الأجسام المضادة. بعد جمع الصور بتنسيق QPTIFF باستخدام المجهر الفلوري ، يمكن تصورها باستخدام العديد من برامج تحليل الصور الآلية الحاصلة على براءة اختراع أو البرامج مفتوحة المصدر. يمكن أن تظهر الصور المركبة جميع العلامات أو العلامات المحددة للحصول على رؤية أفضل للإشارات (الشكل 5). علاوة على ذلك ، يمكن تقييم كل جسم مضاد بصريا للتوطين النووي أو السيتوبلازمي أو الغشائي. يمكن التعرف بسهولة على الخلايا المناعية والورم والخلايا اللحمية. بعد ذلك ، يمكن أن يوفر تحليل الصور معلومات عن شدة الإشارة والنطاق الديناميكي والتوزيع المكاني لجميع العلامات (الشكل 6). سمحت لنا هذه التقنية بتحليل جميع العلامات ال 26 على المستوى تحت الخلوي في قسم نسيج واحد (الشكل 7). من خلال تحليل التموضع المشترك للعلامات ، يمكننا تحديد الأنماط الظاهرية الخلوية ، وتحديد موضع الخلية المكانية ، وحساب المسافة بين الخلايا ، وإيجاد توزيع الخلايا. يتمثل التأثير الحاسم لهذه التقنية في تقديم لوحة قوية مكونة من 26 علامة تركز على الحالة المناعية للبيئة المكروية للأنسجة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig01.jpg"> الشكل 1: صورة للتحقق من صحة الأجسام المضادة المقترنة حسب الطلب باستخدام هلام بروتين بيس تريس. يظهر الممر 1 من الجل معيار البروتين. يظهر الحارة 2 والحارة 4 أجساما مضادة مقترنة بالباركود (أسهم). يظهر الحارة 3 والحارة 5 أشرطة السلسلة الثقيلة والخفيفة من جسم مضاد غير مقترن (رؤوس الأسهم). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig02.jpg"> الشكل 2: خريطة تكوين لوحة تلطيخ لعينتين من الغطاء. الاختصارات: HB = مخزن مؤقت للترطيب ؛ B = مخفف / كتلة الأجسام المضادة ؛ PSFS = محلول مثبت بعد التلوين ؛ PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ MeOH = الميثانول. S = حل التخزين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig03.jpg"> الشكل 3: تكوين لوحة المراسل. يحتوي كل جسم مضاد مقترن على رمز شريطي مكمل لمراسل معين. لإعداد لوحة المراسل ، يجب إدراج كل جسم مضاد مقترن ومراسله المقابل. بعد ذلك ، يتم تعيين رقم دورة لكل جسم مضاد. يستخدم أداء دورتين فارغتين (C1 و C18) لتقييم مستوى التألق الذاتي في قنوات التألق الثلاث ولطرح الخلفية بعد التصوير باستخدام برنامج التحكم في الحصول على الصور. سيقوم معالج البرامج بفحص الجهاز في هذه المرحلة للتأكد من صحة جميع الإعدادات (الشكل 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig04.jpg"> الشكل 4: الحصول على الصور باستخدام برنامج التحكم لإعداد التجربة . (أ) حدد علامة التبويب التجربة في الزاوية السفلية اليسرى من برنامج التحكم لإعداد الإعداد وبدء تشغيله. (ب، ج) حدد قالب جديد لإدخال الإعدادات التجريبية بمشروع جديد واسم تجربة. (د) تغيير دورة البداية بشكل جيد وعدد الدورات لتعكس موقع المراسل في لوحة المراسل المكونة من 96 بئرا. (ه) تعيين قنوات مضان مناسبة للقنوات الأربع المخصصة للتشغيل التجريبي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig05.jpg"> الشكل 5: تصور الصورة باستخدام البرامج المستندة إلى الويب (QuPath). تعرض نافذة العارض 26 علامة في قسم FFPE لأنسجة اللوزتين الملطخة. تعرض نافذة السطوع والتباين العلامات مع علامات الاختيار. أخيرا ، تعرض نافذة العارض عينة FFPE مع العلامات المحددة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig06.jpg"> الشكل 6: تصور الصورة باستخدام البرامج المستندة إلى الويب. (أ) تم تلطيخ أقسام أنسجة اللوزتين للعلامات ال 26 ، وتم تصوير صور الأقسام بتنسيق QPTIFF باستخدام برنامج عارض الشرائح الرقمي التجاري أو برنامج مفتوح المصدر (QuPath) للتعليق والاستعراض. (ب-و) تم عرض ست علامات في نفس التعليق التوضيحي للحصول على رؤية أفضل للإشارات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig07.jpg"> الشكل 7: مناظر للعلامات الفردية ال 26 المستخدمة مع البرامج المستندة إلى الويب. يظهر تعبير العلامة في أنسجة اللوزتين عن طريق تلطيخ التألق المناعي بلوحة الأورام المناعية (أعلى اليسار). يتم عرض علامات فردية في منطقتين صغيرتين (مستطيلات حمراء). يظهر الإدراج المكبر الخلايا الموجبة لهذه العلامات (الأسهم البيضاء). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig07large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig08.jpg"> الشكل 8: ملخص سير عمل الحصول على الصور المتعددة. تم تلطيخ أقسام أنسجة FFPE باستخدام لوحة الأجسام المضادة 26 متبوعة بتفاعل متعدد الدورات. تمت معالجة الصور الخام للأقسام الملطخة حسابيا ، وتم إجراء كثافة الخلية والتحليل المكاني باستخدام الصور المركبة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig08large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الشكل التكميلي 1: التحقق من صحة IHC في أنسجة اللوزتين. تم تلطيخ أقسام أنسجة FFPE باستخدام جسم مضاد فردي. يظهر تعبير العلامة في نسيج اللوزتين عند تكبير منخفض ، ويظهر الإدراج المكبر الخلايا الموجبة للعلامة (المستطيلات الحمراء). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/Suppl%20Figure.psd" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples at JoVE.c

