Name: multiplexed barcoding image analysis for immunoprofiling and spatial mapping characterization in the single-cell analysis of paraffin tissue samples
Uploaded: 2023-04-07T13:50:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples at JoVE.c

저자는 이 기사를 편집한 MD Anderson의 Research Medical Library의 편집 서비스의 Donald R. Norwood와 MD Anderson의 중개 분자 병리학과의 다중 IF 및 이미지 분석 실험실에 감사드립니다. 이 프로젝트는 중개 분자 병리학과의 TMP-IL(Translational Molecular Pathology-Immunoprofiling laboratory) Moonshots Platform, 텍사스 대학교 MD 앤더슨 암 센터 및 NCI 협력 계약 U24CA224285(MD Anderson Cancer Center CIMAC에 제공)의 일부 지원을 받았습니다.

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저자는 공개 할 갈등이 없습니다.

TME는 암 발병, 진행 및 치료 반응에 필수적인 역할을 합니다. 또한, TME에서 특정 종양 침윤 림프구 하위 집합의 밀도는 특정 유형의 암에 대한 예후 바이오마커 역할을 할 수 있습니다. 놀랍게도, TME의 세포 조성 외에도 종양의 공간적 특성은 종양의 생물학을 이해하고 잠재적인 예후 바이오마커를 식별하기 위한 개요를 제공할 수 있습니다12,17.
수많은 면역 세포 집단이 전암 또는 항암 반응에 관여하기 때문에 이러한 세포와 서로 및 암세포와의 공간적 관계에 대한 더 나은 이해는 새로운 면역 치료 전략을 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 이전 연구에서는 종양 내 및 주위 영역의 조직 구조와 종양 세포의 침습성 가장자리를 기반으로 TME 세포의 위치 및 공간 분포를 계층화했습니다18,19. 지난 15년 동안 기술 발전으로 인해 공간 분산을 기반으로 한 개별 세포의 표현형 분석은 TME를 연구하고 종양 면역 요법을 위한 잠재적 바이오마커를 분류하기 위한 새롭고 영향력 있는 도구가 되었습니다. 멀티플렉스 IF 조직화학은 다수의 생물학적 마커를 동시에 추정할 수 있다20.
올리고뉴클레오티드 접합 항체 전략과 유사하게, TME를 연구하기 위해 발색, 형광, DNA 바코드 및 금속 동위원소 표지 항체 검출 시스템의 4가지 유형의 단백질 기반 멀티플렉스 플랫폼이 사용됩니다. 비용 효율적인 발색 IHC 플랫폼은 기존의 명시야 현미경을 사용하여 전체 슬라이드 시각화 및 병리학적 평가를 가능하게 합니다. 다중화된 IF 및 IHC에서는 형광단과 접합된 항체가 사용됩니다. 멀티플렉스 IF/IHC 플랫폼은 높은 특이성을 가진 항체를 검출하고 세포 내 수준에서도 표적 항체를 정량화할 수 있습니다 6,21. 또한 발색물질과 형광단의 특성으로 인해 하나의 항체 패널을 사용하여 단일 슬라이드에서 최대 10개의 바이오마커 발현을 캡처할 수 있습니다. 금속 동위원소 기반 플랫폼에서, 금속 태그된 항체는 단일 세포 및 공간 분해능으로 다중화 이미징을 수행하고, 개별 조직 절편에 대해 높은 감도를 나타내는데 사용된다22. 이론적으로 이러한 금속 접합 항체 접근법을 통해 단일 조직 섹션에서 100개 이상의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있습니다. 동위원소 표지 기술의 한 가지 과제는 100% 농축 순도에 도달하는 것을 방지하는 동중원소 간섭이다23. 또한 마커 수가 증가함에 따라 간섭이 증가합니다. DNA 접합 항체 검출 플랫폼은 고유한 DNA 바코드로 표지된 항체를 인식합니다. 40개 이상의 바이오마커가 이러한 플랫폼에서 높은 특이성으로 동시에 캡처될 수 있습니다6.
