Name: multiplexed barcoding image analysis for immunoprofiling and spatial mapping characterization in the single-cell analysis of paraffin tissue samples
Uploaded: 2023-04-07T13:50:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples at JoVE.c

Forfatterne takker Donald R. Norwood fra Editing Services, Research Medical Library ved MD Anderson for redigering af denne artikel og multiplex IF og billedanalyselaboratoriet i Institut for Translationel Molekylær Patologi ved MD Anderson. Dette projekt blev delvist støttet af Translational Molecular Pathology-Immunoprofiling laboratory (TMP-IL) Moonshots Platform ved Institut for Translationel Molekylær Patologi, University of Texas MD Anderson Cancer Center og NCI Cooperative Agreement U24CA224285 (til MD Anderson Cancer Center CIMAC).

<ol>
	<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+Functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li><li>Labani-Motlagh, A., Ashja-Mahdavi, M., Loskog, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment:+A+milieu+hindering+and+obstructing+antitumor+immune+responses.">The tumor microenvironment: A milieu hindering and obstructing antitumor immune responses.</a> Frontiers in Immunology. 11, 940 (2020).</li><li>Jin, M. Z., Jin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+updated+landscape+of+tumor+microenvironment+and+drug+repurposing.">The updated landscape of tumor microenvironment and drug repurposing.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 166 (2020).</li><li>Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+cancer+immunotherapy:+From+T+cell+basic+science+to+clinical+practice.">A guide to cancer immunotherapy: From T cell basic science to clinical practice.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).</li><li>Black, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CODEX+multiplexed+tissue+imaging+with+DNA-conjugated+antibodies.">CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies.</a> Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).</li><li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+multiplex+immunohistochemistry/immunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy.">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Communications. 40 (4), 135-153 (2020).</li><li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IBEX:+A+versatile+multiplex+optical+imaging+approach+for+deep+phenotyping+and+spatial+analysis+of+cells+in+complex+tissues.">IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455-33465 (2020).</li><li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).</li><li>Eng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+multiplex+imaging+optimization+and+reproducible+analysis.">A framework for multiplex imaging optimization and reproducible analysis.</a> Communications Biology. 5 (1), 438 (2022).</li><li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-institutional+TSA-amplified+multiplexed+immunofluorescence+reproducibility+evaluation+(MITRE)+study.">Multi-institutional TSA-amplified multiplexed immunofluorescence reproducibility evaluation (MITRE) study.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e002197 (2021).</li><li>Binnewies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+tumor+immune+microenvironment+(TIME)+for+effective+therapy.">Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy.</a> Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).</li><li>Heindl, A., Nawaz, S., Yuan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+spatial+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment:+A+new+era+for+digital+pathology.">Mapping spatial heterogeneity in the tumor microenvironment: A new era for digital pathology.</a> Laboratory Investigation. 95 (4), 377-384 (2015).</li><li>Kuswanto, W., Nolan, G., Lu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+spatial+profiling+with+CODEX:+bioinformatic+analysis+and+application+in+human+disease.">Highly multiplexed spatial profiling with CODEX: bioinformatic analysis and application in human disease.</a> Seminars in Immunopathology. 45 (1), 145-157 (2022).</li><li>Phillips, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+topography+predicts+response+to+PD-1+blockade+in+cutaneous+T+cell+lymphoma.">Immune cell topography predicts response to PD-1 blockade in cutaneous T cell lymphoma.</a> Nature Communications. 12 (1), 6726 (2021).</li><li>Jhaveri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+ultrahigh-plex+spatial+phenotyping+of+human+cancer+tissues.">Deep ultrahigh-plex spatial phenotyping of human cancer tissues.</a> Cancer Research. 82, 3877 (2022).</li><li>Goltsev, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+profiling+of+mouse+splenic+architecture+with+CODEX+multiplexed+imaging.">Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging.</a> Cell. 174 (4), 968-981 (2018).</li><li>Yuan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Spatial heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6 (8), a026583 (2016).