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

أدى تحليل صور الترميز الشريطي المتعدد مؤخرا إلى تحسين توصيف البيئة المكروية للورم ، مما سمح بإجراء دراسات شاملة لتكوين الخلية والحالة الوظيفية والتفاعلات بين الخلايا والخلايا. هنا ، نصف بروتوكول التلوين والتصوير باستخدام الترميز الشريطي للأجسام المضادة المقترنة قليل النوكليوتيد والتصوير الدائري ، والذي يسمح باستخدام تقنية تحليل الصور عالية الأبعاد.

تحليل صورة التشفير الشريطي المتعدد للتنميط المناعي وتوصيف الخرائط المكانية في تحليل الخلية الواحدة لعينات أنسجة البارافين

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

يسمح الحجم الكبير للمعلومات البيولوجية التي يتم الحصول عليها من تحليل صور التشفير الشريطي المتعدد للعلماء بفهم البيئة المكروية للورم بشكل أفضل ، والتوزيع الخاص داخل الخلايا السرطانية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تعطينا معلومات أكثر تفصيلا من نفس عينة الأنسجة مع إمكانية إجراء تنميط ظاهري أعمق للخلايا الفردية. مكنت هذه الطريقة اللوحات القابلة للتخصيص من دراسة البيئة المكروية للورم لاكتشاف العلامات الحيوية التنبؤية في الأنسجة السرطانية لاستخدامها كعلاج مستهدف جديد.لبدء تلطيخ الأجسام المضادة المترافقة قليل النوكليوتيد ، انقع الغطاء في محلول 0.1٪ Poly-L-Lysine لمدة 24 ساعة ، في درجة حرارة الغرفة لإعدادها لوضع الأنسجة والالتصاق. بعد تصريف محلول Poly-L-Lysine ، اغسل انزلاق الغطاء بماء عالي النقاء لمدة 30 ثانية. بعد الغسيل ، قم بإزالة زلات الغطاء من الماء عالي النقاء وضعها على منشفة خالية من النسالة لتجف طوال الليل.ضع أقساما بسمك 5 ميكرون من الأنسجة ذات الأهمية في وسط زلة غطاء مشحونة من Poly-L-Lysine ، واتركها تجف طوال الليل. سخني حامل انزلاق الغطاء في فرن على حرارة 60 درجة مئوية طوال الليل. ضع قسيمة الغطاء التي تحتوي على أقسام الأنسجة في الحامل المسخن مسبقا.بعد خبزه على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، تحقق للتأكد من ذوبان البارافين بعيدا عن الأنسجة. ضع حامل انزلاق الغطاء الذي يحتوي على العينة بالتتابع بسرعة ، في سلسلة من الحلول. أخيرا ، ضع حامل انزلاق الغطاء في ماء فائق النقاء معالج ب DEPC لمدة جولتين مدة كل منهما خمس دقائق.قم بإعداد غرفة الرطوبة عن طريق وضع منشفة ورقية مبللة بالماء في الجزء السفلي من صندوق طرف ماصة فارغ. املأ قدر الضغط بالماء ، وهو ما يكفي لتغطية نصف ارتفاع دورق سعة 50 ملليلتر. ضع 5 ملليلترات من الميثانول لكل عينة في كأس زجاجية عند 4 درجات سلزية.قم بتخفيف الحجم المطلوب من المخزن المؤقت AR9 إلى 1X باستخدام ثنائي إيثيل بيروكربونات ، أو ماء عالي النقاء معالج ب DEPC. بعد ذلك ، املأ دورقا زجاجيا سعة 50 ملليلترا بحوالي 40 ملليلترا من المخزن المؤقت AR9 المخفف. اغمر العينة في حامل انزلاق الغطاء في الدورق ، وقم بتغطية الدورق بالكامل بورق الألمنيوم.ضع الدورق المغطى بورق الألمنيوم في قدر الضغط المملوء بالماء ، واطهيه في حوالي 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 20 دقيقة. ثم قم بإزالة الدورق وفك غلاف ورق الألمنيوم بعناية. اترك الكأس لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق تقريبا.قم بإزالة حامل انزلاق الغطاء من المخزن المؤقت 1X AR9. احتضانه مرتين في ماء عالي النقاء معالج من قبل DEPC لمدة دقيقتين. وفي الوقت نفسه ، استرجع المخزن المؤقت للترطيب ، ومخفف الأجسام المضادة ، ومحاليل الحجب N و G و J و S من مجموعة تلطيخ التصوير المتعددة.