멀티플렉스 이미징은 DNA 결합 항체를 단일 조직 슬라이드에 한 번에 적용할 수 있는 상용 DNA 바코드 라벨 항체 검출 플랫폼입니다(그림 8). 조직 준비 단계의 경우, 제조업체에서 구입한 금 코팅 슬라이드를 사용해야 하는 다중화 이온빔 이미징 플랫폼과 달리 다중화 이미징 플랫폼은 조직이 염색 및 이미징 과정에서 조직을 온전하게 유지하기 위해 0.1% 폴리-L-라이신으로 코팅된 일반 커버슬립 또는 슬라이드만 필요합니다. 절편 후 4주 이내에 커버슬립에 조직 절편을 사용하는 것이 권장되며, 염색되지 않은 슬라이드를 장기간 보관하면 항원성이 감소합니다. 염색된 커버슬립 샘플은 염색 신호를 잃지 않고 최대 2주 동안 4°C의 보관 완충액에 보관할 수 있습니다. 커버슬립 샘플을 보관하는 데 특별한 장비가 필요하지 않습니다. 다중화 이미징 시스템은 커버슬립 대신 일반 슬라이드를 사용하도록 업그레이드되어 더 큰 조직을 염색하고 쉽게 다룰 수 있습니다. 항체 접합을 위해 환원 용액을 사용하는 경우(단계 3.2.3), 반응은 항체 손상을 방지하기 위해 30분 이하로 제한되어야 합니다. 5.6.6단계의 차단 버퍼는 새로 준비해야 하며 차단 버퍼를 다시 사용해서는 안 됩니다.
발색, 형광 및 금속 동위원소 표지 다중화 항체 검출 플랫폼과 비교할 때 다중화 이미징 기술에는 특정 장점이 있습니다. 예를 들어, 다중화 이미징을 위해 60개 이상의 사전 설계된 항체 패널이 상용화되어 있어 항체 접합 및 검증에 드는 시간과 비용을 절약할 수 있으며 사전 설계된 항체 패널의 수가 증가하고 있습니다. 암종 마커 범사이토케라틴, 흑색종 마커 SOX10, 혈관 마커 CD31, 기질 마커 SMA 및 수많은 면역 세포 마커를 포함하는 이러한 항체는 검증되고 실험 준비가 되어 있습니다. 사전 설계되지 않은 항체의 경우, 다중화 이미징과 함께 사용하도록 설계된 상용 접합 키트는 간단하고 사용자 친화적입니다. 고객 접합 항체는 4°C에서 보관할 때 1년 동안 유효합니다. 또한 이미지를 캡처하기 위해 기계 예열이 필요하지 않습니다. 이러한 다중화된 이미징 기술에서, 이미지 획득에서 반복적인 세척, 혼성화 및 스트리핑 단계는 마커 강도의 감소 또는 조직 형태 저하를 거의 초래하지 않는다 5,24,25. 또한 합성 이미지는 간단한 3색 형광 현미경을 사용하여 QPTIFF 형식으로 캡처되며 타사 디지털 분석 소프트웨어를 사용하여 업로드 및 분석할 수 있습니다. 염색 마커는 단일 세포 분해능으로 시각화할 수 있으며, 마커의 공동 국소화를 통해 세포 표현형을 특성화할 수 있습니다(그림 6 및 그림 7). 다중화된 이미지의 포괄적인 분석을 통해 조직 구획, 단일 세포 마커 정량화, 최근접 이웃 및 근접 데이터를 추가로 확인할 수 있습니다(그림 8).
다중화 이미지 분석의 과제는 세포 유형 식별입니다. 일반적으로 더 많은 단일 개체 분류자가 이미지에 적용되면 더 흔하지 않은 표현형에 주석이 추가됩니다. 따라서, 동일한 분류자에서 공동-발현되지 않는 공지된 마커를 사용하고, 단일 세포의 주석에 표현형 관련 분류자만을 적용하는 것이 권장된다. 세포 유형 주석의 변화는 세포 공간 분포 및 세포 이웃 분석의 차이와 같은 실질적으로 다른 공간 결과를 초래할 것입니다26,27.
멀티플렉스 이미지 분석은 FFPE 조직, 신선 냉동 조직, 보관된 전체 슬라이드 및 조직 마이크로어레이를 포함한 많은 샘플 유형을 염색하고 이미징하는 데 성공적인 것으로 입증되었습니다. 유방, 뇌, 폐, 비장, 신장, 림프절 및 피부 조직 절편의 다중화된 이미지는 심층 단일 세포 공간 표현형 데이터 5,16,25,28로 획득할 수 있습니다.
미래에는 다중화 이미징을 위해 미리 설계된 항체가 더 많이 나올 것으로 예상됩니다. 또한 다중화 이미지 분석을 위한 특정 소프트웨어의 개발이 절실히 필요합니다. 현재, Hi-Plex 이미지 분석을 위한 많은 상업적으로 이용 가능한 오픈 소스 소프트웨어 프로그램이 존재하지만29, 과학자들은 여전히 이러한 분석을 위한 표준 워크플로우를 만드는 데 도움이 필요하다(30,31). 이 프로토콜을 사용하여 캡처한 합성 이미지는 타사 소프트웨어와 호환되지만 사용자에게 추가 비용이 발생할 수 있습니다. 다중화 이미징 기술의 또 다른 단점은 반복적인 세척, 혼성화 및 대형 항체 패널과의 스트리핑 후 핵 단백질 검출의 신호 감소입니다. 다행스럽게도 리포터 플레이트를 설계할 때 초기 주기에서 바코드화된 형광단을 검색하면 이를 최소화할 수 있습니다. 최근에, 이 플랫폼은 새로운 고속 스캐닝 시스템으로 업그레이드되어, 합성 이미지(32)를 획득하는 시간을 극적으로 감소시켰다. 또한, 티라미드 접합 바코드를 사용하는 새로운 전략이 올리고뉴클레오티드 접합 항체 바코드 기반 이미징을 향상시키는 것으로 보고되었습니다. 이 기술은 바코드 접합 항체를 얻기 어려운 염색 신호를 증폭하는 것을 목표로 한다33.