</li><li>Bruck, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+immunoprofiling+of+the+intratumoral+and+peritumoral+tissue+of+renal+cell+carcinoma+patients.">Spatial immunoprofiling of the intratumoral and peritumoral tissue of renal cell carcinoma patients.</a> Modern Pathology. 34 (12), 2229-2241 (2021).</li><li>Tsujikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+spatial+immune+profiles+in+human+solid+cancers.">Prognostic significance of spatial immune profiles in human solid cancers.</a> Cancer Science. 111 (10), 3426-3434 (2020).</li><li>Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunofluorescence+and+multispectral+imaging:+forming+the+basis+of+a+clinical+test+platform+for+immuno-oncology.">Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 674747 (2021).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+immune+landscapes+using+an+automated+nine-color+multiplex+immunofluorescence+staining+panel+and+image+analysis+in+paraffin+tumor+tissues.">Identification of distinct immune landscapes using an automated nine-color multiplex immunofluorescence staining panel and image analysis in paraffin tumor tissues.</a> Scientific Reports. 11 (1), 4530 (2021).</li><li>Elaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+dimensional+imaging+mass+cytometry+panel+to+visualize+the+tumor+immune+microenvironment+contexture.">High dimensional imaging mass cytometry panel to visualize the tumor immune microenvironment contexture.</a> Frontiers in Immunology. 12, 666233 (2021).</li><li>Campos Clemente, L., Shi, O., Rojas, F., Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+comprehension+of+the+tumor+microenvironment+using+mass+spectrometry+imaging+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+samples.">Expanding the comprehension of the tumor microenvironment using mass spectrometry imaging of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64015 (2022).</li><li>Schurch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+cellular+neighborhoods+orchestrate+antitumoral+immunity+at+the+colorectal+cancer+invasive+front.">Coordinated cellular neighborhoods orchestrate antitumoral immunity at the colorectal cancer invasive front.</a> Cell. 182 (5), 1341-1359 (2020).</li><li>Phillips, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+phenotyping+of+immunoregulatory+proteins+in+the+tumor+microenvironment+by+CODEX+tissue+imaging.">Highly multiplexed phenotyping of immunoregulatory proteins in the tumor microenvironment by CODEX tissue imaging.</a> Frontiers in Immunology. 12, 687673 (2021).</li><li>Hickey, J. W., Tan, Y., Nolan, G. P., Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+accurate+cell+type+identification+in+CODEX+multiplexed+imaging+data.">Strategies for accurate cell type identification in CODEX multiplexed imaging data.</a> Frontiers in Immunology. 12, 727626 (2021).</li><li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+and+analyze+the+cellular+spatial+distribution+extracted+from+multiplex+immunofluorescence+data+to+understand+the+tumor+microenvironment.">Methods to determine and analyze the cellular spatial distribution extracted from multiplex immunofluorescence data to understand the tumor microenvironment.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 668340 (2021).</li><li>Tzoras, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+tumor-immune+microenvironment+in+breast+cancer+at+a+spatial+and+multiplex+resolution.">Dissecting tumor-immune microenvironment in breast cancer at a spatial and multiplex resolution.</a> Cancers. 14 (8), 1999 (2022).</li><li>Francisco-Cruz, A., Parra, E. R., Tetzlaff, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wistuba,+II.+Multiplex+immunofluorescence+assays.">Wistuba, II. Multiplex immunofluorescence assays.</a> Methods in Molecular Biology. 2055, 467-495 (2020).</li><li>Shakya, R., Nguyen, T. H., Waterhouse, N., Khanna, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+contexture+analysis+in+immuno-oncology:+applications+and+challenges+of+multiplex+fluorescent+immunohistochemistry.">Immune contexture analysis in immuno-oncology: applications and challenges of multiplex fluorescent immunohistochemistry.</a> Clinical and Translational Immunology. 9 (10), e1183 (2020).</li><li>Wilson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+the+statistical+analysis+of+multiplex+immunofluorescence+data.">Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data.</a> Cancers. 13 (12), 3031 (2021).</li><li>DeRosa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+a+new+standard+for+spatial+omics:+An+integrated+multiomics+approach:+every+single+cell,+two+different+analytes,+one+unbiased+picture.">Setting a new standard for spatial omics: An integrated multiomics approach: every single cell, two different analytes, one unbiased picture.</a> Genetic Engineering &amp; Biotechnology News. 42, 26-28 (2022).</li><li>Simonson, P. D., Valencia, I., Patel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide-conjugated+DNA+barcodes+enable+signal+amplification+for+multiparametric+CODEX+imaging.">Tyramide-conjugated DNA barcodes enable signal amplification for multiparametric CODEX imaging.</a> Communications Biology. 5 (1), 627 (2022).</li></ol>