ضع عينة انزلاق الغطاء في 5 ملليلتر من المخزن المؤقت للترطيب مرتين ، لمدة دقيقتين لكل منهما. ثم ضع عينة انزلاق الغطاء في 5 ملليلتر من كتلة مخفف الأجسام المضادة للتصوير المتعدد واحتضانها لمدة 20 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أثناء الحضانة ، قم بإعداد كوكتيل الأجسام المضادة.بعد الحضانة ، ضع زلة الغطاء في غرفة الرطوبة المعدة مسبقا. ماصة 190 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة على عينة انزلاق الغطاء ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات. بعد ذلك ، اغسل العينة مرتين ، كل منهما يحتوي على 5 ملليلتر من كتلة مخفف الأجسام المضادة للتصوير المتعدد لمدة دقيقتين.لإصلاح الأجسام المضادة المرتبطة بالأنسجة ، احتضان زلات الغطاء لمدة 10 دقائق في 16 ٪ الفورمالديهايد المخفف إلى 1.6 ٪مع محلول التخزين ، وغسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. بعد احتضان الغطاء ينزلق لمدة خمس دقائق في الميثانول ، قبل التبريد إلى 4 درجات مئوية. بعد الغسيل ، احتضان انزلاق الغطاء مرة أخرى لمدة 20 دقيقة ، في 5 ملليلتر من الكاشف المثبت المخفف باستخدام PBS ، واغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS قبل التخزين.قم بإعداد المزيج الرئيسي للمراسل باتباع التكوين المذكور في النص. املأ بئرا في صفيحة من 96 بئرا ب 245 ميكرولترا من محلول يحتوي على المزيج الرئيسي للمراسل والفلوروفورات المحددة ذات الرمز الشريطي لتلك الدورة التجريبية. يوضح الشكل تكوين لوحة مراسل مستخدمة هنا للوحة سرطانية.لحماية الفلوروفورات المشفرة بالباركود ، قم بلصق غطاء لوحة رقائق معدنية فوق لوحة المراسل المكونة من 96 بئرا ، وضع اللوحة داخل أداة التصوير متعددة الإرسال. قم بمعايرة تركيز التصوير باستخدام قناة DAPI عن طريق وضع زلة غطاء عينة على مرحلة المجهر وسحب 700 ميكرولتر يدويا من معايرة 1: 1500 لمحلول بقعة نووية على الأنسجة. لتحضير أداة التصوير متعددة الإرسال ، قم بتخفيف المخزن المؤقت للتصوير المتعدد 10X إلى 1X باستخدام الماء عالي النقاء المعالج بواسطة DEPC ، واملأ زجاجات الكاشف بالمحاليل أو المذيبات المناسبة.اضبط جميع معلمات المجهر ، وحدد مناطق الاهتمام على قسيمة غطاء العينة المراد تصويرها. أدخل التصميم التجريبي في برنامج مدير الأدوات. انقر فوق الزر تجربة في برنامج التحكم، وفي نافذة إعداد التجربة وإدارتها، انقر فوق الزر قالب جديد.اكتب اسم المشروع في المساحة المجاورة للزر، وأدخل العدد الإجمالي للدورات. انقر فوق الزر "تعيين القناة" ، واكتب المعلومات الخاصة بكل دورة في الأعمدة ، مثل الدورة الصحيحة ، وأرقام الآبار ، وأماكن Z-stack ، واسم العلامة ، والفئة ، ووقت التعرض لكل دورة. ثم ابدأ التجربة بالنقر على بدء التجربة، واحفظ التجربة.انقر فوق رمز QuPath على الكمبيوتر ، وافتح البرنامج. اسحب ملف qptiff إلى نافذة العارض. انقر فوق زر السطوع والتباين لفتح نافذة تباين السطوع.حدد العلامة أو قم بإلغاء تحديدها في العمود المحدد لإظهار إشارة العلامة أو إخفائها. انقر فوق الزر تكبير / تصغير للملاءمة لتكبير أو تصغير منطقة الاهتمام. عند عرضها باستخدام برنامج تحليل الصور ، أظهرت الصور المركبة جميع العلامات أو العلامات المحددة حسب الرغبة.تم الكشف عن شدة الإشارة والنطاق الديناميكي والتوزيع المكاني لجميع العلامات. سمحت هذه التقنية بتحليل جميع العلامات ال 26 على المستوى تحت الخلوي في قسم نسيج واحد. بعد عملية تحليل الصور المتعددة ، من خلال الأساليب المعلوماتية ، يمكن معالجة وتحليل بيانات الخلية المفردة عالية الأبعاد لاستنتاج البصيرة البيولوجية والسريرية.يعد تحليل صور التشفير الشريطي المتعدد منهجية قوية تمكن العلماء من تحديد سمات أنسجة الورم والإجابة على سؤال بحثهم وفقا للعلامات الموجودة في اللوحات.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