종양 미세환경(TME)은 종양 세포, 종양 기질 세포, 면역 세포, 세포외 기질의 비세포 구성 요소 및 종양, 기질 및 면역 세포에 의해 생성 및 방출되는 수많은 풍부한 분자로 구성된 매우 이질적입니다 1,2. 축적된 증거는 TME가 종양 분화, 성장, 침윤, 전이 및 치료법에 대한 반응을 재프로그래밍하는 데 중추적인 역할을 한다는 것을 입증한다3.
TME의 다양한 세포 유형이 신호 네트워크를 통해 상호 작용하고 서로 통신하는 방법을 이해하는 것은 암 진단을 개선하고 면역 요법을 최적화하며 새로운 치료법을 개발하는 데 필수적입니다4. 면역조직화학(IHC) 및 면역형광법(IF)을 포함한 전통적인 조직 현미경 기술은 종양 샘플의 세포 유형, 풍부도 및 통신을 연구하기 위해 수십 년 동안 사용되어 왔습니다. 불행하게도, 이러한 기술은 전형적으로 조직 절편에서 하나 또는 두 개의 단백질 마커만을 평가할 수 있으며, 이들 세포사이의 복잡한 공간적 및 구조적 관계를 밝힐 수 없다 5,8,7.
지난 20 년 동안 여러 다중화 이미징 기술이 확립되었습니다8. 이러한 기술은 TME 내 면역 세포의 구성, 기능 및 위치에 대한 훨씬 향상된 관점을 제공하여 단일 세포 수준에서 복잡한 TME를 식별하고 공간적으로 프로파일링하는 능력의 급속한 발전으로 이어진다 9,10. TME에서 다양한 종양 및 면역 세포의 공간적 및 구조적 관계는 이제 이러한 다중화 이미징 기술을 사용하는 생물학적 및 임상 연구의 최전선에 있습니다11,12.
올리고뉴클레오티드-접합 항체 바코딩을 사용하여 최근에 개발된 다중화 이미징 기술은 포르말린 고정, 파라핀 포매(FFPE) 샘플13,14에서 올리고뉴클레오티드 접합 항체의 검출을 기반으로 하는 영향력 있는 단일 세포 생물학적 연구 플랫폼입니다. 현재, 이러한 다중화 이미징 기술은 단일 조직 섹션(15)에서 100개 이상의 마커의 동시 이미징을 가능하게 하며, 이는 현장에서 구별할 수 있는 세포 유형의 수를 증가시켰다. 이를 통해 종양 및 면역 세포에 대한 공간 분석이 가능해졌는데, 이는 전통적인 면역표현형 접근법으로는 불가능한 수준이다16.
여기에서 우리는 정제된 항체를 올리고뉴클레오티드에 접합하고 다중화 이미징 플랫폼과 FFPE 조직을 사용한 다중 사이클 이미징 절차를 사용하여 이 접합을 검증하기 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다. 또한 이 기술과 함께 사용되는 기본 이미지 처리 및 데이터 분석 절차에 대해 설명합니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10x AR9 Buffer</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>AR900250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Buffer</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>7000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Antibody Diluent/Block</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>ARD1001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Conjugation Kit</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>7000009</td>
			<td>Contains Filter Blocking Solution, Antibody Reduction Solution 1, Antibody Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution, Antibody Storage Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Reagent</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>7000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40718-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Avantor/VWR</td>
			<td>BDH1115-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G Blocker V2</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>240199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoclear</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-329-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Integral 10&#160;</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>ZRXQ010WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niknon Fluorescence microscope</td>
			<td>Keyence Corp. of America</td>
			<td>BZ-X810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Stain</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>7000003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoCycler Barcodes/Reporters Combination</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>5450004 (BX025/RX025)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5450003 (BX022/RX022)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5450023 (BX002/RX002)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;5250002 (BX020/RX020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2520003 (BX023/RX023)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5250005 (BX029/RX029)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5250007 (BX035/RX035)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5250012 (BX052/RX052)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5550012 (BX030/RX030)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5550015 (BX042/RX042)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5550014 (BX036/RX036)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuPath</td>
			<td>Open-Source</td>
			<td>https://qupath.github.io/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LC6065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Kit</td>
			<td>(Akoya Biosciences</td>
			<td>7000008</td>
			<td>Contains Hydration Buffer, N Blocker, J Blocker, S Blocker, Fixative Reagent, Storage Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed barcoding image analysis for immunoprofiling and spatial mapping characterization in the single-cell analysis of paraffin tissue samples