Forfatterne har ingen konflikter at afsløre.

TME spiller en væsentlig rolle i kræftudvikling, progression og behandlingsrespons. Derudover kan tætheden af specifikke tumorinfiltrerende lymfocytundergrupper i TME tjene som en prognostisk biomarkør for visse typer kræft. Bemærkelsesværdigt kan en tumors rumlige egenskaber ud over TME's cellulære sammensætning give en oversigt til forståelse af tumorens biologi og identifikation af potentielle prognostiske biomarkører12,17.
Da mange immuncellepopulationer er involveret i procancer- eller anticancerresponser, vil en bedre forståelse af disse celler og deres rumlige forhold til hinanden og med kræftceller hjælpe med at guide identifikationen af nye immunterapeutiske strategier. Tidligere undersøgelser har stratificeret placeringen og den rumlige fordeling af TME-celler baseret på vævsstrukturen i de intratumorale og peritumorale områder og tumorcellernes invasive margener18,19. I løbet af de sidste 15 år har teknologiske fremskridt gjort fænotypisk analyse af individuelle celler baseret på deres rumlige spredning til et nyt, indflydelsesrigt værktøj til at studere TME og kategorisere potentielle biomarkører for tumorimmunterapi. Multiplex IF histokemi kan samtidig estimere flere biologiske markører20.
I lighed med oligonukleotid-konjugeret antistofstrategi anvendes fire typer proteinbaserede multiplexplatforme til at studere TME: kromogen-, fluorescens-, DNA-stregkode- og metalisotopmærkede antistofdetekteringssystemer. De omkostningseffektive kromogene IHC-platforme muliggør heldiasvisualisering og patologisk vurdering ved hjælp af konventionel lysfeltmikroskopi. I multiplexet IF og IHC anvendes antistoffer konjugeret med fluoroforer. Multiplex IF/IHC-platformen detekterer antistoffer med høj specificitet og kan kvantificere målrettede antistoffer selv på subcellulært niveau 6,21. På grund af kromogenernes og fluoroforernes natur kan brugen af et antistofpanel desuden fange ekspressionen af op til 10 biomarkører på et enkelt dias. På metalisotopbaserede platforme anvendes metalmærkede antistoffer til at udføre multiplekset billeddannelse med enkeltcelle- og rumlig opløsning og høj følsomhed for individuelle vævssektioner22. Teoretisk set muliggør disse metalkonjugerede antistofmetoder samtidig påvisning af mere end 100 biomarkører på en enkelt vævssektion. En udfordring ved isotopmærkningsteknikken er isobarisk interferens, som forhindrer 100% renhed af berigelse i at blive nået23. Desuden øges interferensen, når antallet af markører øges. DNA-konjugerede antistofdetekteringsplatforme genkender antistoffer mærket med unikke DNA-stregkoder. Mere end 40 biomarkører kan fanges samtidigt med høj specificitet på disse platforme6.
Multiplexed imaging er en kommercielt tilgængelig DNA-stregkodemærket antistofdetekteringsplatform til påføring af DNA-konjugerede antistoffer på et enkelt vævsglas i et trin (figur 8). Til vævsforberedelsesfasen, i modsætning til den multipleksede ionstrålebilleddannelsesplatform, som kræver brug af guldbelagte dias opnået fra producenter, kræver den multipleksede billeddannelsesplatform kun regelmæssige dæksedler eller dias belagt med 0,1% poly-L-lysin for at hjælpe vævet med at klæbe til det og holde vævet intakt under farvnings- og billeddannelsesprocessen. Brug af vævssektioner på dæksedler inden for 4 uger efter sektionering anbefales, da langvarig opbevaring af ufarvede dias resulterer i antigenicitetsreduktion. En farvet dækslipprøve kan opbevares i opbevaringsbuffer ved 4 °C i op til 2 uger uden at miste farvesignalet. Der kræves ikke specielt udstyr til opbevaring af dækslipprøverne. Det multipleksede billeddannelsessystem er blevet opgraderet til at bruge almindelige dias i stedet for dæksedler, hvilket muliggør farvning af større væv og nem håndtering. Ved anvendelse af en reduktionsopløsning til antistofkonjugering (trin 3.2.3) bør reaktionen begrænses til højst 30 min for at forhindre beskadigelse af antistoffer. De blokerende buffere i trin 5.6.6 skal være frisklavede, og blokeringsbufferne må ikke genbruges.
Sammenlignet med kromogen-, fluorescens- og metalisotopmærkede multiplex-antistofdetekteringsplatforme har den multipleksede billeddannelsesteknologi visse fordele. For eksempel er mere end 60 foruddesignede antistofpaneler til multiplexbilleddannelse kommercielt tilgængelige, hvilket hjælper med at spare tid og omkostninger ved antistofkonjugering og validering, og antallet af foruddesignede antistofpaneler vokser. Disse antistoffer, som omfatter carcinommarkøren pan-cytokeratin, melanommarkøren SOX10, den vaskulære markør CD31, stromalmarkøren SMA og adskillige immuncellemarkører, er valideret og eksperimentklar. For antistoffer, der ikke er prædesignet, er det kommercielt tilgængelige konjugationssæt designet til brug med multiplexbilleddannelse ligetil og brugervenligt. Kundekonjugerede antistoffer er gode i 1 år, når de opbevares ved 4 °C. Derudover kræves der ikke maskinopvarmning for at tage billederne. I denne multipleksede billeddannelsesteknologi resulterer de iterative vaske-, hybridiserings- og stripping-trin i billedoptagelsen sjældent i nedsat markørintensitet eller nedbrudt vævsmorfologi 5,24,25. Desuden optages sammensatte billeder i QPTIFF-format med et simpelt trefarvet fluorescensmikroskop og kan uploades og analyseres ved hjælp af tredjeparts digital analysesoftware. Farvningsmarkørerne kan visualiseres ved enkeltcelleopløsning, og cellefænotyper kan karakteriseres via co-lokalisering af markørerne (figur 6 og figur 7). Den omfattende analyse af et multiplekset billede afslører yderligere vævsrummene, kvantificering af enkeltcellemarkører og nærmeste nabo- og nærhedsdata (figur 8).
En udfordring i multiplekset billedanalyse er celletypeidentifikation. Normalt, når flere enkeltobjektklassifikatorer anvendes på et billede, vil mere usædvanlige fænotyper blive kommenteret. Derfor anbefales det at bruge kendte markører, der ikke er co-udtrykt i den samme klassifikator, og kun anvende den fænotyperelaterede klassifikator til annoteringen af enkeltceller. Variationer i celletypeannotation vil resultere i væsentligt forskellige rumlige resultater, såsom forskelle i cellerumlig fordeling og cellulær kvarteranalyse26,27.
Multiplexed billedanalyse har vist sig at være vellykket til farvning og billeddannelse af mange prøvetyper, herunder FFPE-væv, frisk frosset væv, arkiverede hele dias og vævsmikroarrays. Multiplexede billeder af bryst-, hjerne-, lunge-, milt-, nyre-, lymfeknude- og hudvævssektioner kan erhverves med dybe enkeltcellede rumlige fænotypedata 5,16,25,28.
I fremtiden forventes flere prædesignede antistoffer til multiplekset billeddannelse. Derudover er udviklingen af specifik software til multiplexet billedanalyse meget nødvendig. I øjeblikket findes der mange kommercielt tilgængelige og open source-softwareprogrammer til Hi-Plex-billedanalyse29, men forskere har stadig brug for hjælp til at skabe en standardarbejdsgang for disse analyser30,31. Selvom de sammensatte billeder, der er taget ved hjælp af denne protokol, er kompatible med tredjepartssoftware, kan dette resultere i ekstra omkostninger for brugeren. En anden ulempe ved den multipleksede billeddannelsesteknologi er signalreduktionen i nuklear proteindetektion efter iterativ vask, hybridisering og stripping med store paneler af antistoffer. Heldigvis kan dette minimeres ved at hente de stregkodede fluoroforer i tidlige cyklusser, når reporterpladerne designes. For nylig blev denne platform opgraderet med et nyt højhastighedsscanningssystem, hvilket dramatisk har reduceret tiden til at opnå sammensatte billeder32. Derudover er en ny strategi ved hjælp af tyramidkonjugerede stregkoder blevet rapporteret for at forbedre oligonukleotid-konjugeret antistof-stregkodningsbaseret billeddannelse. Denne teknologi har til formål at forstærke farvningssignaler, for hvilke stregkodekonjugerede antistoffer er vanskelige at opnå33.