خلية خالية من الحمض النووي تحليل النزاهة في عينات البول

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

الخلية الهدف الجينوم قبل التخصيب وكله التضخيم لتوصيف المصب خلية مفردة

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

طريقة بسيطة وسريعة للحصول على جودة عالية الورم الحمض النووي من العينات السريرية المرضية باستخدام جهائز بصمة اللمس

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

تلطيخ مطاطي على الشرائح جزءا لا يتجزأ من البارافين من أنسجة سرطان المعدة pT3N0M0

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

والرمات التدفق الخلوي مع الخلية الفلورسنت المتوازية لخلية واحدة فقط مما يشير إلى تحليل واكتشاف العلامات البيولوجية

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

تقييم موت الخلية باستخدام الخلايا الخالية من البروبيوتيك في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية القولون والمستقيم

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

رسم خرائط للعلاقات بين الهيكل والوظيفة لعوامل النسخ غير المنضبطة باستخدام التحليل النسخي

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

استخدام تحليل الصور القائم على الكمبيوتر لتحسين القياس الكمي لنقائل الرئة في نموذج سرطان الثدي 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

التنميط المكاني الرقمي لتوصيف البيئة المكروية في الورم الدبقي المتسلل بشكل منتشر من النوع البالغ

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

توسيع فهم البيئة الدقيقة للورم باستخدام تصوير قياس الطيف الكتلي لعينات الأنسجة الثابتة بالفورمالين والبارافين المضمنة

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...