동일한 조직 절편에서 여러 에피토프를 순차적으로 검출하는 올리고뉴클레오티드와 함께 항체 바코드를 사용하는 멀티플렉스 이미징 기술은 종양 미세환경에 대한 이해를 높이는 효과적인 종양 평가 방법론입니다. 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직에서 단백질 발현의 시각화는 특정 형광단이 상보적인 올리고뉴클레오티드를 통해 항체 결합 바코드에 어닐링된 다음 샘플 이미징을 수행할 때 달성됩니다. 실제로, 이 방법은 단일 조직 염색 반응에서 40개 이상의 항체로 구성된 맞춤형 패널을 사용할 수 있습니다. 이 방법은 신선 냉동 조직, 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직, 배양 세포 및 말초 혈액 단핵 세포와 호환되므로 연구자들은 이 기술을 사용하여 단일 세포 분해능으로 다양한 샘플 유형을 볼 수 있습니다. 이 방법은 수동 염색 및 고정 프로토콜로 시작하며 모든 항체 바코드는 항체 칵테일을 사용하여 적용됩니다. 염색 유체 기기는 완전히 자동화되어 있으며 표준 형광 현미경을 사용하여 모든 바이오마커를 이미지화할 때까지 스펙트럼적으로 구별되는 형광단을 라벨링, 이미징 및 제거하는 반복적인 주기를 수행합니다. 그런 다음 모든 이미징 주기에 걸쳐 이미지를 수집하고 컴파일하여 모든 마커에 대한 단일 셀 해상도를 달성합니다. 단일 단계 염색 및 부드러운 형광단 제거를 통해 고도로 다중화된 바이오마커 분석이 가능할 뿐만 아니라 원하는 경우 추가 다운스트림 분석(예: 헤마톡실린 및 에오신 염색)을 위해 샘플을 보존할 수 있습니다. 또한 이미지 분석 소프트웨어는 이미지 처리(드리프트 보상, 배경 빼기, 세포 분할 및 클러스터링)뿐만 아니라 공간 네트워크 맵 생성을 위한 이미지 및 세포 표현형의 시각화 및 분석을 가능하게 합니다. 요약하면, 이 기술은 전산화된 미세유체 시스템과 형광 현미경을 사용하여 조직 결합, 올리고뉴클레오티드 접합 항체에 상보적인 형광 표지 DNA 프로브를 반복적으로 혼성화, 이미징 및 스트립합니다.