Tumormikromiljøet (TME) er ekstremt heterogent og består af tumorceller, tumorstromale celler, immunceller, ikke-cellulære komponenter i den ekstracellulære matrix og talrige rigelige molekyler produceret og frigivet af tumor-, stromale og immunceller 1,2. Akkumulerende beviser viser, at TME har en central rolle i omprogrammering af tumordifferentiering, vækst, invasion, metastase og respons på terapier3.
At forstå, hvordan forskellige celletyper i TME interagerer og kommunikerer med hinanden gennem signalnetværk, er afgørende for at forbedre kræftdiagnosen, optimere immunterapi og udvikle nye behandlinger4. Traditionelle vævsmikroskopiteknikker, herunder immunhistokemi (IHC) og immunofluorescens (IF), er blevet brugt i årtier til at studere celletyper, overflod og kommunikation i tumorprøver. Desværre kan disse teknikker typisk kun evaluere en eller to proteinmarkører i et vævsafsnit og kan ikke afsløre de komplekse rumlige og strukturelle forhold mellem disse celler 5,8,7.
I løbet af de sidste to årtier er der etableret flere multipleksede billedteknologier8. Disse teknologier giver meget bedre overblik over immuncellernes sammensætning, funktion og placering i TME'en, hvilket fører til hurtige fremskridt i evnen til at identificere og profilere komplekse TME'er rumligt på enkeltcelleniveau 9,10. De rumlige og strukturelle forhold mellem forskellige tumor- og immunceller i TME er nu i spidsen for biologiske og kliniske undersøgelser ved hjælp af disse multipleksede billeddannelsesteknologier11,12.
Den nyligt udviklede multipleksede billeddannelsesteknologi ved hjælp af oligonukleotidkonjugeret antistofkodning er en indflydelsesrig enkeltcelle biologisk forskningsplatform baseret på påvisning af oligonukleotidkonjugerede antistoffer i formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) prøver13,14. I øjeblikket giver denne multipleksede billeddannelsesteknologi mulighed for samtidig billeddannelse af mere end 100 markører i en enkelt vævssektion15, hvilket har øget antallet af celletyper, der kan skelnes in situ. Dette muliggør et niveau af rumlig analyse af tumor- og immunceller, der ikke er muligt ved hjælp af traditionelle immunofænotypemetoder16.
Heri beskriver vi en optimeret protokol til konjugering af oprensede antistoffer mod oligonukleotider og validering af denne konjugering ved hjælp af den multipleksede billeddannelsesplatform og en multicyklusbilleddannelsesprocedure med FFPE-væv. Derudover beskriver vi de grundlæggende billedbehandlings- og dataanalyseprocedurer, der anvendes med denne teknologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x AR9 Buffer</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>AR900250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Buffer</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>7000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Antibody Diluent/Block</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>ARD1001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Conjugation Kit</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>7000009</td>
			<td>Contains Filter Blocking Solution, Antibody Reduction Solution 1, Antibody Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution, Antibody Storage Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Reagent</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>7000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40718-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Avantor/VWR</td>
			<td>BDH1115-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G Blocker V2</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>240199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoclear</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-329-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Integral 10&#160;</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>ZRXQ010WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niknon Fluorescence microscope</td>
			<td>Keyence Corp. of America</td>
			<td>BZ-X810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>7000003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoCycler Barcodes/Reporters Combination</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>5450004 (BX025/RX025)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5450003 (BX022/RX022)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5450023 (BX002/RX002)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;5250002 (BX020/RX020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2520003 (BX023/RX023)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5250005 (BX029/RX029)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5250007 (BX035/RX035)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5250012 (BX052/RX052)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5550012 (BX030/RX030)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5550015 (BX042/RX042)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5550014 (BX036/RX036)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuPath</td>
			<td>Open-Source</td>
			<td>https://qupath.github.io/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC6065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Kit</td>
			<td>(Akoya Biosciences</td>
			<td>7000008</td>
			<td>Contains Hydration Buffer, N Blocker, J Blocker, S Blocker, Fixative Reagent, Storage Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed barcoding image analysis for immunoprofiling and spatial mapping characterization in the single-cell analysis of paraffin tissue samples