우리는 바코드 이미지 분석 시스템을 사용하여 FFPE 조직의 면역 상태를 설명하기 위해 FFPE 편도선 샘플을 사용하여 26개의 마커 면역 종양학 패널을 개발했습니다. 전반적으로, 19 항체는 현재 우리 실험실의 다른 다중 이미징 연구에 사용됩니다. 모든 마커는 발색 IHC가 있는 FFPE 조직을 사용하여 테스트되었습니다. 모든 항체는 독특한 DNA 올리고뉴클레오티드에 접합되었다. 이 바코드 이미지 분석 기술을 위해 웹 기반 기기 관리자(그림 4)를 사용하여 커버슬립을 설정할 때 첫 번째 주기와 마지막 주기는 항상 "비어 있음"(그림 2 및 그림 4)으로 항체의 특정 신호에서 배경 형광 신호를 뺄 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 형광 현미경으로 QPTIFF 형식의 이미지를 수집한 후 특허받은 여러 자동 이미지 분석 소프트웨어 또는 오픈 소스 소프트웨어 프로그램을 사용하여 시각화할 수 있습니다. 합성 이미지는 신호를 더 잘 볼 수 있도록 모든 마커 또는 선택한 마커를 표시할 수 있습니다(그림 5). 또한, 각각의 항체는 핵, 세포질, 또는 막 국소화에 대해 육안으로 평가될 수 있다. 면역, 종양 및 기질 세포를 쉽게 식별할 수 있습니다. 그 후, 이미지 분석을 통해 모든 마커의 신호 강도, 동적 범위 및 공간 분포에 대한 정보를 제공할 수 있습니다(그림 6). 이 기술을 통해 단일 조직 섹션의 세포 내 수준에서 26개의 마커를 모두 분석할 수 있었습니다(그림 7). 마커의 공동 국소화를 분석하여 세포 표현형을 식별하고, 공간 세포 위치를 파악하고, 세포 사이의 거리를 계산하고, 세포 분포를 찾을 수 있습니다. 이 기술의 결정적인 영향은 조직 미세 환경의 면역 상태에 초점을 맞춘 강력한 26 마커 패널의 제시입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig01.jpg"> 그림 1: Bis-Tris 단백질 젤을 사용한 맞춤형 접합 항체 검증 이미지. 겔의 레인 1은 단백질 표준을 나타낸다. 레인 2 및 레인 4는 바코드-접합 항체(화살표)를 나타낸다. 레인 3 및 레인 5는 비접합 항체(화살촉)로부터의 중쇄 및 경쇄 밴드를 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig02.jpg"> 그림 2: 두 개의 커버슬립 샘플에 대한 염색 플레이트 구성 맵. 약어: HB = 수화 완충액; B = 항체 희석제/블록; PSFS = 염색 후 정착액; PBS = 인산염 완충 식염수; MeOH = 메탄올; S = 스토리지 솔루션. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig03.jpg"> 그림 3: 리포터 플레이트 구성. 각 접합 항체에는 특정 리포터를 보완하는 바코드가 있습니다. 리포터 플레이트를 설정하려면 모든 접합 항체와 해당 리포터를 나열해야 합니다. 다음으로, 각 항체에는 사이클 번호가 할당됩니다. 2개의 블랭크 사이클(C1 및 C18)의 성능은 3개의 형광 채널에서 자가형광 수준을 평가하고 이미지 획득 제어 소프트웨어를 사용하여 이미징 후 배경 감산에 사용됩니다. 