Multiplexed billeddannelsesteknologi ved hjælp af antistofstregkodning med oligonukleotider, som sekventielt detekterer flere epitoper i samme vævssektion, er en effektiv metode til tumorevaluering, der forbedrer forståelsen af tumormikromiljøet. Visualiseringen af proteinekspression i formalinfikserede, paraffinindlejrede væv opnås, når en specifik fluorofor udglødes til en antistofbundet stregkode via komplementære oligonukleotider, og derefter udføres prøvebilleddannelse; Faktisk tillader denne metode brugen af tilpassede paneler med mere end 40 antistoffer i en enkelt vævsfarvningsreaktion. Denne metode er kompatibel med frisk frosset væv, formalinfikseret, paraffinindlejret væv, dyrkede celler og mononukleære celler i perifert blod, hvilket betyder, at forskere kan bruge denne teknologi til at se en række prøvetyper ved enkeltcelleopløsning. Denne metode starter med en manuel farvnings- og fastgørelsesprotokol, og alle antistofstregkoder påføres ved hjælp af en antistofcocktail. Farvningsfluidikinstrumentet er fuldt automatiseret og udfører iterative cyklusser med mærkning, billeddannelse og fjernelse af spektralt forskellige fluoroforer, indtil alle biomarkører er blevet afbildet ved hjælp af et standard fluorescensmikroskop. Billederne indsamles og kompileres derefter på tværs af alle billeddannelsescyklusser for at opnå enkeltcelleopløsning for alle markørerne. Enkelttrinsfarvning og skånsom fjernelse af fluorofor giver ikke kun mulighed for stærkt multiplekset biomarkøranalyse, men bevarer også prøven til yderligere nedstrømsanalyse, hvis det ønskes (f.eks. Hæmatoxylin og eosinfarvning). Desuden muliggør billedanalysesoftwaren billedbehandling-drift kompensation, baggrundssubtraktion, cellesegmentering og klyngedannelse - samt visualisering og analyse af billeder og cellefænotyper til generering af rumlige netværkskort. Sammenfattende anvender denne teknologi et computeriseret mikrofluidiksystem og fluorescensmikroskop til iterativt at hybridisere, afbilde og strippe fluorescerende mærkede DNA-sonder, der er komplementære til vævsbundne, oligonukleotidkonjugerede antistoffer.

Vi anvendte FFPE-tonsillprøver til at udvikle et 26-markør immunonkologisk panel til at illustrere immunstatus for FFPE-væv ved hjælp af et stregkodebilledanalysesystem. Samlet set anvendes 19 antistoffer i øjeblikket i andre multipleksede billeddannelsesundersøgelser i vores laboratorium. Alle markørerne er testet ved hjælp af FFPE-væv med kromogen IHC. Alle antistofferne blev konjugeret til unikke DNA-oligonukleotider. Når dækslerne opsættes ved hjælp af den webbaserede instrumentstyring (figur 4) til denne stregkodebilledanalyseteknologi, skal det bemærkes, at den første og sidste cyklus altid er "blank" (figur 2 og figur 4), hvilket giver baggrundsfluorescenssignalerne, der skal trækkes fra de specifikke signaler fra antistofferne. Efter billeder i QPTIFF-format er blevet indsamlet med fluorescensmikroskopet, kan de visualiseres ved hjælp af flere patenterede automatiserede billedanalysesoftware eller open source-softwareprogrammer. Sammensatte billeder kan vise alle markører eller markerede markører for en bedre visning af signalerne (figur 5). Desuden kan hvert antistof visuelt evalueres for nuklear, cytoplasmatisk eller membranøs lokalisering. Immun-, tumor- og stromale celler kan let identificeres. Derefter kan billedanalyse give information om signalintensiteten, det dynamiske område og den rumlige fordeling af alle markørerne (figur 6). Denne teknik tillod os at analysere alle 26 markører på subcellulært niveau i et enkelt vævsafsnit (figur 7). Ved at analysere markørernes co-lokalisering kunne vi identificere de cellulære fænotyper, lokalisere den rumlige celleposition, beregne afstanden mellem celler og finde fordelingen af cellerne. Den afgørende virkning af denne teknologi er præsentationen af et robust 26 markørpanel med fokus på immunstatus i vævsmikromiljøet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig01.jpg"> Figur 1: Billede af brugerdefineret konjugeret antistofvalidering ved hjælp af en Bis-Tris proteingel. Bane 1 i gelen viser proteinstandarden. Bane 2 og bane 4 viser stregkodekonjugerede antistoffer (pile). Bane 3 og bane 5 viser de tunge og lette kædebånd fra et ukonjugeret antistof (pilespidser). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig02.jpg"> Figur 2: Konfigurationskort over farvningspladen for to dækselprøver. Forkortelser: HB = hydreringsbuffer; B = antistoffortyndingsmiddel/blok PSFS = fikseringsopløsning efter farvning; PBS = fosfatbufret saltvand MeOH = methanol; S = opbevaringsløsning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig03.jpg"> Figur 3: Konfiguration af reporterplade. Hvert konjugeret antistof har en stregkode, der er komplementær til en bestemt reporter. For at opsætte reporterpladen skal hvert konjugeret antistof og dets tilsvarende reporter angives. Dernæst tildeles hvert antistof et cyklusnummer. Udførelsen af to blindcykler (C1 og C18) bruges til at evaluere niveauet af autofluorescens i de tre fluorescenskanaler og til post-imaging baggrundssubtraktion ved hjælp af billedoptagelseskontrolsoftwaren. En softwareguide kontrollerer instrumentet på dette tidspunkt for at sikre, at alle indstillinger er korrekte (figur 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig04.jpg"> Figur 4: Billedoptagelse ved hjælp af kontrolsoftwaren til eksperimentopsætningen. (A) Vælg fanen Eksperiment i nederste venstre hjørne af kontrolsoftwaren for at forberede og starte opsætningen. (B,C) Vælg Ny skabelon for at indtaste eksperimentindstillingerne med et nyt projekt- og eksperimentnavn. (D) Skift startcyklusbrønden og antallet af cyklusser for at afspejle reporterens placering i 96-brønds reporterpladen. E) Tildel de korrekte fluorescenskanaler til de fire kanaler, der er udpeget til forsøgskørslen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig05.jpg"> Figur 5: Billedvisualisering ved hjælp af webbaseret software (QuPath). Fremviservinduet viser 26 markører i FFPE-sektionen med farvet mandelvæv. Vinduet Lysstyrke & kontrast viser mærkerne med fluebenet. Endelig viser fremviservinduet FFPE-prøven med de valgte markører. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig06.jpg"> Figur 6: Billedvisualisering ved hjælp af webbaseret software. (A) Tonsillvævssektioner blev farvet til de 26 markører, og billederne af sektionerne i QPTIFF-format blev visualiseret ved hjælp af kommerciel digital diasfremvisersoftware eller open source-software (QuPath) til annotering og gennemgang. (B-F) Seks markører blev vist i samme kommentar for bedre visning af signalerne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig07.jpg"> Figur 7: Visninger af de 26 individuelle markører, der bruges med webbaseret software. Markørekspressionen i mandelvævet vises via immunofluorescensfarvning med et immunonkologisk panel (øverst til venstre). Individuelle markører i to små områder (røde rektangler) vises. Det indzoomede indlæg viser celler, der er positive for disse markører (hvide pile). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig08.jpg"> Figur 8: Oversigt over arbejdsprocessen for multiplekset billedoptagelse. FFPE-vævssektioner blev farvet ved hjælp af 26-antistofpanelet efterfulgt af en multicyklusreaktion. Råbilleder af de farvede sektioner blev beregningsmæssigt behandlet, og en celletæthed og rumlig analyse blev udført ved hjælp af de sammensatte billeder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig08large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende figur 1: IHC-validering i mandlvæv. FFPE-vævssektioner blev farvet under anvendelse af et individuelt antistof. Markørudtrykket i mandelvævet vises ved lav forstørrelse, og det zoomede skær viser celler, der er positive for markøren (røde rektangler). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/Suppl%20Figure.psd" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples at JoVE.c