소프트웨어 마법사는 이 단계에서 계측기를 점검하여 모든 설정이 올바른지 확인합니다(그림 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig04.jpg"> 그림 4: 실험 설정을 위한 제어 소프트웨어를 사용한 이미지 획득. (A) 제어 소프트웨어의 왼쪽 하단 모서리에 있는 실험 탭을 선택하여 설정을 준비하고 시작합니다. (나,씨) 새 템플릿을 선택하여 새 프로젝트 및 실험 이름으로 실험 설정을 입력합니다. (D) 96-웰 리포터 플레이트에서 리포터 위치를 반영하기 위해 시작 사이클 웰 및 사이클 수를 변경한다. (E) 실험 실행을 위해 지정된 4개의 채널에 적절한 형광 채널을 할당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig05.jpg"> 그림 5: 웹 기반 소프트웨어(QuPath)를 사용한 이미지 시각화. 뷰어 창에는 염색된 편도선 조직 FFPE 섹션에 26개의 마커가 표시됩니다. Brightness & Contrast(밝기 및 대비 ) 창에는 확인 표시가 있는 마커가 표시됩니다. 마지막으로 뷰어 창에는 선택한 마커가 있는 FFPE 샘플이 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig06.jpg"> 그림 6: 웹 기반 소프트웨어를 사용한 이미지 시각화. (A) 26개의 마커에 대해 편도선 조직 절편을 염색하고 주석 및 검토를 위해 상용 디지털 슬라이드 뷰어 소프트웨어 또는 오픈 소스 소프트웨어(QuPath)를 사용하여 QPTIFF 형식의 절편 이미지를 시각화했습니다. (BF) 신호를 더 잘 볼 수 있도록 동일한 주석에 6개의 마커가 표시되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig07.jpg"> 그림 7: 웹 기반 소프트웨어에 사용되는 26개의 개별 마커 보기. 편도선 조직에서의 마커 발현은 면역 종양학 패널(왼쪽 상단)을 사용한 면역형광 염색을 통해 표시됩니다. 두 개의 작은 영역(빨간색 직사각형)에 개별 마커가 표시됩니다. 확대된 삽입물은 이러한 마커에 대해 양성인 셀을 표시합니다(흰색 화살표). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64758/64758fig08.jpg"> 그림 8: 다중화된 이미지 획득 워크플로 요약. FFPE 조직 절편은 26개의 항체 패널을 사용하여 염색한 후 다주기 반응을 일으켰습니다. 염색된 절편의 Raw 이미지를 전산적으로 처리하고, 합성 이미지를 이용하여 세포 밀도 및 공간 분석을 수행하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/64758fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: 편도선 조직에서의 IHC 검증. FFPE 조직 절편은 개별 항체를 사용하여 염색하였다. 편도선 조직의 마커 발현은 낮은 배율로 표시되며 확대된 삽입물은 마커에 대해 양성인 세포(빨간색 직사각형)를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64758/Suppl%20Figure.psd" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples at JoVE.c