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed stregkode billedanalyse har for nylig forbedret karakteriseringen af tumormikromiljøet, hvilket tillader omfattende undersøgelser af cellesammensætning, funktionel tilstand og celle-celle-interaktioner. Heri beskriver vi en farvnings- og billeddannelsesprotokol ved hjælp af stregkoden af oligonukleotidkonjugerede antistoffer og cyklusbilleddannelse, som muliggør anvendelse af en højdimensionel billedanalyseteknik.

Multiplexed stregkode billedanalyse til immunprofilering og rumlig kortlægning karakterisering i enkeltcelleanalyse af paraffinvævsprøver

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Den store mængde biologisk information, der opnås fra multiplex-stregkodebilledanalysen, gør det muligt for forskere at forstå tumormikromiljøet bedre og den særlige fordeling inden for tumorceller. Den største fordel ved denne metode er, at den giver os meget mere detaljerede oplysninger fra den samme vævsprøve med mulighed for at lave dybere fænotypning af individuelle celler. Denne metode gjorde det muligt for paneler, der kan tilpasses, at studere tumormikromiljø for potentielt at opdage prædiktiv biomarkør i kræftvæv til brug som ny målbehandling.For at starte oligonukleotidkonjugeret antistoffarvning blødlægges dækslet i 0,1% Poly-L-lysinopløsning i 24 timer ved stuetemperatur for at forberede dem til vævsplacering og vedhæftning. Efter dræning af Poly-L-lysinopløsningen vaskes dækslet med ultrarent vand i 30 sekunder. Efter vask skal du fjerne dækselsedlerne fra det ultrarene vand og lægge dem på et fnugfrit håndklæde for at tørre natten over.Placer 5 mikron tykke sektioner af vævet af interesse på midten af en Poly-L-lysinladet dæksel, og lad dem tørre natten over. Forvarm en dækselholder i en ovn ved 60 grader Celsius natten over. Anbring dækselsedlen med vævssektioner i den forvarmede holder.Efter at have bagt det ved 60 grader Celsius i 30 minutter, skal du kontrollere, at paraffinen er smeltet væk fra vævet. Placer hurtigt dækselholderen, der indeholder prøven, sekventielt i en række løsninger. Til sidst placeres dækselholderen i DEPC-behandlet ultrarent vand i to runder på fem minutter hver.Forbered et fugtighedskammer ved at placere et vandgennemblødt køkkenrulle i bunden af en tom pipettespidsboks. Fyld en trykkoger med vand, nok til at dække halvdelen af højden på et 50 ml bægerglas. 5 ml methanol pr. prøve anbringes i et bægerglas ved 4 grader Celsius.Fortynd det krævede volumen AR9-buffer til 1X med diethylpyrocarbonat eller DEPC-behandlet ultrarent vand. Fyld derefter et 50 ml glasbægerglas med ca. 40 ml af den fortyndede AR9-buffer. Nedsænk prøven i dækselholderen i bægerglasset, og dæk bægerglasset helt med aluminiumsfolie.Anbring det aluminiumsfoliedækkede bægerglas i den vandfyldte trykkoger, og kog ved ca. 15 PSI i 20 minutter. Fjern derefter bægerglasset, og pak forsigtigt aluminiumsfolien ud. Bægerglasset afkøles ved stuetemperatur i ca. 10 minutter.Fjern dækselholderen fra 1X AR9-bufferen. Inkuber det to gange i DEPC-behandlet ultrarent vand i to minutter. I mellemtiden hentes hydreringsbufferen, antistoffortyndingsmidlet og blokeringsopløsningerne N, G, J og S fra det multipleksede billeddannelsesfarvningssæt.Anbring dækslipprøven i 5 ml hydreringsbuffer to gange i to minutter hver. Derefter anbringes dækselprøven i 5 ml af den multipleksede billeddannende antistoffortyndingsblok og inkuberes i 20 til 30 minutter ved stuetemperatur. Under inkubationen skal du forberede antistofcocktailen.Efter inkubation skal du placere dækslet i det tidligere forberedte fugtighedskammer. Der pipetteres 190 mikroliter antistofcocktail på dækselprøven, og den inkuberes ved stuetemperatur i tre timer. Derefter vaskes prøven to gange, hver med 5 ml af den multipleksede billeddannende antistoffortyndingsblok i to minutter.For at fastgøre de bundne antistoffer mod vævet inkuberes dækselsedlerne i 10 minutter i 16% formaldehyd fortyndet til 1,6% med opbevaringsopløsning og vaskes tre gange med PBS. Efter inkubation glider dækslet i fem minutter i methanol, forafkøles til 4 grader Celsius. Efter vasken inkuberes dækslet igen i 20 minutter i 5 ml fikseringsreagens fortyndet med PBS og vaskes tre gange med PBS inden opbevaring.Forbered