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

다중화 바코드 이미지 분석은 최근 종양 미세 환경의 특성을 개선하여 세포 구성, 기능 상태 및 세포-세포 상호 작용에 대한 포괄적인 연구를 가능하게 했습니다. 본 명세서에서는 올리고뉴클레오티드 접합 항체의 바코딩을 사용하는 염색 및 이미징 프로토콜과 고차원 이미지 분석 기술을 사용할 수 있는 사이클 이미징을 설명합니다.

파라핀 조직 샘플의 단일 세포 분석에서 면역 프로파일링 및 공간 매핑 특성 분석을 위한 멀티플렉스 바코드 이미지 분석

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

다중 바코드 이미지 분석을 통해 얻은 대량의 생물학적 정보를 통해 과학자들은 종양 미세 환경과 종양 세포 내의 특수 분포를 더 잘 이해할 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 개별 세포의 더 깊은 표현형을 수행 할 수있는 가능성과 함께 동일한 조직 샘플에서 훨씬 더 자세한 정보를 제공한다는 것입니다. 이 방법을 통해 맞춤형 패널은 종양 미세 환경을 연구하여 새로운 표적 치료제로 사용할 암 조직에서 예측 바이오마커를 잠재적으로 발견할 수 있었습니다.올리고뉴클레오티드 접합 항체 염색을 시작하려면 커버 슬립을 0.1% Poly-L-Lysine 용액에 실온에서 24시간 동안 담가 조직 배치 및 부착을 준비합니다. Poly-L-Lysine 용액을 배출한 후 커버 슬립을 초순수로 30초 동안 세척합니다. 세탁 후 초순수에서 커버 슬립을 제거하고 보푸라기가 없는 수건에 올려 밤새 건조시킵니다.관심 조직의 5미크론 두께 부분을 Poly-L-Lysine으로 충전된 커버 슬립의 중앙에 놓고 밤새 건조시킵니다. 커버 슬립 홀더를 섭씨 60도의 오븐에서 밤새 예열합니다. 예열된 홀더에 조직 부분이 포함된 커버 슬립을 놓습니다.섭씨 60도에서 30분 동안 구운 후 파라핀이 조직에서 녹았는지 확인합니다. 샘플이 들어 있는 커버 슬립 홀더를 일련의 용액에 순차적으로 빠르게 배치합니다. 마지막으로 커버 슬립 홀더를 DEPC 처리된 초순수에 각각 5분씩 2회 동안 넣습니다.빈 피펫 팁 상자의 바닥에 물에 적신 종이 타월을 놓아 습도 챔버를 준비합니다. 압력솥에 50밀리리터 비커 높이의 절반을 덮을 만큼 물을 채웁니다. 섭씨 4도의 비커에 샘플당 5밀리리터의 메탄올을 넣습니다.필요한 부피의 AR9 완충액을 디에틸 피로카보네이트 또는 DEPC 처리된 초순수로 1X로 희석합니다. 다음으로, 50 밀리리터 유리 비커에 약 40 밀리리터의 희석된 AR9 완충액을 채운다. 비커의 커버 슬립 홀더에 샘플을 담그고 알루미늄 호일로 비커를 완전히 덮습니다.물이 채워진 압력솥에 알루미늄 호일로 덮인 비커를 넣고 약 15PSI에서 20분간 조리합니다. 그런 다음 비커를 제거하고 알루미늄 호일의 포장을 조심스럽게 풉니다. 비커를 실온에서 약 10분 동안 식히십시오.1X AR9 버퍼에서 커버 슬립 홀더를 제거합니다. DEPC 처리된 초순수에서 2분 동안 2회 배양합니다. 한편, 다중화 이미징 염색 키트에서 수화 완충액, 항체 희석제 및 차단 용액 N, G, J 및 S를 검색합니다.커버 슬립 샘플을 5밀리리터의 수화 완충액에 각각 2분 동안 두 번 놓습니다. 그런 다음 커버 슬립 샘플을 5 밀리리터의 멀티플렉스 이미징 항체 희석제 블록에 넣고 실온에서 20 내지 30 분 동안 인큐베이션한다. 배양하는 동안 항체 칵테일을 준비하십시오.배양 후 덮개 슬립을 미리 준비된 습도 챔버에 놓습니다. 190 마이크로리터의 항체 칵테일을 커버 슬립 샘플 상에 피펫팅하고, 실온에서 3시간 동안 인큐베이션한다. 다음에, 샘플을 2분 동안 5 밀리리터의 멀티플렉스 이미징 항체 희석제 블록으로 각각 2회 세척한다.결합된 항체를 조직에 고정하기 위해 커버 슬립을 1.6%로 희석한 16% 포름알데히드에 10분 동안 보관 용액으로 배양하고 PBS로 3회 세척합니다. 커버슬립을 메탄올에서 5분 동안 배양한 후, 섭씨 4도로 미리 냉각한다. 세척 후, 커버 슬립을 PBS로 희석된 5 밀리리터의 고정제 시약에 다시 20분 동안 인큐베이션하고, 보관하기 전에 PBS로 3회 세척한다.텍스트에 언급된 구성에 따라 리포터 마스터 믹스를 준비합니다. 96웰 플레이트의 웰을 리포터 마스터 믹스와 해당 실험 주기에 대한 특정 바코드 형광단이 포함된 245마이크로리터의 용액으로 채웁니다. 그림은 암종 패널에 사용된 리포터 플레이트 구성을 보여줍니다.바코드가 부착된 형광단을 보호하려면 96웰 리포터 플레이트 위에 호일 플레이트 덮개를 부착하고 플레이트를 멀티플렉스 이미징 기기 내에 배치합니다. 현미경 스테이지에 샘플 커버 슬립을 놓고 핵 염색 용액의 1:1500 적정 700마이크로리터를 조직에 수동으로 피펫팅하여 DAPI 채널을 사용하여 이미징의 초점을 보정합니다. 다중화 이미징 기기를 준비하려면 DEPC 처리된 초순수를 사용하여 10X 다중화 이미징 버퍼를 1X로 희석하고 시약 병에 적절한 용액이나 용매를 채웁니다.모든 현미경 매개변수를 설정하고 이미지화할 샘플 커버 슬립에서 관심 영역을 선택합니다. Instrument Manager 소프트웨어에 실험 설계를 입력합니다. 제어 소프트웨어에서 실험 버튼을 클릭하고 실험 설정 및 관리 창에서 새 템플릿 버튼을 클릭합니다.프로젝트 단추 옆의 공간에 프로젝트 이름을 입력하고 총 주기 수를 입력합니다. 채널 지정 버튼을 클릭하고 각 주기에 대한 올바른 주기, 웰 번호, Z 스택 위치, 마커 이름, 클래스 및 노출 시간과 같은 각 주기에 대한 정보를 열에 입력합니다. 그런 다음 실험 시작을 클릭하여 실험을 시작하고 실험을 저장합니다.컴퓨터에서 QuPath 아이콘을 클릭하고 소프트웨어를 엽니다. qptiff 파일을 뷰어 창으로 끕니다. 밝기 및 대비 버튼을 클릭하여 밝기 대비 창을 엽니다.선택한 열에서 마커를 선택하거나 선택 취소하여 마커 신호를 표시하거나 숨깁니다. zoom to fit 버튼을 클릭하여 관심 영역을 확대 또는 축소합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 볼 때 합성 이미지는 원하는 대로 모든 마커 또는 선택된 마커를 표시했습니다.모든 마커의 신호 강도, 동적 범위 및 공간 분포가 밝혀졌습니다. 이 기술을 사용하면 단일 조직 섹션에서 세포 내 수준에서 26 개의 마커를 모두 분석 할 수있었습니다. 다중화 이미지 분석 과정에 이어 정보학적 접근을 통해 고차원 단세포 데이터를 처리 및 분석하여 생물학적 및 임상적 통찰력을 추론할 수 있습니다.멀티플렉싱 바코드 이미지 분석은 과학자들이 종양 조직을 프로파일링하고 패널의 마커에 따라 연구 질문에 답할 수 있도록 하는 강력한 방법론입니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

소변 샘플에서 셀 무료 DNA 무결성 분석

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

연구

암 연구학

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

pT3N0M0 위암 조직의 파라핀 내장 슬라이드에 탄성 염색

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

신호 분석 및 바이오 마커 발견 하는 단일 셀에 대 한 형광 셀 바코드와 인 Cytometry

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

대장암세포의 3차원 스페로이드 배양에서 프로바이오틱스의 세포없는 슈퍼네탄을 사용하여 세포 사멸 평가

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

전사 분석을 사용하여 무질서한 온코겐 전사 요인의 구조 기능 관계 매핑

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

4T1 유방암 모델에서 폐 전이의 정량화를 개선하기 위해 컴퓨터 기반 이미지 분석을 사용하여

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

성인형 미만성 침윤성 신경교종의 미세환경 특성화를 위한 디지털 공간 프로파일링

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

포르말린 고정 및 파라핀 임베디드 조직 샘플의 질량 분광법 이미징을 사용하여 종양 미세 환경에 대한 이해 확대

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...