reportermastermixet efter den sammensætning, der er nævnt i teksten. Fyld en brønd i en plade med 96 brønde med 245 mikroliter af en opløsning indeholdende reportermasterblandingen og de specifikke stregkodede fluoroforer for den eksperimentelle cyklus. Figuren viser en reporterpladekonfiguration, der her bruges til et karcinompanel.For at beskytte de stregkodede fluoroforer skal du klæbe et foliepladedæksel over 96-brønds reporterpladen og placere pladen i det multipleksede billeddannelsesinstrument. Kalibrer billeddannelsens fokus ved hjælp af DAPI-kanalen ved at placere en prøvedækselseddel på mikroskoptrinnet og manuelt pipettere 700 mikroliter af en 1:1500-titrering af en nuklear pletopløsning på vævet. For at forberede det multipleksede billeddannelsesinstrument fortyndes 10X multiplekset billedbuffer til 1X ved hjælp af DEPC-behandlet ultrarent vand og fyldes reagensflasker med passende opløsninger eller opløsningsmidler.Indstil alle mikroskopparametrene, og vælg de interessante områder på prøvedækslet, der skal afbildes. Indtast det eksperimentelle design i instrumentstyringssoftwaren. Klik på knappen Eksperiment i kontrolsoftwaren, og klik på knappen Ny skabelon i vinduet Eksperimentopsætning og -administration.Skriv projektnavnet i området ud for knappen Projekt, og angiv det samlede antal cyklusser. Klik på knappen Kanaltildeling, skriv oplysningerne for hver cyklus i kolonnerne, såsom den korrekte cyklus, brøndnumre, Z-stack-steder, markørnavn, klasse og eksponeringstid for hver cyklus. Start derefter eksperimentet ved at klikke på Start eksperiment, og gem eksperimentet.Klik på QuPath-ikonet på computeren, og åbn softwaren. Træk qptiff-filen til fremviservinduet. Klik på knappen Lysstyrke og kontrast for at åbne vinduet Lysstyrkekontrast.Markér eller fjern markeringen af markøren i den valgte kolonne for at vise eller skjule markørsignalet. Klik på knappen zoom for at tilpasse for at zoome ind eller ud af interesseområdet. Når de blev vist ved hjælp af billedanalysesoftware, viste de sammensatte billeder alle markører eller valgte markører som ønsket.Signalintensiteten, det dynamiske område og den rumlige fordeling af alle markørerne blev afsløret. Denne teknik tillod analysen af alle 26 markører på subcellulært niveau i en enkelt vævssektion. Efter multiplexbilledanalyseprocessen kan informatiske tilgange behandle og analysere de højdimensionelle enkeltcelledata for at udlede biologisk og klinisk indsigt.Multiplexing stregkodebilledanalyse er en kraftfuld metode, der gør det muligt for forskere at profilere tumorvæv og besvare deres forskningsspørgsmål i henhold til markørerne i panelerne.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Cell-Free DNA Integritet Analyse i urinprøver

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Target Cell pre berigelse og hele genom forstærkning for enkelt celle Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Enkel og hurtig metode til at opnå høj kvalitet Tumor DNA fra klinisk-patologisk prøvemateriale ved hjælp af Touch aftryk cytologi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastisk farvning på paraffin-indlejrede slides af pT3N0M0 gastrisk Cancer væv

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Phospho flowcytometri med fluorescerende celle stregkodesystem for enkelt celle signalering analyse og biomarkør opdagelse

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering cell død ved hjælp af cellefri supernatant af probiotika i tre-dimensionelle sfæroid kulturer colorectal cancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Kortlægning af strukturfunktionsforhold for uordnede onkogene transskriptionsfaktorer ved hjælp af transskriptomisk analyse

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Brug computer-baseret billedanalyse til at forbedre kvantificeringen af lungemetastase i 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Digital rumlig profilering til karakterisering af mikromiljøet i voksentype diffust infiltrerende gliom

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Udvidelse af forståelsen af tumormikromiljøet ved hjælp af massespektrometribilleddannelse af formalinfaste og paraffinindlejrede vævsprøver

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...